余學成，高增祥，吳 斌，涂濟源，2，陳林霖，曹國勝，2＊＊

（1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心 武漢 430065）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種常見的、慢性的、非特異性的炎癥性疾病，任何年齡均可發(fā)病，多見于年輕群體，其病因尚不明確，在臨床上，常表現(xiàn)為血性腹瀉、便血等癥狀[1-3]。其發(fā)病機制復(fù)雜，遺傳、免疫失調(diào)、腸道菌群失調(diào)、環(huán)境等是目前普遍認為的誘發(fā)因素[4]。近年來，全球的UC 發(fā)病率一直在上升[5]。目前臨床上有氨基水楊酸類、皮質(zhì)固醇類和免疫調(diào)節(jié)劑類等作為治療UC 的常用藥物，但其副作用明顯且易復(fù)發(fā)[6-7]。近年來，隨著中醫(yī)藥在治療UC 方面取得了巨大的進展，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論出發(fā)，尋找安全有效的治療UC的藥物顯得十分迫切。

根據(jù)UC 臨床表現(xiàn)，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學理論中，把UC歸屬于“泄瀉”、“腸風”以及“痢疾”等范疇，認為UC的發(fā)生是由脾失健運、濕熱蘊腸所致[8]，故圍繞健脾益氣、祛濕止瀉為治療UC 的基本法則。而白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效[9]，現(xiàn)代研究也表明白術(shù)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用，對不明原因的腸炎也具有較好的療效[10]。臨床上通過常規(guī)治療手段聯(lián)合應(yīng)用白術(shù)治療效果顯著，其可明顯改善患者的臨床癥狀[11-12]。白術(shù)的主要活性成分之一白術(shù)多糖（Atractylodes Macrocephala Polysaccharides，AMP）可以改善潰瘍性結(jié)腸炎，其治療效果與調(diào)節(jié)腸道菌群組成、糞便代謝和血漿代謝的能力有關(guān)[13]。另一主要活性成分之一白術(shù)內(nèi)酯III 可通過維持線粒體功能來減弱UC發(fā)展進程中的上皮屏障的破壞[14]。因此，推測白術(shù)對UC 具有較好的改善作用，但其治療UC 的潛在分子機制尚未完全清楚，有待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是多交叉學科，以系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度為出發(fā)點闡釋藥物作用、疾病機制的新興學科，其通過探索疾病與藥物之間的分子關(guān)聯(lián)，從而揭示藥物作用于人體多靶點，多層次的機理[15-17]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學角度，從中藥多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點出發(fā)，為系統(tǒng)闡明中藥治療UC 等復(fù)雜疾病的分子機制提供了研究策略[18]。本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接技術(shù)及體內(nèi)實驗驗證系統(tǒng)性分析白術(shù)治療UC 的作用機制，為臨床應(yīng)用白術(shù)等健脾燥濕中藥治療UC疾病提供實驗依據(jù)和思路借鑒。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學

1.1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫的整理

將本文所使用的數(shù)據(jù)庫及軟件進行了相關(guān)整理，見表1。

1.1.2 白術(shù)活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCM-ID數(shù)據(jù)庫的檢索，以及查閱相關(guān)文獻[19-20]，去重后以口服生物利用度（Oral bioavail-ability，OB≥30%）和類藥性（Drug likeness，DL≥0.05）為條件[21]獲取并篩選白術(shù)的有效活性成分信息。

1.1.3 藥物活性成分的靶點篩選

應(yīng)用Swiss 數(shù)據(jù)庫進行藥物活性成分的靶點篩選，選取Probability>0 的靶點。有部分活性成分靶點在Swiss 數(shù)據(jù)庫中未找到，將其靶點通過Batman-TCM數(shù)據(jù)庫進行補充。

