艾媛媛 劉菲菲 王曉華 王雪峰 肖智超 王桂瑛 范江平

摘要：以云南鹽津烏骨雞肉為原料，蛋白水解度為指標，采用響應面分析法優(yōu)化鹽津烏骨雞肉酶解條件；用氨基酸分析儀及凝膠滲透色譜法檢測酶解液的氨基酸組成和多肽分子量分布。結果表明，雙酶分步酶解最佳工藝條件為動物蛋白酶酶解時間5 h、酶添加量2.6%、酶解pH值6.5，滅酶后，再加入木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃。在該條件下，鹽津烏骨雞肉水解度為（32.62±0.79）%；酶解液中含有17種氨基酸，總游離氨基酸含量可達6.02 mg/mL，且亮氨酸、精氨酸等呈味氨基酸含量較高，其中多肽的相對分子質(zhì)量主要集中分布在1 kDa以下。該研究結果可為后續(xù)鹽津烏骨雞相關新型調(diào)味制品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

關鍵詞：鹽津烏骨雞肉；分步酶解；響應面優(yōu)化；游離氨基酸；分子質(zhì)量分布

中圖分類號：TS201.25????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0028-08

Double-Enzyme Stepwise Enzymatic Hydrolysis Process of Yanjin Silky Fowl Chicken and Its Amino Acid Composition Analysis

Abstract： With Yunnan Yanjin silky fowl chicken as the raw material， protein hydrolysis degree as the index， the enzymatic hydrolysis conditions of Yanjin silky fowl chicken is optimized by response surface analysis method. The amino acid composition and molecular weight distribution of polypeptides of hydrolysates are detected by amino acid analyzer and gel permeation chromatography. The results show that the optimal process conditions for double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis are as follows： the enzymatic hydrolysis time of animal protease is 5 h， the addition amount of enzyme is 2.6%， the pH is 6.5， after enzyme inactivation， papain is added for? 3 h enzymatic hydrolysis， the enzyme addition amount is 2.5%， and the enzymatic hydrolysis temperature is 60 ℃. Under such conditions， the hydrolysis degree of Yanjin silky fowl chicken is （32.62±0.79）%， there are 17 amino acids in the enzymatic hydrolysate， the content of total free amino acids could reach 6.02 mg/mL， the content of flavor amino acids such as leucine and arginine is higher， and the relative molecular weight of polypeptides is mainly concentrated below 1 kDa. The research results could provide some theoretical basis for the development of new seasoning products of Yanjin silky fowl chicken in the future.

Key words： Yanjin silky fowl chicken; stepwise enzymatic hydrolysis; response surface optimization; free amino acids; molecular weight distribution

云南獨特的地理氣候環(huán)境孕育了許多種質(zhì)特異的地方特色雞資源，如無量山烏骨雞、茶花雞、大圍山微型雞、武定雞、瓢雞和鹽津烏骨雞[1]。其中，鹽津烏骨雞因產(chǎn)自云南省昭通市鹽津縣而得名，其肉質(zhì)鮮嫩美味[2]、營養(yǎng)價值較高[3]，還具有保健藥用功能[4]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，雞肉提供的優(yōu)質(zhì)蛋白在食品加工產(chǎn)業(yè)中被廣泛應用[5]。研究表明，雞肉經(jīng)酶水解后的主要產(chǎn)物是多肽和游離氨基酸，不僅可以促進呈味物質(zhì)的釋放[6-7]，用于調(diào)味產(chǎn)品的開發(fā)，而且具有較高的營養(yǎng)價值和利用價值[8]。

蛋白酶酶解主要是蛋白酶作用于蛋白質(zhì)的肽鍵，利用單一蛋白酶水解原料時，水解度低，風味物質(zhì)釋放不充分[9]；復合酶水解能夠使不同的酶切位點互補，從而提升酶解液的水解度，還能降低酶解液的苦味，增加特征香味[10]，因此多采用復合酶水解制備呈味基料[11]。Li等[12]利用雙酶酶解低值小龍蝦后，暴露出更多的酶切位點，酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量集中在0.5 kDa以下，主要以游離氨基酸和二肽形式存在。桂海佳等[13]利用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶分步酶解制備牛肉酶解液，最佳工藝條件下水解度達（41.48±0.34）%。目前有關鹽津烏骨雞的研究主要集中在品質(zhì)特性[14]和風味物質(zhì)上[15]，對鹽津烏骨雞呈味肽的研究較少。本試驗以云南鹽津烏骨雞肉為原料，利用雙酶分步酶解雞肉并進行工藝優(yōu)化，然后測定酶解液中游離氨基酸和多肽的分子質(zhì)量分布，以期為鹽津烏骨雞的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南鹽津烏骨雞：購自云南本城農(nóng)業(yè)科技有限公司，剔除雞身所有油脂、皮、筋、腱、膜。

