熊岑 阮沛儀 郭曉剛 劉大千 曾麗嫻

摘要：建立了辣椒中多酚提取的超聲波輔助萃取法，并優(yōu)化得到最優(yōu)提取條件。探討了不同辣椒中多酚提取物的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，辣椒多酚最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min。在最優(yōu)條件下，對10種辣椒進行了多酚提取，含量為1.428～3.661 mg/g，且辣椒的多酚含量隨著成熟度的增加而增大。通過對其中5種差異較大的辣椒品種的抗氧化活性進行對比，結(jié)果表明簇生朝天椒（較辣）的自由基清除能力相對較強，當多酚含量為50 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達85.05%，對羥基自由基的清除率可達74.53%。該研究可為辣椒的高附加值深加工開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)和理論參考。

關(guān)鍵詞：辣椒；多酚；超聲輔助萃??；抗氧化活性

中圖分類號：TS255.1????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0089-06

Study on Extraction Process of Polyphenols from Chili and Their Antioxidant Activity

Abstract： An ultrasonic-assisted extraction method for the extraction of polyphenols from chili is established and the optimal extraction conditions are obtained through optimization. The in vitro antioxidant capacity of polyphenol extracts from different chili is investigated. The results show that the optimal extraction process conditions of polyphenols from chili are ethanol concentration of 60%， solid-liquid ratio of 1∶25 （g/mL）， ultrasonic temperature of 50 ℃ and ultrasonic time of 30 min. Under the optimal conditions， polyphenols are extracted from ten kinds of chili and the content ranges from 1.428 mg/g to 3.661 mg/g， and the polyphenol content of chili increases with the increase of maturity.Through the comparison of antioxidant activity of five varieties of chili with significant differences， the results show that Capsicum annuum var.fasciculatum （spicier） has a relatively strong scavenging capacity on free radicals.When polyphenol content is 50 μg/mL， the DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl free radical scavenging rate can reach 85.05% and 74.53% respectively. This study could provide a technical basis and theoretical references for the high added-value deep processing and development of chili.

Key words： chili; polyphenol; ultrasonic-assisted extraction; antioxidant activity

植物次級代謝產(chǎn)物（secondary metabolites）是不直接涉及到植物正常生長發(fā)育的有機物，但是其與植物抵御病蟲侵害、應(yīng)對環(huán)境脅迫等密切相關(guān)[1]，主要包括黃酮類、生物堿、多酚、萜類等[2]。植物中的生物活性次級代謝產(chǎn)物在藥物、保健品、農(nóng)藥、化妝品領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，如抗瘧疾藥物青蒿素[3]、鎮(zhèn)痛藥物嗎啡[4]都是投入臨床的植物次級代謝產(chǎn)物[5]。由于需求量較大，研究者們一直致力于擴大植物生物活性分子的產(chǎn)量。其中，化學全合成方法可模擬天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)實現(xiàn)純?nèi)斯ず铣?，但是此類方法耗時、復(fù)雜、成本高?；瘜W半合成方法則能夠以植物中產(chǎn)量較多的前體化合物為原料，合成生物活性更高的目標分子，相比化學全合成方法更環(huán)保、成本更低。Xie等[6]以天然黃酮橙皮素為原料，合成了一系列新的黃酮類化合物，并測試了其抗腫瘤和抗炎特性。Yang等[7]以銀杏等植物中提取的單黃酮為原料，合成藥效更好的雙黃酮和三黃酮化合物。因此，植物中生物活性次級代謝產(chǎn)物的提取工藝和效率研究是其在藥品、保健品、食品等領(lǐng)域開發(fā)的重要基礎(chǔ)。

辣椒是我國重要的蔬菜和調(diào)味品，加工產(chǎn)品多、產(chǎn)業(yè)鏈長，是重要的工業(yè)原料作物，常年種植面積1 000多萬畝，近年來已成為中國種植面積最大的蔬菜，2020年辣椒年產(chǎn)量占世界辣椒總產(chǎn)量的近40%。目前，辣椒在消費市場中的角色仍然主要是調(diào)味品和蔬菜，以鮮食[8]、干制品[9]、加工醬類[10]等形式供應(yīng)。但是，由于其品種豐富且品質(zhì)各異[11]，其高生物活性化合物含量增加了人們對辣椒其他價值的興趣，對其高附加值的發(fā)掘與應(yīng)用已經(jīng)逐步受到重視。