1.1.4 疾病靶點的收集、共同靶點的獲取以及網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中搜索，收集UC 疾病的相關(guān)靶點。將疾病與藥物靶點取交集，并利用Venny2.1.0 進行交集分析并構(gòu)建韋恩圖。將通過上述步驟得到的相關(guān)靶點、藥物、活性成分、疾病進行整理后導(dǎo)入到Cytoscape 中構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述疾病與藥物的共同靶點導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫中，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，其他均為默認條件，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件中，通過軟件插件Centiscape 2.2 進行核心靶點的篩選。以插件中的Degree、Closeness、Betweenness 三個參數(shù)進行核心靶點篩選，選取大于三個參數(shù)值的靶點，進行篩選2次，最終得到核心靶點。將核心靶點導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫中，默認條件，再將得到的網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，得到最終的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.6 GO功能富集分析和KEGG信號通路注釋分析

將1.1.5中最終篩選得到的核心靶點導(dǎo)入到David數(shù)據(jù)庫中，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：物種選擇為“Homo sapiens”，列表類型設(shè)置為“gene list”，標識符選擇“official gene symbol”，之后進行GO 功能富集分析與KEGG 信號通路注釋分析，前者選擇P值排名前10 的進行氣泡圖的繪制，后者選取P 值排名前20 的進行氣泡圖的繪制。

1.1.7 通路靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將KEGG 信號通路注釋分析結(jié)果中的基因、通路數(shù)據(jù)以及活性成分進行整理，導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中進行，構(gòu)建“通路-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.8 活性成分與靶點蛋白的分子對接

應(yīng)用分子對接軟件Autodock 進行分子對接，在UniProt數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)靶點的“Entry”，再以獲取的具體“Entry”為關(guān)鍵詞在PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索從其中選取相關(guān)蛋白并下載其Pdb 結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入到Pymol2.5 軟件中刪除所有水分子和多余的小分子配體。在Pubchem 數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分的3D 結(jié)構(gòu)文件，并應(yīng)用Open Babel GUI 軟件將其轉(zhuǎn)為mol2 格式。將處理好的蛋白與活性成分導(dǎo)入Autodock Tool 1.5.7軟件轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，之后使用Autodock Vina 1.1.2軟件進行兩兩分子對接，并計算出結(jié)合能（kcal/mol）。最后，利用Pymol2.5軟件進行可視化。

1.2 驗證性實驗

1.2.1 實驗試劑及藥物

無水乙醇（批號20180904），購自國藥集團化學試劑有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP）（批號09220718），購買自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；人尿素糞便隱血試劑盒（批號20221104），購自南京建成科技有限公司；通用型組織固定液（批號G1101），購自武漢賽維爾生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS，批號160110），購自美國MP Biomedicals 公司；IL-1β（博奧森，bs-0812r），濃度為1/200；TNF-α（三鷹，60291-1-ig），濃度為1/200；白術(shù)（生產(chǎn)批號20220101），產(chǎn)地浙江，購自湖北天濟藥業(yè)有限公司，由湖北中醫(yī)藥大學藥學院余坤教授鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala koidz.的根莖。

1.2.2 動物

SPF級BALB/c 小鼠32只，雄性，體質(zhì)量20±2 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2022-0001。小鼠在清潔環(huán)境中進行飼養(yǎng)，不限制飲水和進食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22±2℃，濕度為55%±5%，光照環(huán)境和黑暗環(huán)境各交替循環(huán)12 h，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 儀器

電子天平（CPA225D），購自美國梅特勒-托利儀器有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA），購自上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機（LGJ-12N），上海華璽科學儀器有限公司；粉碎機（DFY-800C），購自溫嶺市大機械有限公司；其他的小型儀器，如燒杯、鑷子、剪刀等。

