仝佳祥，陳 楊，李 璇，朱梓強(qiáng)，宿樹(shù)蘭，郭 盛，康宏杰，段金廒，朱 悅＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023；2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心 銀川 750000）

枸杞葉為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）與枸杞（L.chinenseMill.）的嫩莖葉，其藥用記載始見(jiàn)于南朝宋《名醫(yī)別錄》“冬采根，春、夏采葉，秋采莖實(shí)”[1]。唐·孫思邈《備急千金要方》將其功效概括為“補(bǔ)虛羸，益精髓”[2]。五代《藥性論》記載“子葉同說(shuō)，味甘平。補(bǔ)益精，諸不足”，認(rèn)為其功效與枸杞子類(lèi)似[3]，《日華子本草》進(jìn)一步描述其具有“除煩益志”“壯心氣”功效[4]?，F(xiàn)代《中藥大詞典》及《中華本草》將其功效總結(jié)為“補(bǔ)虛益精，清熱明目”[5-6]。

現(xiàn)代研究表明，枸杞葉富含黃酮類(lèi)[7]、酚酸類(lèi)[8]、多糖類(lèi)及生物堿類(lèi)成分[9-10]，其活性成分種類(lèi)與枸杞子相似，而黃酮類(lèi)成分含量甚至超過(guò)枸杞子[11]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉具有抗氧化[12]、抗疲勞[13]，調(diào)節(jié)血糖血脂[14-15]、神經(jīng)保護(hù)[16]、抗腫瘤等生物活性[17]，是具有高度開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的藥食兩用資源。為了深入挖掘其資源利用價(jià)值，基于其“補(bǔ)虛益精”的傳統(tǒng)功效，構(gòu)建D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型，評(píng)價(jià)枸杞葉對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響并探索效應(yīng)部位與作用機(jī)制，為枸杞葉資源化利用與相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)使用SPF 級(jí)，體質(zhì)量為25-30 g 的雄性ICR小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（滬）2022-0004。本實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（202211A006）。

1.2 藥物

枸杞葉（Lycium barbarumleaves，批號(hào)：2208153）采購(gòu)自寧夏明德中藥飲片有限公司，經(jīng)過(guò)段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.3 試劑

多奈哌齊（E120086）購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；凝膠制備試劑盒（PG112）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑（Cocktail，HY-K0011）購(gòu)自MCE 公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（AF2132-A）、小鼠γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（AF2182-A）、小鼠白介素10（IL-10）ELISA 試劑盒（AF2176-A）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（AF2040-A）、小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）ELISA 試劑盒（AF2204-A）、小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）ELISA 試劑盒（AF2147-A）、小鼠膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）ELISA 試劑盒（AF2110-A）購(gòu)自湖南艾方生物科技有限公司；還原性谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（A006-2-1）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（A003-1-2）、小鼠超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（A001-3-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（A112-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；抗體Caspase-9（Mouse mAb 9508S）、Nrf2（Rabbit mAb 12721S）購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）公司；抗體Caspase-3（66470-2-lg）、HO-1（10701-1-AP）、β-actin（66009-1-lg）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司；二抗HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)（BA1054）、HRP Conjugated AffiniPure Goat Antimouse IgG (H+L)（BA1050）購(gòu)自BOSTER公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）；微孔板恒溫振蕩器（ST60-4，Thermo 公司）；高速冷凍離心機(jī)（D1524R，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器公司）；多功能酶標(biāo)儀（Enspire，Perkin-Elmer 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocTMXRS+Imaging System，Bio-Rad 公司）；干式恒溫金屬浴（SBH130D，STUART 公司）；熒光倒置顯微鏡（AXIO Vert.A1，Zeiss公司）。