辣椒富含類黃酮和酚類化合物[12-13]，可作為天然的膳食抗氧化劑應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[14]，延緩或防止脂肪類食物在貯藏過程中變質(zhì)、果蔬類物質(zhì)變色等。在人體健康方面，自由基活性氧的形成是目前公認的誘導疾病的機制之一（如動脈粥樣硬化、慢性炎癥和某些癌癥等）[15]，植物多酚和黃酮類物質(zhì)作為人體的天然抗氧化劑來源可預(yù)防和減緩此類疾病。如Oboh等[16]研究表明辣椒多酚對肝臟和大腦的脂質(zhì)過氧化有抑制作用[17]。此外，辣椒多酚和其含有的辣椒素也具有抗菌效果。目前，辣椒多酚含量也是新鮮辣椒質(zhì)量評價和分級[18]、品種選育與篩選、物候期對品質(zhì)影響[19]、加工適應(yīng)性[20-21]的重要依據(jù)。目前，辣椒中多酚物質(zhì)的提取以及品種差異相關(guān)的研究報道較少。因此，本文建立了辣椒中多酚提取的超聲輔助萃取法，并對比不同常栽辣椒品種的差異，為辣椒的高附加值深加工開發(fā)提供了技術(shù)依據(jù)和價值參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究采用的10批次多品種辣椒包括7種朝天椒、1種魔鬼椒、1種線椒、1種羊角椒，均來自辣椒培育基地茂名市茂蔬種業(yè)科技有限公司。每個辣椒品種均選取果形一致、大小均勻的無病蟲害和機械損傷的新鮮果實，于-4 ℃冷凍保存。

1.2 試劑

無水乙醇、無水碳酸鈉：天津市百世化工有限公司；福林酚試劑：揚州市正大化學試劑玻璃儀器有限公司；沒食子酸、水楊酸、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；過氧化氫（分析純）：西隴科學股份有限公司；抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；DPPH：阜陽曼林生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

超聲輔助提取裝置（SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、DGG-9146A型低溫恒溫槽、超聲BILON-2008型波信號發(fā)生器） 上海比朗儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；WP-UP-Ⅱ-20型實驗室專用純水機 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；分析天平 上海上天精密儀器有限公司；JX-2008型組織搗碎機 青島圣吉儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；JP-031S型數(shù)控超聲波振蕩器 深圳市日康達創(chuàng)超聲波有限公司；SL-1000A型電動粉碎機 浙江省永康市松青五金廠；UV1800型紫外可見分光光度計 上海奧析科學有限公司。

1.4 方法

1.4.1 辣椒果肉中多酚的提取

本實驗提取工藝優(yōu)化及驗證均采用同批次朝天椒作為實驗對象。

1.4.1.1 溶劑萃取法

將新鮮辣椒粉碎，使用分析天平準確稱取5.00 g粉碎的辣椒于研缽中研碎，加入100.0 mL 60%的乙醇溶液并轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，在水浴溫度為50 ℃下浸提20 min。浸取完畢后進行抽濾，測定所得濾液的吸光值。

1.4.1.2 超聲波輔助法

準確稱5.00 g粉碎的辣椒于研缽中研碎，按照1∶20的料液比加入60%乙醇溶液并轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，在50 ℃、200 W條件下進行超聲輔助萃取20 min。提取完畢后進行抽濾處理，測定所得濾液的吸光值。

1.4.2 多酚得率的測定

提取辣椒中多酚含量的方法參照文獻[22]中總多酚的測定方法，以沒食子酸為標準品，配制一系列標準溶液，沒食子酸中的酚羥基可還原福林酚試劑中的酒石酸鐵，形成藍色絡(luò)合物，于765 nm處測定吸光值，繪制標準曲線（y=0.122 6x－0.026 6，R2=0.996 3，線性范圍：0～6 μg/mL）。辣椒提取液經(jīng)水稀釋至適當?shù)臐舛群螅瑴蚀_吸取1.0 mL樣品液于10.0 mL比色管中，平行3份，以蒸餾水為空白對照，于765 nm波長處測定吸光值，用回歸方程計算樣品總酚含量。