1.2.4 實驗藥物制備

（1）DSS 溶液的制備：將稱量的3.5 g DSS 試劑溶解與純水中，配制成3.5%的DSS溶液。

（2）白術(shù)醇提物的制備：稱取25 g 白術(shù)，打粉機將進行粉碎，所得粉末過2號篩，從中取20 g白術(shù)粉末置于燒杯中，加十倍量80%乙醇浸泡過夜。次日將其超聲提取3 次（每次操作均相同），每次30 min，后將3 次所得濾液合并，并將其旋蒸（50℃，40 r·min-1）至濃膏狀。將所得樣品在-80℃條件下過夜，次日冷凍干燥，后置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）柳氮磺吡啶腸溶片（SASP）混懸液制備：在研缽中將SASP 片劑研磨至極細粉末后配制成濃度為250 mg·10 mL-1的混懸液。將其分裝，4℃冷藏備用。

1.2.5 動物分組、造模以及給藥

將32 只老鼠隨機分為4 組，分別是空白組（Control）、模型組（Model）、白術(shù)組（BZ）和陽性藥組（SASP），每組各8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天，第1 天起，小鼠自由飲用3.5% DSS溶液，每2天更換新制的DSS溶液。第2 天起，各組分別給藥，空白組，模型組均灌胃生理鹽水，白術(shù)組組灌胃白術(shù)醇提物，參考《中國藥典》規(guī)定：白術(shù)用量6-12 g。此實驗按成人白術(shù)9 g·60 kg-1給藥，考慮小鼠與人劑換算系數(shù)12.3，則白術(shù)劑量為1845 mg·kg-1·d-1。陽性藥組灌胃柳氮磺吡啶（SASP），劑量為250 mg·kg-1·d-1。各組按1 mL·100 g-1給藥，連續(xù)給藥7天[22]。

1.2.6 檢測各組小鼠DAI評分和結(jié)腸長度變化

自實驗開始第1天起，每天在相同時間段內(nèi)，對小鼠進行稱量并記錄鼠體質(zhì)量，觀察小鼠大便形狀及便血情況并進行記錄，小鼠大便隱血情況按照隱血試劑盒說明書的方法進行測定，參考相關(guān)文獻并計算DAI評分，DAI評分標準如表2所示，計算公式為：DAI評分=體質(zhì)量變化評分+大便性狀評分+隱血或便血評分。末次給藥后處死小鼠，取出小鼠結(jié)腸并用直尺測量其自然長度，記錄并拍照。

表2 DAI評分表

1.2.7 HE染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理學變化

取小鼠結(jié)腸組織，多聚甲醛進行固定，脫水，石蠟包埋，切片，置于載玻片上，進行HE 染色。光學顯微鏡下對結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、杯狀細胞、絨毛排列及炎性細胞浸潤等組織病理學變化情況進行觀察并拍照。HE染色病理學評分標準：①炎性損傷程度：無炎性反應(yīng)，0分；輕度炎性反應(yīng)，1分；重度炎性反應(yīng)，2分。②病變損傷深度：無病變，0分；病變侵及黏膜下層，1分；病變侵及肌層，2分；病變侵及漿膜層，3分。③隱窩損傷程度：無損傷，0分；基底1/3隱窩被破壞，1分；基底2/3隱窩被破壞，3分；全部隱窩和上皮被破壞，4分。計算公式：病理學評分=炎性反應(yīng)+病變深度+隱窩損傷。

1.2.8 AB-PAS 染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞數(shù)目

取小鼠結(jié)腸組織石蠟塊，切片，置于載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，先后用阿利新藍染色液染色、過碘酸溶液浸泡，并加入Schiff 試劑反應(yīng)，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后封片。光學顯微鏡下進行鏡檢，呈現(xiàn)藍色的為酸性黏液質(zhì)，呈現(xiàn)紅色的為糖原和中性黏液質(zhì)。

1.2.9 免疫組織化學法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達的變化

免疫組織化學法如下：取各組小鼠結(jié)腸組織石蠟塊，切片，置于載玻片上，脫蠟后進行抗原修復(fù)，4℃條件下孵育一抗和二抗，細胞核用蘇木素復(fù)染，經(jīng)梯度乙醇脫水后，封片。光學顯微鏡下鏡檢，其中細胞核呈藍色，相應(yīng)炎癥因子的陽性表達呈棕黃色。

