鄭嘉妮，黃靈欣，陸韞青，李 璇，陳 楊，仝佳祥，朱梓強(qiáng)，段金廒，李樂軍，朱 悅＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 蘇州 215007）

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落，同時伴有思維遲緩、認(rèn)知功能和意志活動減退等主要臨床特征的心境障礙疾病[1]。受COVID-19 影響，2020 年全球范圍內(nèi)重度抑郁癥增加了28%[2]，因此抑郁癥已成為危害公眾身心健康的重大疾病。目前臨床常用的抗抑郁藥物多為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑，但有近40%患者對該類藥物效用不明顯[3]。此外，使用該類藥物易出現(xiàn)惡心、便秘等胃腸道反應(yīng)以及勃起功能障礙等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者服藥依從性[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥病理機(jī)制極為復(fù)雜，涉及神經(jīng)遞質(zhì)重?cái)z取障礙、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、壓力應(yīng)激下丘腦-垂體-腎上腺軸異常激活、神經(jīng)炎癥損傷等多重環(huán)節(jié)[5]。上述多重環(huán)節(jié)綜合作用最終損害海馬區(qū)神經(jīng)元是抑郁癥的重要病理環(huán)節(jié)。尤其值得重視的是，多種研究認(rèn)為海馬區(qū)齒狀回區(qū)域神經(jīng)元即使在成年后也可新生生長，突破了中樞神經(jīng)難以新生的傳統(tǒng)認(rèn)識[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重抑郁癥患者較正常人海馬體積顯著減少，并伴有顯著的認(rèn)知缺失[7]。動物實(shí)驗(yàn)表明，現(xiàn)有的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑類抗抑郁藥物、體育鍛煉和電療等均可通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與海馬神經(jīng)元新生發(fā)揮抗抑郁作用，而其藥效也能通過轉(zhuǎn)基因或藥物干擾阻斷神經(jīng)新生所拮抗[8]。因此，促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)新生成為抑郁癥治療策略與藥物開發(fā)的研究熱點(diǎn)之一。

開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》[9]，由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓組成。主治心氣不足證，癥見神志不寧，健忘失眠，心悸怔忡等。功可益氣養(yǎng)心、安神定志，是經(jīng)臨床證實(shí)的改善輕、中度抑郁癥的有效方劑，并被納入2018 年國家中醫(yī)藥管理局公布的首批古代經(jīng)典名方目錄。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，該方可以通過促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)營養(yǎng)因子供給，抑制壓力應(yīng)激軸激活，減輕神經(jīng)炎癥等多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)改善抑郁動物模型的抑郁樣行為，但是關(guān)于其對海馬區(qū)神經(jīng)新生的影響未見報(bào)道[10]。因此，本研究擬基于慢性溫和不可預(yù)知刺激小鼠抑郁模型[11]與小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，評價(jià)開心散對模型小鼠海馬神經(jīng)新生的影響并探索相關(guān)信號通路，為開心散臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動物

ICR 小鼠，雄性，體質(zhì)量22-25 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF環(huán)境中，常規(guī)飼養(yǎng)，12 h 光照，溫度22-25℃，濕度40%-70%。ICR 小鼠孕鼠（14 天），購自江蘇集萃藥康公司，許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。

1.2 試劑

氟西?。‵131623）購自阿拉丁試劑公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridinc，BrdU，ST1056）、5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU，C0071S）試劑盒購自碧云天生物科技有限公司?？贵wβ-catenin Rabbit mAb（8480S）、GSK-3b Rabbit mAb（9315S），Histone H3 Rabbit mAb（9715S）、NeuN Rabbit mAb（24307S）、Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor（M）488（4408S）購自Cell Signaling Test 公司；Wnt3a Mouse antibody（sc-136163）、β-actin Mouse antibody（66009-1-lg）購自Proteintech 公司；Nestin Rabbit antibody（MAB353）購自Millipore 公司；HRP-Linked Anti-Mouse IgG（BA1050），HRP-Linked Anti-Rabbit IgG（BA1054 購自BOSTER 公司。小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（AF2554-A）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（AF30178-A）、皮質(zhì)醇（AF2565-A）ELISA 試劑盒購自湖南艾方生物科技有限公司。小鼠神經(jīng)生長因子（NGF，JEB-12458）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF，JEB-12339）ELISA 試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司。Neurobasal（21103-049）、B27（17504-044）、N2（17502001）培養(yǎng)基購自Gibco 公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自CORNING 公司；胎牛血清、青鏈霉素、Trypsin solution B （03-024-5B） 購 自 Biological Industries 公司；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）購自Proteintech公司。