根據(jù)標準曲線得到樣品提取液中總多酚的濃度，參照下式計算總多酚得率。

總多酚得率（%）=（C×V×F）/100×m。

式中：C為由標準曲線所得的樣品液沒食子酸含量（μg/mL）;V為提取液定容體積（mL）；F為稀釋倍數(shù)；m為稱取的辣椒質(zhì)量（g）。

1.4.3 單因素實驗

稱取5.00 g粉碎的辣椒，以60%乙醇溶液為提取溶劑，在料液比1∶20 （g/mL）、超聲功率200 W、提取溫度50 ℃、提取時間20 min的條件下進行提取，分別考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL）、超聲溫度（30，40，50，60，70 ℃）、超聲時間（10，20，30，40，50 min）對多酚提取得率的影響，抽濾后測定各樣品的多酚得率，每個條件進行3次平行實驗。

1.4.4 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，用L9（34）正交表設(shè)計實驗，對乙醇濃度、料液比、超聲溫度和超聲時間進行實驗，考察其對多酚提取得率的影響，得出最佳提取條件。

1.4.5 抗氧化活性的測定

在最佳辣椒提取工藝條件下對辣椒中多酚進行提取，得到多酚粗提物，進行減壓蒸發(fā)得到粗提物浸膏。將粗提物浸膏溶于適量的蒸餾水中，加入等體積的純乙醇提取，去除沉淀中的多糖等雜質(zhì)，石油醚脫脂后用乙酸乙酯提取，減壓蒸發(fā)即可得到純化浸膏。將減壓蒸發(fā)得到的純化浸膏用60%的乙醇溶解定容，用紫外分光光度法測定其辣椒中多酚含量，再配制不同多酚濃度的樣品溶液。

1.4.6 DPPH·清除率的測定

測定方法參考文獻[23]，根據(jù)提取物多酚含量配制一系列濃度的多酚溶液（10.00，20.00，30.00，40.00，50.00 μg/mL），并配制一系列相同濃度的抗壞血酸溶液。分別取不同濃度的辣椒多酚提取液各2.0 mL于25 mL比色管中，再依次加入0.20 mmol/L的 DPPH溶液2.0 mL，另取一支比色管加入2.0 mL的蒸餾水作為空白對照，搖勻，放置于陰暗處避光反應(yīng)30 min。于517 nm處分別測定其吸光值，記為A1，空白組記為A0。按相同的步驟測定抗壞血酸溶液的DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率（%）=（1－A1/A0）×100%。

1.4.7 羥基自由基（·OH）清除率的測定

測定方法參考文獻[24]，利用水楊酸捕獲Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，加入多酚提取液和VC等，分別考察其與水楊酸競爭清除·OH的能力。取不同濃度的辣椒多酚樣品溶液2.0 mL于25.0 mL比色管中，分別依次加入2.0 mL 6.00 mmol/L的FeSO4和2.0 mL 6.00 mmol/L的過氧化氫，靜置15 min后，向其中加入6.00 mmol/L的水楊酸，在避光條件下反應(yīng)30 min。于510 nm處測定其吸光值，記為A2，空白組記為A0，用蒸餾水代替樣品溶液進行反應(yīng)。按相同的步驟測定抗壞血酸溶液的羥基自由基清除率。

·OH清除率（%）=（1－A2/A0）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

在相同條件下，分別考察了提取方式、乙醇溶劑體積分數(shù)、料液比、超聲溫度、超聲時間對辣椒中多酚提取得率的影響。

2.1.1 提取方式對辣椒中多酚提取得率的影響

在溶劑、料液比、提取時間和溫度相同的條件下，分別采用溶劑浸提法和超聲波輔助提取法進行多酚的提取，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，超聲波輔助提取法提取辣椒多酚的效果優(yōu)于溶劑浸提法。