1.2.10 統(tǒng)計學處理方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件對本次數(shù)據(jù)的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計量資料用均值±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩組組間比較采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果

通過數(shù)據(jù)庫及文獻查閱篩選，其中有20個活性成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到，16 個由TCM-ID 數(shù)據(jù)庫及查閱文獻得到，經(jīng)去重后共得到30 個活性成分（見表3）。

表3 活性成分信息表

2.2 白術(shù)治療UC的潛在靶點預(yù)測以及網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選出白術(shù)活性成分的“Canonical SMILES”結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置條件為Probability>0，未在該數(shù)據(jù)庫中找到靶點的活性成分用Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫進行補充，得到相應(yīng)靶點591 個。再以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫進行疾病靶點的檢索，得到靶點5139個。

將白術(shù)的預(yù)測作用靶點及潰瘍性結(jié)腸炎疾病的靶點導(dǎo)入Venny2.1.0，取兩者交集，得白術(shù)和潰瘍性結(jié)腸炎共同靶點308 個，藍色部分為白術(shù)活性成分相關(guān)靶點，黃色部分為UC相關(guān)靶點，見圖1A。

圖1 白術(shù)治療UC的潛在靶點預(yù)測以及網(wǎng)絡(luò)圖PPI的構(gòu)建

將所得靶點、信息進行整理，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制“藥物-疾病-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1B。其有338 個節(jié)點，1206 條邊。圖中深紅色節(jié)點（菱形）為白術(shù)和疾??；淺紅色（倒三角形）為活性成分；淺黃色（圓形）為靶點。

將白術(shù)和潰瘍性結(jié)腸炎共同交集的308個靶點基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，獲取得到相應(yīng)的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制靶點蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，共得308 個節(jié)點，4950 條邊。因其節(jié)點過多，故運用Cytoscape 3.7.2 軟件插件Centiscape 2.2 進行核心靶點的篩選。將篩選得到的22 個核心靶點再次導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，下載其Tsv 文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其有22 個節(jié)點，227 條邊。根據(jù)度值的大小來設(shè)定節(jié)點的大小以及顏色，顏色越深、大小越大，度值越大。結(jié)果所示IL-1B、TNF、AKT1、MAPK3 等為排名靠前的靶點，結(jié)果見圖1C。圖中外圈顏色較深，說明靶點度值較大，內(nèi)圈為黃色和藍色，顏色較淺，說明靶點度值較小，其中藍色靶點的度值最低。

2.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析

運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對白術(shù)作用于UC 疾病中的22 個核心靶點進行生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細胞組分（Cellular component，CC）等分析。通過GO 分析得到322 條BP 程條目，38 條MF 條目，33 條CC 條目。分別根據(jù)P值進行排序，對各富集結(jié)果排名前10 的條目進行可視化，見圖2。

圖2 GO功能富集分析

再通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對22 個核心靶點進行KEGG通路富集分析得到145條通路，根據(jù)P值進行排序，顯著性最大的前20 條通路見圖3。除去不相關(guān)的廣譜通路，可知白術(shù)治療UC 的主要信號通路涉及表皮生長因子受體信號通路（EGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.4 白術(shù)“藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將白術(shù)活性成分、排名前20的通路及富集其上的靶點進行整理，將整理好的文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中進行網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，結(jié)果見圖4，其有68 個節(jié)點，290 條邊。圖中綠色（倒三角形）代表白術(shù)防治潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)通路，橙色（三角形）代表白術(shù)的活性成分，粉紅色（圓形）代表白術(shù)防治潰瘍性結(jié)腸炎作用靶點。兩者間的對應(yīng)關(guān)系由各節(jié)點之間的連線代表。其表明白術(shù)可能通過多成分，多靶點，多信號通路來起到防治潰瘍性結(jié)腸炎的作用（見表3）。