2 方法

2.1 枸杞葉提取部位的制備

取枸杞葉500 g，加入10 倍量水，進(jìn)行兩次回流提取，微沸計(jì)時(shí)提取2 h，將兩次提取后的濾液合并后過(guò)濾濃縮，然后將濃縮液放入凍干機(jī)，得到枸杞葉水提部位（ST）；按上述操作及圖1 樣品制備流程圖依次制備枸杞葉75%乙醇提取部位（CT）、80%醇沉上清部位（SQ）及80%醇沉沉淀部位（CD），經(jīng)計(jì)算求得枸杞葉水提部位（ST）得率為31.23%、枸杞葉75%乙醇提取部位（CT）得率為21.71%、80%醇沉上清部位（SQ）得率為17.68%、80%醇沉沉淀部位（CD）得率為15.75%。

圖1 枸杞葉不同溶劑提取部位制備流程圖

圖2 各組小鼠Y迷宮運(yùn)動(dòng)軌跡圖

2.2 D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型構(gòu)建、分組及給藥

將100 只雄性ICR 小鼠隨機(jī)設(shè)置為空白組、模型組、枸杞葉水提物低劑量組（ST-L）、枸杞葉水提物高劑量組（ST-H）、枸杞葉75%醇提物低劑量組（CT-L）、枸杞葉75%醇提物高劑量組（CT-H）、枸杞葉水提80%醇沉上清低劑量組（SQ-L）、枸杞葉水提80%醇沉上清高劑量組（SQ-H）、枸杞葉水提80%醇沉沉淀低劑量組（CD-L）、枸杞葉水提80%醇沉沉淀高劑量組（CD-H）以及陽(yáng)性藥組多奈哌齊（Donepezil），除空白組10 只外，其余每組9 只。除空白組外，其余組通過(guò)頸背部皮下注射D-半乳糖（500 mg·kg-1·d-1）8 周建立亞急性衰老小鼠模型。D-半乳糖（500 mg·kg-1·d-1）通過(guò)0.9%生理鹽水配制濃度為50 mg·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1，造模8 周動(dòng)物出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶損傷后進(jìn)行灌胃給藥。枸杞葉根據(jù)《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中人用每日生藥量15 g，通過(guò)人與小鼠體表面積換算系數(shù)得到小鼠給藥劑量，其中低劑量組劑量（2.25 g·kg-1）根據(jù)枸杞葉人用日常劑量設(shè)置、高劑量組劑量（4.5 g·kg-1）根據(jù)枸杞葉人用日常劑量的2 倍設(shè)置。提取物用0.9%生理鹽水配制，給藥濃度分別為0.255 g·mL-1、0.45 g·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1。枸杞葉不同溶劑提取部位給藥劑量均按照得率折算為相應(yīng)生藥量。陽(yáng)性藥組（Donepezil）通過(guò)0.9%生理鹽水配制給藥濃度為0.2 mg·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1。動(dòng)物分組及給藥情況見(jiàn)表1。給藥周期為四周，之后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試并解剖，每組取3 只進(jìn)行心臟灌注，取全腦固定，剩余小鼠分離海馬組織，進(jìn)行后續(xù)生化指標(biāo)檢測(cè)。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥劑量

2.3 行為學(xué)測(cè)試

Y 迷宮（Y-maze）實(shí)驗(yàn)：將Y 迷宮三個(gè)臂隨機(jī)設(shè)置為新異臂、起始臂和其他臂。訓(xùn)練期將新異臂用隔板阻擋，小鼠由起始臂放入，自由探索起始臂和其他臂5 min。間隔1 h 后打開(kāi)新異臂的擋板，小鼠由起始臂放入，在三個(gè)臂中自由探索5 min，采用VisuTrack 軟件分析小鼠進(jìn)入新異臂的次數(shù)和時(shí)間。每只小鼠在測(cè)試前用75%酒精擦拭實(shí)驗(yàn)裝置以消除氣味影響。