1.2 試劑

動物蛋白水解酶（5×104 U/g，食品級）：廣東康達生物科技有限公司；風味蛋白酶（5×104 U/g，食品級）：河南萬邦化工科技有限公司；中性蛋白酶（5×104 U/g，食品級）、木瓜蛋白酶（1×105 U/g，食品級）：南寧龐博生物工程有限公司；復合蛋白酶（1×105 U/g，食品級）：河南省萬盛實業(yè)有限公司；甘氨酸：Biosharp生物科技公司；磷酸二氫鉀：天津市風船化學試劑科技有限公司；D-果糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；磷酸氫二鈉、茚三酮：廣東光華科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

PH828型pH計 東莞市希瑪儀表有限公司；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SPH120型消解儀 濟南阿爾瓦儀器有限公司；Multiskan GO多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；A300氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司；PL-GPC220凝膠滲透色譜儀 美國Agilent公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 雞肉酶解液的分步酶解工藝流程

原料預處理→加水混合→調(diào)節(jié)pH值→加第一種酶→水浴酶解→沸水浴滅酶10 min→調(diào)節(jié)pH值→加第二種酶→水浴酶解→沸水浴滅酶10 min→離心→取上清液→測水解度。

1.4.2 水解度的測定

參考肖雪等[16]的方法，采用茚三酮顯色法測定雞肉酶解液的游離氨基酸態(tài)氮含量。得到線性回歸方程A=0.021 9C-0.000 6，R2=0.999 7。參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[17]對雞肉中氮含量進行測定。按照下式計算水解度：

式中：c為甘氨酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為濾液體積，mL；N為氮含量，g/100 g；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.3 蛋白酶的篩選

以水解度為指標，固定料液比為1∶4、酶添加量為1.5%、酶解時間為4 h，在5種蛋白酶的最適pH值和最適溫度下對雞肉進行酶解，蛋白酶的種類及酶解條件見表1。對不同蛋白酶的酶解效果進行比較，選擇水解度最高的兩種蛋白酶進行雙酶分步酶解試驗。

1.4.4 單因素試驗

按照1.4.3中的方法設定參考條件為料液比1∶4、動物蛋白酶添加量1.5%、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0；木瓜蛋白酶添加量1.5%、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 6.0。分別考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解溫度（45，50，55，60，65 ℃）、酶解時間（2，3，4，5，6 h）、酶解pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）對酶解雞肉水解度的影響，確定各酶解條件的最適范圍。

1.4.5 響應面優(yōu)化試驗

在動物蛋白酶、木瓜蛋白酶單因素試驗的基礎上，動物蛋白酶選取3個因素：酶添加量（A）、酶解時間（B）、pH值（C）；木瓜蛋白酶選取3個因素：酶添加量（A′）、酶解時間（B′）、酶解溫度（C′）；以水解度作為響應值，分別進行三因素三水平試驗設計。響應面設計因素水平見表2和表3。

1.4.6 雞肉酶解液的游離氨基酸組成分析

取4 mL酶解液，加入1 mL 10%磺基水楊酸沉淀多肽及蛋白，置于2～8 ℃冰箱中冷藏靜置60 min。用離心機以4 500 r/min離心15 min，用濾膜過濾后進樣20 μL上機分析[18]，參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中的方法進行氨基酸測定[19]。

1.4.7 雞肉酶解液的多肽分子量分布

雞肉酶解液凍干后得到雞肉多肽。采用凝膠滲透色譜法檢測多肽相對分子質(zhì)量分布。色譜柱：2×PLgel 8 μm aquagel-OH Mixed-M 7.5 mm×300 mm，流動相：水，示差折光檢測器。標準品：PEG。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，采用GraphPad Prism 8對試驗數(shù)據(jù)進行繪圖；采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗；采用IBM SPSS Statistics 25.0進行統(tǒng)計分析（P<0.05表示差異顯著）；試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，在5種蛋白酶中，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最好，水解度分別為23.05%和9.78%。所以本試驗選擇動物蛋白酶、木瓜蛋白酶作為雞肉酶解最佳用酶，且按照先動物蛋白酶后木瓜蛋白酶的順序酶解。