圖4 藥物活性成分-對應(yīng)靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對接驗證

白術(shù)內(nèi)酯I、II、III 雖然在上述活性成分排名中較為靠后，但白術(shù)內(nèi)酯類成分作為白術(shù)的主要活性成分，有大量文章報道其具有很好的抗炎活性[23-24]，故將這3種活性成分也納入核心成分進行分子對接?；诖?，選擇BZ10、BZ11、BZ12、BZ15、BZ16、BZ17 共6 個活性成分和排名靠前的白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）兩個靶點進行兩兩分子對接驗證。結(jié)合能越小代表結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1表示具有結(jié)合能力，結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1表示結(jié)合能力較強[25]。白術(shù)6 個活性成分與IL-1β、TNF-α 的分子對接示意圖，如圖5 所示。分子對接結(jié)果顯示白術(shù)6 個活性成分與IL-1β、TNF-α 兩個靶點均具有較好的結(jié)合能力（均小于-5.0 kcal·mol-1），提示白術(shù)改善UC 可能有抑制相關(guān)炎癥因子的釋放有關(guān)，但需要進行實驗驗證。

圖5 關(guān)鍵活性成分與靶點的對接及結(jié)合能模式圖

2.6 體內(nèi)實驗驗證結(jié)果

2.6.1 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸長度、小鼠DAI 評分的影響

在對動物進行取材的過程中發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道與其他組小鼠腸道相比出血較明顯，有明顯的潰瘍癥狀，腸道內(nèi)糞便呈稀樣，異味明顯，腸道彈性較差，白術(shù)組（BZ）和SASP 組的小鼠腸道的狀況則有明顯改善，空白組腸道狀況正常。由圖6A、6B 所示空白組與模型組相比較，模型組結(jié)腸長度明顯減少（P<0.01）；和模型組相比，白術(shù)組（BZ）和SASP 組小鼠的結(jié)腸長度均有所增加（P<0.01）。由圖6C 所示空白組和模型組相比，模型組DAI評分顯著增加（P<0.01），可知實驗造模成功，和模型組相比較，白術(shù)組（BZ）與陽性藥組的DAI評分均有所降低（P<0.01）。

圖6 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸長度、小鼠DAI評分的影響

2.6.2 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸組織病理學變化及杯狀細胞數(shù)目的影響

如圖7A 所示，細胞核呈藍紫色，細胞質(zhì)呈粉紅色。HE 染色結(jié)果顯示，和空白組（Control）相比，模型組（Model）結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，炎性浸潤明顯，黏膜水腫明顯，上皮細胞損傷嚴重。和模型組相比，白術(shù)組（BZ）和SASP 組的結(jié)腸組織病理狀態(tài)改善明顯，粘膜上皮細胞排列較為緊密，炎性浸潤減輕。圖7B為病理學評分的統(tǒng)計圖，統(tǒng)計結(jié)果與HE 染色結(jié)果的趨勢一致。

圖7 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學變化及杯狀細胞數(shù)目的影響

如圖7C所示，糖元、中性粘液物質(zhì)呈紅色，酸性粘液呈藍色。AB-PAS 染色結(jié)果顯示，和空白組相比，模型組結(jié)腸組織中杯狀細胞個數(shù)明顯減少，和模型組相比較，白術(shù)組（BZ）、SASP 組的顏色有所加深，染色陽性細胞有所增加。結(jié)果表明白術(shù)給藥治療后可明顯增加UC小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞的個數(shù)。

2.6.3 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸組織中關(guān)鍵靶點IL-1β、TNF-α表達的影響

由圖8 所示，棕褐色代表陽性，藍色代表細胞核。免疫組化檢測結(jié)果顯示，相比較于空白組，模型組小鼠結(jié)腸組織中炎性因子IL-1β 及TNF-α 陽性表達有所增加；而相比較于模型組，白術(shù)組（BZ）、陽性藥柳氮磺吡啶（SASP）組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β 及TNF-α 陽性表達有所減少，且IL-1β 陽性表達減少更為明顯。研究結(jié)果表明，白術(shù)可通過抑制UC 小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α 等炎癥因子的表達減緩炎癥反應(yīng)的發(fā)生來改善UC損傷。