2.1.2 乙醇濃度對辣椒中多酚提取得率的影響

由圖2可知，在一定條件下，隨著乙醇濃度的增大，樣品中多酚的提取得率呈先迅速上升到最高峰再下降的趨勢。當乙醇濃度為60%時，樣品中總多酚的提取得率達到最大值。隨著乙醇濃度的增加，其他醇溶性物質(zhì)也增加，影響了多酚得率的進一步提高[25]。

2.1.3 料液比對辣椒中多酚提取得率的影響

由圖3可知，多酚的提取得率隨著料液比的增大而逐漸增加，這可能是因為隨著溶劑量的增大，多酚與溶劑的接觸面積變大，使得物質(zhì)的擴散速度加快，更有利于樣品中多酚的提取。但當料液比達到1∶30 （g/mL）之后，多酚提取得率變化相對平穩(wěn)。為減少溶劑的浪費、節(jié)省提取成本，選取1∶30 （g/mL）為最佳的料液比。

2.1.4 超聲溫度對辣椒中多酚提取得率的影響

由圖4可知，多酚的提取得率隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當超聲溫度為60 ℃時，多酚提取得率達到峰值。但超聲溫度繼續(xù)升高，引起了多酚的氧化或降解反應(yīng)，導致多酚提取得率減少。

2.1.5 超聲時間對辣椒中多酚提取得率的影響

由圖5可知，當超聲時間小于30 min時，多酚提取得率隨著超聲時間的增加而急速上升；當超聲時間到30 min時，多酚提取得率達到峰值；當提取時間超過30 min時，多酚提取得率隨著超聲時間繼續(xù)增加呈平緩下降的趨勢。這可能是因為延長超聲時間反而會使辣椒中的色素、辣椒堿等物質(zhì)溶出，增加雜質(zhì)，從而影響了多酚的溶出。因此，選擇30 min作為多酚的最適超聲時間。

2.2 正交實驗結(jié)果與驗證

2.2.1 正交實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取乙醇濃度60%、料液比1∶30 （g/mL）、超聲溫度60 ℃和超聲時間30 min作為考察因素，進行正交實驗，設(shè)計的正交實驗各因素水平見表1，實驗結(jié)果分析見表2。

由表2可知，KA1、KA2、KA3的大小不相等，說明A因素的水平變動對實驗結(jié)果有影響，而由KA2＞KA1＞KA3，可以判定A2為A因素的優(yōu)水平。同理，確定B1、C1、D2分別為B、C、D因素的優(yōu)水平。4個因素的優(yōu)水平組合A2B1C1D2為辣椒多酚提取的最佳方案，即乙醇濃度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min。

根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對實驗指標的影響大小。由表2可知本實驗極差Rj的計算結(jié)果，即RA＞RC＞RD＞RB，所以各因素對辣椒多酚提取效果影響的次序為A＞C＞D＞B，即乙醇濃度＞超聲溫度＞超聲時間＞料液比。由表2方差分析可知，各因素均對辣椒多酚的提取影響顯著。

2.2.2 結(jié)果驗證

在正交實驗確定的最佳組合條件下進行提取，即以60%乙醇溶液為提取溶劑，在料液比1∶25 （g/mL）、超聲功率200 W、超聲溫度50 ℃、提取時間30 min的條件下平行測定3次。結(jié)果表明，總多酚得率為21.86%，RSD值為2.15%，表明該工藝條件是合理可行的。

2.3 不同品種辣椒中多酚的體外抗氧化能力分析

自由基與機體的許多功能紊亂和疾病有著密切的關(guān)系。辣椒中多酚的抗氧化能力可以清除人體內(nèi)過量的自由基，對改善人體健康有積極的作用。因此，探討辣椒對自由基的清除作用具有重要的意義。本實驗選取5種辣椒樣品進行體外抗氧化性的研究，包括7種朝天椒中多酚含量較高的單生朝天椒（香辣）簇生朝天椒（較辣）以及魔鬼椒、線椒、羊角椒。