1.3 藥材

人參（Panax ginsengC.A.Mey）、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifoliaWilld）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott.）、茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）藥材飲片購自蘇州天靈中藥飲片公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.4 儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；動物行為測試系統(tǒng)（上海吉量軟件公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 3100，美國Thermo 公司）；倒置顯微鏡（TE-2000，Nicon 公司）；恒溫混均儀（TS100，杭州瑞誠儀器有限公司）；超微量紫外/可見分光光度計(jì)（DENOVIX DS-11，美國）；AXIO Vert.A1熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

按照人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓（3∶2∶2∶3）的配伍比例，稱取100 g 藥材，采用8 倍量的溶劑回流提取2 次，每次2 h，過濾，合并2 次提取液，減壓濃縮，合并2次濾液，減壓濃縮至約1 mL藥液中含有1 g生藥的浸膏，冷凍干燥，得到開心散水提取物凍干粉。使用前，按需復(fù)溶。

2.2 慢性不可預(yù)知壓力應(yīng)激抑郁動物模型建立與行為學(xué)測試

取健康ICR 小鼠60 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組，每組12 只。依據(jù)課題組前期已建立的慢性不可預(yù)知壓力應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）動物模型方法構(gòu)建模型，實(shí)驗(yàn)流程見圖1。刺激條件包括：①飼養(yǎng)籠傾斜45° 12 h；②禁食24 h；③禁水24 h；④足底電擊3 次；⑤束縛2 h；⑥夾尾1 min；⑦強(qiáng)迫游泳10 min；⑧夜間照明12 h。隨機(jī)選取8 種條件中的4 種對小鼠進(jìn)行刺激，每天1 次，持續(xù)8 周，各組小鼠同一天內(nèi)接受的刺激相同。以糖水偏好實(shí)驗(yàn)（Sucrose preference test，SPT）、懸尾實(shí)驗(yàn)（Tail suspension test，TST）與強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（Forced swimming test，F(xiàn)ST）等行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷模型構(gòu)建與給藥效果（見表1）。受試動物首先進(jìn)行SPT 測試；TST 測試于SPT 測試結(jié)束24 h 后進(jìn)行；FST 測試于TST 測試結(jié)束24 h 后進(jìn)行（見圖1）。模型建立與行為學(xué)測試方法詳參相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

表1 實(shí)驗(yàn)動物給藥劑量

2.3 動物分組給藥與劑量

模型構(gòu)建成功后，對照組與模型組小鼠按體質(zhì)量每10 g 灌胃0.1 mL 生理鹽水。其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1 次，持續(xù)10 天給藥，開心散提取物劑量按照提取物制備得率折算成生藥量。灌胃第3天給需要灌注取材的小鼠腹腔注射BrdU（100 mg·kg-1·d-1），每天1 次，共7 次。給藥期間，模型組與給藥組動物維持壓力應(yīng)激造模。

2.4 小鼠壓力應(yīng)激因子與神經(jīng)營養(yǎng)因子測定

行為學(xué)測試結(jié)束后，處死小鼠，分離得到小鼠海馬、下丘腦、腎上腺等組織。液氮迅速冷凍，粉碎。稱取相應(yīng)重量組織，加入10 倍體積裂解液（10 mmol·L-1HEPES，pH=7.5，1 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1EGTA，0.5% Triton X-100，5 mmol·L-1benzamidine HCl，10 mmol·L-1aprotinin，10 mmol·L-1leupeptin），ELISA 法檢測下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（Corticotropin-releasing factor，CRF），腎上腺中促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic hormone，ACTH），海馬中皮質(zhì)醇（Cortisol）、神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain derived nerve growth factor，BDNF）的含量，試劑盒檢測范圍為7.8-500.0 pg·mL-1。