圖8 白術(shù)對各組小鼠結(jié)腸組織中關(guān)鍵靶點IL-1β、TNF-α表達的影響（IHC，×100）

3 討論

UC 易復(fù)發(fā)，且發(fā)病率逐年上升，給醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)[26]。因其嚴重影響患者的生活質(zhì)量，世界衛(wèi)生組織將其確定為現(xiàn)代難治性疾病之一[27]。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為濕熱內(nèi)蘊是UC 的主要發(fā)病機制，多與脾氣受損、濕滯日久等因素有關(guān)[28]，而白術(shù)歸脾、胃二經(jīng)，具有健脾燥濕的功效，自古以來白術(shù)就被歷代醫(yī)者用于治療脾胃相關(guān)疾病[29]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選出白術(shù)19 個有效活性成分，443個作用靶點以及225個藥物與疾病交集靶點。研究表明，白術(shù)內(nèi)酯類成分、揮發(fā)油及白術(shù)多糖等是白術(shù)的主要活性成分，并被證實有廣泛的藥理作用[30-31]。其中，白術(shù)內(nèi)酯I、II 均有良好的抗炎、抗氧化作用[32-33]。此外，白術(shù)內(nèi)酯III 可通過調(diào)節(jié)自噬水平清除過氧化物減輕小鼠UC 損傷[34]。白術(shù)揮發(fā)油對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長均有抑制作用[35]。另外，白術(shù)多糖還可減輕機體炎癥反應(yīng)，改善類風濕性關(guān)節(jié)炎，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路的活化有關(guān)[36]。大量研究表明，出自《太平惠民和劑局方》的參苓白術(shù)散被常用于治療脾胃氣虛、濕阻氣滯證，針對UC 疾病具有良好的療效[37-38]，因此，推測白術(shù)對潰瘍性結(jié)腸炎的治療有很好的效果。體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明，白術(shù)醇提物組可明顯增加UC 小鼠的結(jié)腸長度，降低DAI 評分，還可以改善UC 小鼠結(jié)腸組織病變程度，增加小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞的個數(shù)，這均提示白術(shù)對UC小鼠具有較好的療效。

白術(shù)作用靶點間的協(xié)調(diào)促進和抑制可能會增加結(jié)腸上皮細胞的癌癥風險，并加速轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)復(fù)雜疾病表型的新型功能模塊或協(xié)同模塊組合[39]。本研究篩選出的核心靶點主要有IL-1B、TNF、MAPK3、AKT1 等。研究表明，在UC的炎癥反應(yīng)過程中，TNF-α是促使UC發(fā)生與發(fā)展的炎癥啟動因子，其是導(dǎo)致腸黏膜損害以及微循環(huán)障礙的重要因素[40]。TNF-α炎癥因子主要通過對中性粒細胞趨化作用，對腸黏膜組織細胞進行浸潤，從而導(dǎo)致炎癥損傷[41]。炎癥因子IL-1β可增強炎癥損傷，使UC 病情加重[42]。因此，選擇TNF-α 及IL-1β 兩個關(guān)鍵靶點進行了體內(nèi)驗證實驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)白術(shù)可使UC小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β表達情況下降，從而減輕機體炎癥反應(yīng)發(fā)揮對UC的改善作用。

綜上，白術(shù)可通過減少TNF-α、IL-1β在結(jié)腸組織中的表達量來抑制UC 小鼠的炎癥反應(yīng)，從而改善UC的癥狀。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)角度，并進行了體內(nèi)動物實驗進行初步驗證。此外，本研究存在一定的局限性，比如實驗驗證的方法較為單一，未對預(yù)測得到的其他信號通路展開實驗驗證，但在某種程度上為臨床應(yīng)用健脾燥濕等中藥治療UC 提供了實驗依據(jù)與思路借鑒[43]。