2.3.1 DPPH·清除能力

5種辣椒中多酚DPPH自由基清除實驗結(jié)果見圖6。

由圖6可知，5種辣椒多酚提取液均具有明顯的清除DPPH自由基的能力，清除能力大部分接近同濃度的抗壞血酸（VC）。隨著樣品多酚提取液濃度的增大，辣椒中多酚和抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力均逐漸增強。在濃度為10～30 μg/mL時，5種辣椒與抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力基本呈線性增長；在濃度大于30 μg/mL之后，簇生朝天椒（較辣）、單生朝天椒（香辣）和線椒與抗壞血酸的清除率增速逐漸變得緩慢。此時，簇生朝天椒（較辣）與單生朝天椒（香辣）的清除能力相近，這可能是因為它們同屬朝天椒；而魔鬼椒和羊角椒在濃度達40 μg/mL之后才出現(xiàn)平緩趨勢。5種辣椒的多酚對DPPH自由基的清除能力由小到大為魔鬼椒<羊角椒<線椒<單生朝天椒（香辣）<簇生朝天椒（較辣），后三者均強于抗壞血酸溶液。辣椒多酚含量為50 μg/mL時，清除能力最強的簇生朝天椒（較辣）對DPPH自由基的清除率最大，達到85.05%。

2.3.2 羥基自由基（·OH）清除能力

5種辣椒中多酚的·OH清除實驗結(jié)果見圖7。

由圖7可知，5種辣椒的多酚提取物均具有很好的·OH清除能力，隨著多酚提取物濃度的增大，其對羥基自由基的清除能力呈上升趨勢，并表現(xiàn)出量效關(guān)系。在相同濃度下，5種辣椒多酚提取物的羥基自由基清除能力接近，且均明顯高于抗壞血酸溶液。其中，簇生朝天椒（較辣）的清除能力相對較強，辣椒多酚含量為50 μg/mL時，·OH清除率最大，達到74.53%。

2.4 辣椒品種和成熟度對提取多酚含量的影響

對比了10種不同品種辣椒中的多酚含量，見圖8。

由圖8可知，不同辣椒中的多酚物質(zhì)含量存在顯著差異。青辣椒中多酚含量最高的是No.19單生朝天椒（3.286 mg/g），含量最低的是線椒（1.428 mg/g）；紅辣椒中多酚含量最高的是單生朝天椒（果皮硬度高，3.661 mg/g），含量最低的是羊角椒（2.035 mg/g）。10種辣椒中多酚物質(zhì)含量范圍為1.428～3.661 mg/g。辣椒的多酚含量因成熟度的不同而存在差異，辣椒的多酚含量隨成熟度的增大而增加。該結(jié)論與Ornelas-Paz等[26]的研究結(jié)果一致，在同一品種辣椒中，成熟度高的紅辣椒的多酚比成熟度相對低的青辣椒稍高，但差異不大。Navarro等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟期辣椒果實中多酚含量的變化一致，青辣椒（5.47 mg/g）的總多酚含量比紅辣椒（5.25 mg/g）略高。

3 結(jié)論

本文在單因素實驗的基礎(chǔ)上，使用正交實驗優(yōu)化，獲得的超聲輔助萃取法最佳的辣椒多酚提取工藝是乙醇濃度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min。在最佳提取工藝條件下，對5種辣椒中多酚的抗氧化活性進行了測試，對DPPH自由基的清除能力由小到大為魔鬼椒<羊角椒<線椒<單生朝天椒（香辣）<簇生朝天椒（較辣），后三者均強于抗壞血酸溶液。5種辣椒的多酚提取物均具有很好的·OH清除能力，均明顯高于抗壞血酸溶液且清除能力接近，簇生朝天椒（較辣）的清除能力相對較強。辣椒多酚濃度為50 μg/mL時，清除能力最強的簇生朝天椒（較辣）對DPPH自由基的清除率最大，達到85.05%，·OH清除率最大，達到74.53%。辣椒品種和成熟度會影響提取多酚的含量，在最佳工藝條件下，10種辣椒的多酚含量范圍在1.428～3.661 mg/g，辣椒的多酚含量隨成熟度的增大而增加，在同一品種辣椒中，成熟度高的紅辣椒的多酚比成熟度相對低的青辣椒稍高。本研究可為辣椒品質(zhì)和加工適應(yīng)性評價以及高附加值深加工開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)和理論參考。

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