2.5 免疫熒光法檢測小鼠海馬區(qū)細(xì)胞增殖情況

受試小鼠完成行為學(xué)測試后，處死小鼠解剖獲得全腦，于4%多聚甲醛中固定24 h；分別于20%、25%、30%蔗糖溶液中浸泡梯度脫水。取脫水后腦組織，制備腦組織海馬區(qū)石蠟包埋切片，切片常溫保存。所得的腦組織石蠟切片脫蠟之后，浸于檸檬酸鈉緩沖溶液中微波加熱15 min。根據(jù)BrdU 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟，檢測模型動物海馬區(qū)神經(jīng)新生水平。用光學(xué)顯微鏡400倍放大率觀察海馬組織病理變化。

2.6 免疫蛋白印跡法

每組稱取海馬組織，記錄重量，加入10 倍量的RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑（50∶1），研磨后置于冰上裂解30 min，離心10 min 取上清。按照BCA 試劑盒的操作步驟測定總蛋白含量，98℃加熱15 min，使蛋白變性。配制10%和7.5%的蛋白凝膠，120 V 電泳，nestin轉(zhuǎn)膜時間為4 h，Wnt3a、GSK-3β、β-Actin 檢測轉(zhuǎn)膜時間為1 h，β-catenin 檢測轉(zhuǎn)膜時間為2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h。結(jié)束后加入一抗（β-catenin Rabbit mAb、GSK-3b Rabbit mAb、Wnt3a Mouse antibody、Nestin Rabbit antibody，抗體比例均為1:2000；β-Actin Mouse antibody，抗體比例為1:10000），4℃搖床過夜，二抗孵育（Anti-MouseIgG，Anti-RabbitIgG，HRP-linkedAntibody，抗體比例1∶10000），室溫孵育1 h，洗膜后使用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光。

2.7 小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞體系建立與鑒定

異氟烷麻醉孕鼠解剖取出胎鼠并分離腦組織，于消化液（10% Trypsin solution B，90% DMEM/F12）中37℃消化15 min 后置于50 mL 離心管中，加入終止消化液（10% FBS，90% DMEM/F12）終止消化。輕柔解離組織制備細(xì)胞懸液，2184 r·min-1離心 5 min，加神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基（49% Neurobasal，49% DMEM/F12，0.5% N2，1% B27，0.02% bFGF，0.02% EGF，0.5% P/S）重懸細(xì)胞，以1.5×105-2.5×105個細(xì)胞·mL-1的密度接種于75 mL 培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔48 h半量換液，5-7天傳代1次。以此構(gòu)建小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cell，NSCs）培養(yǎng)體系。

取傳代后的NSCs加入EdU（10 mol·L-1）培養(yǎng)48 h。接種于多聚賴氨酸預(yù)先賦予的細(xì)胞爬片。4%多聚甲醛常溫固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min。TritonX-100（0.3%）孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；10%山羊血清孵育封閉1 h 后加入Nestin 單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過夜24 h后進(jìn)行EDU染色，含F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（1∶100）室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次后于熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)進(jìn)行正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)分析后，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析。組間比較采用T-test 分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P<0.05 表示有顯著差異，以P<0.01表示有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 開心散提取物抗抑郁效用評價(jià)

建立CUMS模型小鼠，造模成功后，給以開心散提取物與氟西汀10天后，進(jìn)行行為學(xué)測試。與對照組相比，CUMS 模型組小鼠糖水偏嗜率（Sucrose preference test，SPT）顯著降低（P<0.01），懸尾實(shí)驗(yàn)（Tail suspension test，TST）和強(qiáng)迫游泳（Forced swimming test，F(xiàn)ST）不動時間顯著增加（P<0.01）。與模型組相比，氟西汀給藥組SPT 顯著提升，TST 和FST 不動時間顯著減少（P<0.01），提示模型構(gòu)建成功。與模型組相比，開心散提取物的低、高劑量組均能提升模型小鼠的SPT，降低TST 和FST 測試不動時間（P<0.01），改善模型小鼠抑郁樣行為，其中開心散高劑量組作用趨勢更加明顯（見圖2）。