新物體識(shí)別（Novel object recognition，NOR）實(shí)驗(yàn)：測(cè)試分三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為適應(yīng)期，小鼠在實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)自由探索10 min；第二階段為熟悉期，在實(shí)驗(yàn)裝置對(duì)稱(chēng)角落位置放入兩個(gè)完全相同的物體，將小鼠背朝物體并從距物體等距離處放入實(shí)驗(yàn)裝置，小鼠自由探索5 min后取出小鼠，間隔1 h后進(jìn)行下一階段實(shí)驗(yàn)；第三階段為測(cè)試期，將兩個(gè)相同物體中的一個(gè)物體替換為一個(gè)形狀、顏色、材質(zhì)都不同的新物體，同樣將小鼠背朝物體并從距物體等距離處放入實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)自由探索5 min，采用VisuTrack軟件分析小鼠在此期間對(duì)新物體和舊物體的探索時(shí)間及探索次數(shù)[18]。每只小鼠在測(cè)試前用75%酒精擦拭實(shí)驗(yàn)裝置以消除氣味影響。

2.4 腦組織海馬區(qū)HE及尼氏（Nissl）染色

行為學(xué)測(cè)試后，每組取3只小鼠麻醉，以PBS 溶液進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，然后進(jìn)行HE以及Nissl染色，在顯微鏡下對(duì)海馬組織進(jìn)行病理觀察并拍照，采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)單位面積下尼氏體染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.5 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子及炎癥因子含量測(cè)定

行為學(xué)測(cè)試后，取6只小鼠解剖取海馬組織，液氮速凍后稱(chēng)取一定重量的小鼠海馬組織，加入10倍量的PBS，低溫研磨制備10%組織勻漿，3000 r·min-1，離心10 min，取10%勻漿上清液待測(cè)。按照湖南艾方生物ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定小鼠海馬組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子BDNF、NGF、GDNF 水平及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10水平。

2.6 氧化應(yīng)激因子的測(cè)定

行為學(xué)測(cè)試后，取每組6只小鼠解剖取海馬組織，液氮速凍后稱(chēng)取一定重量的小鼠海馬組織，按照重量加入10 倍體積PBS 緩沖液，低溫研磨制備組織勻漿，3000 r·min-1，離心10 min 后取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定小鼠海馬組織中氧化因子SOD 的活力以及MDA和GSH的含量。

2.7 Western blot 法檢測(cè)小鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)

稱(chēng)取受試小鼠海馬組織，并將其加入10倍體積含有蛋白酶抑制劑Cocktail 的RIPA 蛋白裂解液中。之后，使用BCA 法來(lái)測(cè)定提取得到的組織總蛋白的濃度并制備蛋白樣品。采用10%蛋白凝膠試劑盒制備電泳凝膠，120 V 電泳2 h。轉(zhuǎn)膜條件：Nrf2，300 mA 120 min；β-Actin、HO-1，300 mA 60 min。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗：Nrf2 Rabbit mAb（1∶2000）、HO-1 Rabbit PolyAb（1∶4000）、β-actin Mouse mAb（1∶10000），置于4℃冰箱過(guò)夜孵育后取出。TBST 洗膜3次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG（H+L）（1∶10000），HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG（H+L）（1∶10000）。TBST 洗膜后，通過(guò)ECL 化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，使用Image J軟件對(duì)成像條帶進(jìn)行定量分析。

2.8 TUNEL 法及Western blot 法分別檢測(cè)小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及小鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)

依據(jù)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，選擇行為學(xué)改善較為明顯的枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組小鼠腦組織石蠟切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照；按照“2.7”項(xiàng)下的方法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)，轉(zhuǎn)膜條件：Caspase-3、Caspase-9，300 mA 60 min，一抗：Caspase-9 Mouse mAb（1:1000）、Caspase-3 Rabbit mAb（1:2000）。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別通過(guò)SPSS 20.0和GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 枸杞葉不同溶劑提取部位改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的效用評(píng)價(jià)