圖2 開心散對抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響（n=10）

3.2 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬區(qū)細(xì)胞增殖的影響

通過BrdU法考察小鼠海馬區(qū)細(xì)胞新生水平，結(jié)果如圖3 所示。與對照組相比，模型組新生細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01）。與模型組相比，開心散提取物給藥后能夠顯著逆轉(zhuǎn)模型小鼠海馬新生細(xì)胞減少的趨勢（P<0.01），提示開心散具有促進(jìn)海馬細(xì)胞新生的作用，以高劑量作用趨勢更強(qiáng)。

圖3 開心散對抑郁模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞新生的影響（n=6）

3.3 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織巢蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot 法檢測受試小鼠海馬組織中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白（nestin）的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4 所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬組織中nestin 含量顯著下降（P<0.01），說明CUMS 模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞新生減少。與模型組相比，開心散低、高劑量組均可提高小鼠海馬組織中nestin 蛋白表達(dá)（P<0.05），開心散高劑量效用趨勢更強(qiáng)。

圖4 開心散對抑郁模型小鼠海馬區(qū)nestin蛋白表達(dá)的影響（n=8）

3.4 開心散提取物對抑郁模型小鼠壓力因子表達(dá)的影響

解剖受試動物，分離得到小鼠海馬、下丘腦、腎上腺等組織，ELISA 試劑盒檢測海馬Cortisol、下丘腦CRF、腎上腺ACTH 的含量，結(jié)果如圖5 所示。與對照組相比，模型組小鼠Cortisol、CRF、ACTH 含量顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，開心散低、高劑量組均可降低小鼠Cortisol、CRF、ACTH 含量（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強(qiáng)。

圖5 開心散對抑郁模型小鼠壓力因子表達(dá)的影響（n=8）

3.5 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

解剖受試動物，分離得到小鼠海馬組織，制備組織勻漿液。試劑盒檢測小鼠海馬組織BDNF、NGF 的含量，結(jié)果如圖6 所示，與對照組相比，模型組小鼠BDNF、NGF 含量顯著下降（P<0.01），與模型組相比，開心散低、高劑量組均可升高小鼠BDNF、NGF 含量（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強(qiáng)。

圖6 開心散對抑郁模型小鼠海馬營養(yǎng)因子表達(dá)影響（n=8）

3.6 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織Wnt、β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot 法檢測受試小鼠海馬中Wnt、β-catenin、GSK-3β 的相對表達(dá)水平，結(jié)果見圖7。與對照組相比，模型動物海馬中Wnt、β-catenin 的表達(dá)水平較對照組顯著下調(diào)（P<0.05）。與模型組相比，開心散提取物低、高劑量均可上調(diào)模型動物海馬中Wnt、β-catenin 的表達(dá)水平（P<0.05）；并且模型動物海馬中GSK-3b 的表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組相比，開心散提取物低、高劑量均可下調(diào)模型動物海馬中GSK-3β 的表達(dá)水平（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強(qiáng)。

圖7 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響（n=8）

3.7 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定

小鼠NSCs細(xì)胞于顯微鏡明場（Bright field）觀察時由多個神經(jīng)球聚集形成細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)體積大小各不相同，周圍有新增殖的體積相對較小的神經(jīng)球，無明顯的片狀物，雜質(zhì)細(xì)胞少（圖8）。免疫熒光顯示，NSCs呈nestin 染色陽性（圖8）和EdU 染色陽性（圖8），說明本實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)出的細(xì)胞為NSCs且具有增殖能力。

圖8 小鼠NSCs的鑒定（比例尺=50 μm，n=6）

3.8 開心散提取物對小鼠NSCs中細(xì)胞增殖的影響

為了考察開心散提取物對NSCs增殖的影響，將提取物凍干粉按照低、中、高3個濃度（1、3、10 μg·mL-1）加至NSCs 中作用24 h 后，固定細(xì)胞，以免疫熒光實(shí)驗(yàn)法檢測EDU 表達(dá)。結(jié)果如圖9 所示，與對照組相比，開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高NSCs 中EDU 表達(dá)（P<0.01），提示開心散能夠促進(jìn)NSCs增殖。

圖9 開心散對小鼠NSCs增殖水平的影響（n=6）

除免疫熒光法，通過Western blot 法檢測NSCs 標(biāo)志物nestin 表達(dá)以考察開心散提取物對NSCs 增殖的影響。結(jié)果如圖10 所示，與對照組相比，給藥開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高nestin蛋白的表達(dá)（P<0.01），也間接佐證了開心散提取物促進(jìn)NSCs增殖。

圖10 開心散對小鼠NSCs中nestin蛋白表達(dá)的影響（n=6）

3.9 開心散提取物對小鼠NSCs 中Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控的影響

將NSCs 與開心散提取物共同作用24 h 后，通過Western blot 法檢測Wnt、β-catenin、GSK-3β 的表達(dá)。結(jié)果如圖11 所示，與對照組相比，開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高Wnt、β-catenin 蛋白的表達(dá)（P<0.05）、降低GSK-3β 蛋白表達(dá)（P<0.05）。結(jié)果提示開心散提取物對Wnt/β-catenin信號通路具有調(diào)控作用。

圖11 開心散提取物對小鼠NSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響（n=6）

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步考察開心散提取物對小鼠NSCs中β-catenin入核情況的影響。結(jié)果如圖12顯示，與對照組相比，NSCs 加入不同劑量的開心散提取物后，胞漿內(nèi)β-catenin 的表達(dá)水平降低，胞核內(nèi)β-catenin 的表達(dá)水平提高（與對照組相比，P<0.05），提示開心散提取物可以促進(jìn)β-catenin 入核，對Wnt/β-catenin通路具有調(diào)控作用。

圖12 開心散提取物對小鼠NSCs中β-catenin蛋白入核表達(dá)的影響（n=6）

4 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)元不具備新生能力。自從Altman和Das采用BrdU 摻入法，發(fā)現(xiàn)了成年大鼠海馬齒狀回中存在神經(jīng)干細(xì)胞并具有神經(jīng)新生現(xiàn)象后，海馬區(qū)神經(jīng)新生成為神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)[14-17]。抑郁癥的發(fā)生也認(rèn)為與海馬神經(jīng)新生密切相關(guān)[18-20]，持續(xù)壓力應(yīng)激導(dǎo)致的皮質(zhì)酮水平上升會導(dǎo)致CUMS 抑郁模型小鼠海馬齒狀回細(xì)胞增殖減少，海馬神經(jīng)新生減少，促進(jìn)焦慮和抑郁的病程發(fā)展[21]。多種抑郁治療手段能夠促進(jìn)神經(jīng)新生并改善模型動物抑郁樣行為[22]。因此，海馬神經(jīng)新生被視為抗抑郁藥物的重要作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)開心散水提物能夠顯著抑制持續(xù)壓力應(yīng)激導(dǎo)致的CUMS小鼠壓力應(yīng)激軸激活并降低海馬區(qū)cortisol 表達(dá)，促進(jìn)海馬區(qū)NGF 與BDNF 表達(dá)，并顯著促進(jìn)海馬區(qū)BrdU 和nestin 的表達(dá)，上調(diào)小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞中EdU 和nestin 的表達(dá)，表明神經(jīng)新生調(diào)控可能是開心散提取物抗抑郁作用的重要環(huán)節(jié)。

Wnt/β-catenin 信號通路是神經(jīng)元新生與NSCs 增殖的經(jīng)典通路[23]。Wnt 蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled 結(jié)合，抑制GSK-3β 活性，使其不能磷酸化β-catenin；并導(dǎo)致Axin 不穩(wěn)定，APC、GSK-3β 和Axin 降解復(fù)合物無法形成，抑制β-catenin 磷酸化而使其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集。β-catenin 聚集達(dá)到一定量時，可向細(xì)胞核內(nèi)移位并與細(xì)胞核內(nèi)TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄激活因子可引起靶基因表達(dá)并促進(jìn)NSCs 增殖[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，開心散能夠促進(jìn)β-catenin入核。亦有報(bào)道顯示，開心散具有改善多種AD 模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力[25]，Wnt/β-catenin 信號通路也是其促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)新生重要的調(diào)控通路[26]。因此，Wnt/β-catenin 信號通路是開心散調(diào)控海馬神經(jīng)新生的重要信號通路。