小鼠給以枸杞葉提取部位四周后，采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)及新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力（見(jiàn)圖2）。分析行為學(xué)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠對(duì)Y 迷宮中新異臂的探索次數(shù)和探索時(shí)間較空白組顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及80%醇沉上清部位均能顯著上調(diào)小鼠對(duì)新異臂的探索次數(shù)及探索時(shí)間（P<0.01）（見(jiàn)圖3）。在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠對(duì)新物體的時(shí)間分辨率與次數(shù)分辨率較空白組顯著降低（P<0.01）；枸杞葉各溶劑提取部位均能夠逆轉(zhuǎn)小鼠對(duì)新事物分辨率降低的趨勢(shì)（見(jiàn)圖4）。上述兩種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果綜合表明，枸杞葉水提部位以及水提80%醇沉上清部位可顯著改善亞急性衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，其作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥多奈哌齊一致。

圖3 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠Y迷宮行為學(xué)的影響（n=9）

圖4 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠新物體識(shí)別行為學(xué)的影響（n=9）

3.2 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)小鼠海馬區(qū)組織病理變化的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)模型小鼠腦組織海馬區(qū)組織病理變化的影響，對(duì)小鼠腦組織海馬區(qū)進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）以及Nissl染色。如圖5所示，在HE 組織切片中，空白組細(xì)胞排列整齊均勻，核仁清晰。與空白組相比，模型組小鼠海馬去神經(jīng)元細(xì)胞排列較為松散，核固縮現(xiàn)象十分明顯，核仁模糊；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位神經(jīng)元排列較為整齊，核固縮現(xiàn)象得到明顯改善，其中以水提部位高劑量組以及水提80%醇沉上清部位低、高劑量組改善作用最為顯著。

圖5 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)組織HE染色的影響（n=3）

如圖6 所示，在Nissl 染色組織切片中，空白組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯深藍(lán)色斑塊狀尼氏體。與空白組相比，模型組小鼠海馬區(qū)尼氏體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位和水提80%醇沉上清部位的高劑量組均可顯著增加小鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目（P<0.05，P<0.01），作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥多奈哌齊一致，其中以水提部位高劑量組效用最為顯著。

圖6 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)組織尼氏體染色的影響（n=3）

3.3 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)小鼠海馬組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子及炎性因子表達(dá)的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)模型動(dòng)物海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子及炎性因子表達(dá)的影響，檢測(cè)海馬組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子BDNF、NGF 與GDNF 及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10 的表達(dá)。其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子表達(dá)結(jié)果如圖7 顯示，模型小鼠海馬組織中BDNF、NGF、GDNF 含量較空白組顯著降低（P<0.01）；枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組均能明顯上調(diào)小鼠海馬組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)（P<0.05），作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥多奈哌齊一致，其中水提部位以及水提80%醇沉上清部位高劑量組表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用趨勢(shì)；炎癥因子表達(dá)結(jié)果如圖8顯示，與空白組相比，模型組小鼠海馬組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)顯著升高（P<0.01），抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)顯著減少（P<0.01）；枸杞葉的水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位的高劑量組均可顯著降低模型動(dòng)物海馬中促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ 表達(dá)（P<0.01），并且顯著增加抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)（P<0.01）。作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥多奈哌齊一致，水提部位高劑量組表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用趨勢(shì)。

圖7 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)因子表達(dá)的影響（n=6）

圖8 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織炎癥因子水平的影響（n=6）

3.4 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)模型小鼠海馬氧化應(yīng)激的影響，檢測(cè)氧化應(yīng)激因子在小鼠海馬組織的活力或表達(dá)。結(jié)果如圖9 所示，模型組小鼠海馬組織中抗氧化物酶SOD 的活力和GSH 的含量較空白組顯著降低（P<0.01），脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位顯著增強(qiáng)模型小鼠海馬組織中SOD 活力及GSH 的表達(dá)（P<0.01），下調(diào)MDA 的表達(dá)（P<0.01），枸杞葉水提部位高劑量組作用趨勢(shì)最強(qiáng)。

圖9 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織氧化因子水平的影響（n=6）

3.5 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)小鼠海馬組織抗氧化蛋白Nrf2、HO-1表達(dá)的影響

采用Western blot 法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)抗氧化蛋白Nrf2 和HO-1 的表達(dá)水平。結(jié)果如圖10 顯示，模型組小鼠海馬組織中抗氧化通路蛋白Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，枸杞葉水提部位高劑量組Nrf2 和HO-1 的蛋白表達(dá)水平較模型組顯著增加（P<0.01），作用趨勢(shì)最強(qiáng)。

圖10 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響（n=6）

3.6 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)的影響

依據(jù)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，選擇行為學(xué)改善較為明顯的枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組石蠟切片，通過(guò)TUNEL 法檢測(cè)小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況，染色結(jié)果如圖11A 所示，對(duì)照組腦組織海馬區(qū)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P<0.01），表明模型小鼠腦組織海馬區(qū)存在明顯凋亡；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位的高劑量組腦組織海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01），表明給藥后細(xì)胞凋亡程度明顯改善；采用Western blot 法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)凋亡通路蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖11B 顯示，模型組小鼠海馬組織中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，枸杞葉75%醇提低劑量組和水提80%醇沉上清部位高劑量組可顯著抑制Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01），作用趨勢(shì)最強(qiáng)。

圖11 枸杞葉不同溶劑提取部位對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)凋亡的影響

4 討論

衰老是指機(jī)體器官功能隨著時(shí)間推移產(chǎn)生功能減退的生理過(guò)程。大腦功能衰退是機(jī)體衰老最顯著的癥狀之一，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)與記憶能力呈下降趨勢(shì)，甚至發(fā)展為老年癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病，給國(guó)家、社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。機(jī)體氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激水平的上升是機(jī)體衰老最為顯著的指標(biāo)與關(guān)鍵病理機(jī)制[19]。機(jī)體在衰老過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，如果大量的自由基不能被及時(shí)清除，最終會(huì)導(dǎo)致自由基失衡從而引發(fā)氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）不僅會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成嚴(yán)重?fù)p傷，還可通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子來(lái)引發(fā)神經(jīng)炎癥加劇氧化應(yīng)激，導(dǎo)致惡性循環(huán)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬組織損傷，從而產(chǎn)生認(rèn)知障礙[21-22]，故抑制海馬神經(jīng)元的氧化與炎性應(yīng)激對(duì)于預(yù)防老年期癡呆癥的發(fā)生或延緩疾病進(jìn)程，防止衰老過(guò)程中的認(rèn)知能力下降至關(guān)重要[23-24]。因此，預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能是治療年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的潛在治療策略。本研究采用D-半乳糖小鼠皮下注射構(gòu)建亞急性衰老動(dòng)物模型。D-半乳糖過(guò)量攝入可產(chǎn)生過(guò)量ROS 以及抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激加劇而加速衰老進(jìn)程，是公認(rèn)并常用的亞急性衰老動(dòng)物模型[25-27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠頸背部長(zhǎng)期、大劑量皮下注射D-半乳糖后學(xué)習(xí)與記憶能力下降，并出現(xiàn)了行動(dòng)遲緩與毛發(fā)稀疏等衰老特征，較好地模擬了人體的衰老。同時(shí)，D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠產(chǎn)生顯著氧化應(yīng)激、炎癥應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降、損傷小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF 表達(dá)下調(diào)、促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ 表達(dá)升高、抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)減少、同時(shí)其氧化應(yīng)激因子抗氧化物酶SOD 的活力和GSH 的含量顯著降低、脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 的含量顯著升高，抗氧化通路Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)顯著降低，在細(xì)胞凋亡方面，表現(xiàn)為Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高。