開心散是經(jīng)臨床證實(shí)的輕、中度抑郁癥有效治療方劑[27]。方中人參大補(bǔ)心氣，鼓動氣血上榮于腦，腦得陽氣溫煦與陰血滋養(yǎng)。遠(yuǎn)志開心氣寧心安神，兼豁痰利竅以泄?jié)?。石菖蒲開竅化濕，茯苓淡滲利水，使痰濕得化，不復(fù)上僭。四藥同用，共奏補(bǔ)心安神，開心益智之功。同時根據(jù)辨證論治的需要，心氣不足較重則重用人參與遠(yuǎn)志，痰濕阻竅較重則重用石菖蒲與茯苓，從而形成了不同配比的開心散類方。課題組基于抑郁癥動物模型研究發(fā)現(xiàn)，開心散可通過增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)供給[28-29]、抑制壓力應(yīng)激HPA 軸激活，調(diào)控“腦-腸”軸改善中樞神經(jīng)炎癥等多環(huán)節(jié)[30-31]、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁效用。其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)控是開心散發(fā)揮抗抑郁作用的重要作用環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，開心散可促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF與BDNF合成并抑制降解從而提升抑郁模型動物海馬中相關(guān)營養(yǎng)因子表達(dá)。開心散不同配伍比例中，以人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓藥材配比為3∶2∶2∶3 比例的配伍組合促進(jìn)NGF 與BDNF 表達(dá)效用最為顯著?；诩?xì)胞模型，還發(fā)現(xiàn)開心散能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子[32]，并協(xié)同低濃度NGF 促進(jìn)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤PC12 細(xì)胞分化與神經(jīng)絲纖維蛋白表達(dá)[12,33]，其中人參皂苷可能為其主要功效成分[32]。這些研究結(jié)果均證實(shí)了神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)控是開心散抗抑郁的重要作用環(huán)節(jié)，也與其他相關(guān)研究報(bào)道一致[34]。

基于神經(jīng)營養(yǎng)因子供給是開心散調(diào)控神經(jīng)新生改善抑郁的重要環(huán)節(jié)，在本研究中以CUMS 抑郁模型小鼠為研究對象，并結(jié)合NSCs 模型，繼續(xù)探究開心散是否能促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)新生與促進(jìn)原代神經(jīng)干細(xì)胞增殖。研究結(jié)果表明，開心散確實(shí)具有上述效用，同時也發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路是其調(diào)控的重要信號通路。已有研究表明，人參皂苷Rg1具有神經(jīng)營養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)新生的作用[35]。遠(yuǎn)志寡糖酯類化合物可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、細(xì)胞保護(hù)、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 表達(dá)[36-37]。石菖蒲可通過提高海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子逆轉(zhuǎn)抑郁行為[38]，β-細(xì)辛醚也能夠通過調(diào)控海馬神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)因子的表達(dá)，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙[39]。茯苓水提液對東莨菪堿、30%乙醇所致記憶再現(xiàn)障礙兩種模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有改善作用[40]。以上結(jié)果也提示，這些成分可能是開心散促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)新生抗抑郁的功效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究基于小鼠CUMS 抑郁模型，發(fā)現(xiàn)了開心散具有抑制壓力應(yīng)激HPA 軸激活，增進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子供給，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)新生與增進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖改善小鼠抑郁樣行為的效用，同時發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路可能是其調(diào)控神經(jīng)新生的重要調(diào)控通路。課題組將深入挖掘開心散調(diào)控神經(jīng)新生抗抑郁的功效物質(zhì)基礎(chǔ)，助力于這一經(jīng)典名方抗抑郁的臨床應(yīng)用與二次開發(fā)。