中醫(yī)理論認(rèn)為年齡增長(zhǎng)，腎精虧虛是導(dǎo)致衰老的根本原因。同時(shí)“腎通髓海”，腎藏精生髓而充于腦。腎精充足，髓海充盈，則腦健神明，耳聰目明，反應(yīng)靈活，記憶力強(qiáng)；反之，腎精虧虛，髓海失養(yǎng)，則易出現(xiàn)心煩、健忘等神志異常癥狀。因此補(bǔ)虛益精為中醫(yī)抗衰老并防治老年期癡呆的治本之法。枸杞葉在歷代多種本草典籍中均記載其具有“補(bǔ)虛益精”功效[28]?，F(xiàn)代研究也證實(shí)了枸杞葉的神經(jīng)活性。韓懷欽等[29]研究發(fā)現(xiàn)寧夏無(wú)果枸杞葉水提物能夠促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。王長(zhǎng)江等[30]研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉總黃酮可通過(guò)提高機(jī)體氧化應(yīng)激水平、促進(jìn)BDNF表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗抑郁作用，徐龍飛[31]研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉總黃酮具有改善染鉛小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的效果，其機(jī)制可能與下調(diào)腦組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)有關(guān)。

本研究基于D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠模型，系統(tǒng)考察了枸杞葉改善模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力的效用部位。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞葉的水提部位以及水提80%醇沉上清部位對(duì)模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)與記憶能力均有顯著提高作用，并可以改善模型小鼠海馬神經(jīng)元活力增加尼氏體數(shù)目，對(duì)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其中以水提部位和80%醇沉上清部位高劑量組在改善模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)與記憶能力，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元活力方面效用最為明顯；在上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)方面，同樣也是水提部位以及水提80%醇沉上清部位作用最為顯著；在中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控方面，以枸杞葉水提部位高劑量組抑制促炎因子表達(dá)與提升抗炎因子表達(dá)效果最為顯著；在調(diào)控氧化應(yīng)激方面，枸杞葉水提物高劑量組提高抗氧化物酶活力、降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，促進(jìn)抗氧化蛋白表達(dá)方面效用最為明顯；在細(xì)胞凋亡方面，枸杞葉75%醇提低劑量組和水提80%醇沉上清部位高劑量組可顯著抑制凋亡通路蛋白Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)，減少模型小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。綜上分析認(rèn)為，枸杞葉總水提部位與水提80%醇沉上清部位具有較強(qiáng)的改善衰老模型小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的作用，并改善相關(guān)生化指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞葉中富含黃酮及酚酸類(lèi)成分、多糖類(lèi)成分、生物堿類(lèi)等多種化學(xué)成分[32]，其中黃酮與多酚類(lèi)成分含量高于枸杞果實(shí)，并具有清除自由基、抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用等生物活性，被認(rèn)為是枸杞葉中的主要活性物質(zhì)。枸杞葉所含黃酮與酚酸類(lèi)成分主要為蘆丁、槲皮素-3-O-蕓香糖苷-7-O-葡萄糖苷、綠原酸、新綠原酸以及咖啡酸等。研究表明綠原酸對(duì)腦組織氧化損傷具有保護(hù)作用，還可通過(guò)抗細(xì)胞凋亡以及抗β-淀粉樣蛋白生成，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[33]；諸多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，蘆丁可通過(guò)抗氧化、抗炎以及抗凋亡發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[34]；咖啡酸可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF表達(dá)等改善Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠模型學(xué)習(xí)與記憶功能障礙[35]。課題組前期研究表明，枸杞葉水提物、75%醇提物與水提80%醇沉沉淀上清部位中均含有上述類(lèi)型成分，而水提80%醇沉淀部位中并不含有黃酮與酚酸成分。所以水提80%醇沉淀部位改善模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力顯著弱于其余三種部位。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中，將進(jìn)一步采用活性跟蹤分離等手段，探索揭示行為學(xué)測(cè)試中改善模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力作用趨勢(shì)最顯著的枸杞葉80%醇沉上清部位中的活性成分，進(jìn)一步解析其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為這一藥食兩用中藥材的臨床應(yīng)用提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，同時(shí)助力于枸杞資源的綜合利用與大健康產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。