2.1.2 酶添加量對水解度的影響

由圖2可知，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的水解度整體呈先升高后降低的趨勢；當酶添加量為2.5%時，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度分別為27.81%和27.70%，均達到最高值。造成這一現(xiàn)象的主要原因是：在反應前期，隨著酶添加量的不斷增加，酶與底物的結合率提高，此時水解速率與酶濃度的增加成正比；而當酶添加量高于2.5%時，底物逐漸被消耗而酶濃度過量，此時酶解反應達到飽和狀態(tài)[20]，所以進一步提高酶用量不能直接提高水解度。因此，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量均為2.5%。

2.1.3 酶解pH值對水解度的影響

由圖3可知，隨著pH值的升高，動物蛋白酶水解液的水解度呈先升高后急劇降低的趨勢。動物蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度在pH值為7.0時達到最大值，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度在pH值為6.0時達到最大值。pH值的變化會對酶活性中心上必需基團的解離產(chǎn)生影響。pH值過高或過低都會影響酶的活性和穩(wěn)定性。因此，蛋白酶隨著pH值的變化有不同的反應狀態(tài)，從而影響酶和底物之間的結合與催化。只有在最佳pH值下，才能使酶的活性達到最高[21]。因此，動物蛋白酶酶解鹽津烏骨雞肉的最佳pH值為7.0，木瓜蛋白酶的最佳pH值為6.0。

2.1.4 酶解溫度對水解度的影響

由圖4可知，隨著溫度的逐漸升高，動物蛋白酶在55 ℃時水解度達到最大，當溫度大于55 ℃后水解度急劇下降后趨于平緩；木瓜蛋白酶在60 ℃時水解度達到最大。這是由于酶在酶解時存在一個最適溫度，適當?shù)厣郎赜欣诿附馑俣鹊募涌欤^高的溫度則會導致酶失活，從而降低產(chǎn)物的水解度[22]。因此，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解鹽津烏骨雞肉的最佳酶解溫度分別為55 ℃和60 ℃。

2.1.5 酶解時間對水解度的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的增加，動物蛋白酶的水解度呈現(xiàn)先升高后降低又升高再降低的趨勢，在酶解時間為5 h時水解度達到最大值。木瓜蛋白酶的水解度呈現(xiàn)先升高后降低再趨于平緩的趨勢，在酶解3 h時水解度達到最大。隨著酶解時間的延長，底物與酶的結合更加充分，水解度總體呈現(xiàn)上升的趨勢；當酶解時間達到一定程度時，底物被消耗，酶解產(chǎn)物增多，酶分子的有效含量降低，導致水解度呈現(xiàn)下降趨勢[23]。由此可得，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解時間分別為5 h和3 h。

2.2 雞肉酶解條件響應面試驗

2.2.1 響應面設計結果及方差分析

分別選擇對水解度影響較大的3個因素進行響應面試驗，動物蛋白酶和木瓜蛋白酶試驗設計及結果分別見表4和表5。采用多元回歸擬合試驗數(shù)據(jù)，得到水解度對自變量編碼值的回歸方程：Y1=29.69+1.62A+0.81B－1.36C+1.11AB+1.03AC－0.95BC－3.76A2－4.16B2－1.34C2。Y2=26.87－0.35A′－0.22B′－0.18C′－0.73A′B′－0.60A′C′－0.75B′C′－1.17A′2－1.16B′2－1.31C′2。

對回歸模型進行方差分析，結果見表6和表7。

由表6和表7可知，兩個模型的P值均小于0.000 1，失擬系數(shù)反映了模型的預測值與實際值之間的擬合程度。失擬項的P值分別為0.053 7（>0.05）和0.207 6（>0.05），說明該模型具有較好的擬合能力，此模型可用。相關系數(shù)R2分別為0.984 2和0.976 9，模型的校正RAdj2與預測R2相差較?。≧2=0.984 2，RAdj2=0.963 9；R2=0.976 9，RAdj2=0.947 3），表明該模型可用來預測雞肉的水解程度和優(yōu)化酶解工藝。

對模型一次項、二次項、交互項的P值進行分析，其中一次項A、C和二次項A2、B2 、C2對響應值Y1（動物蛋白酶水解度）的影響極顯著（P<0.01），交互項A′B′、A′C′、B′C′和二次項A′2、B′2、C′2對響應值Y2（木瓜蛋白酶水解度）的影響極顯著（P<0.01）。因素對響應值的影響程度可以通過F值大小來判斷，因此可得影響次序為酶添加量>pH值>酶解時間（動物蛋白酶）；酶添加量>酶解時間>酶解溫度（木瓜蛋白酶）。

2.2.2 交互作用分析及驗證試驗

3D曲面圖坡度越陡、等高線呈橢圓形且越密集，表明該交互項對雞肉酶解工藝的影響越大[24]。由圖6和圖7可知，其水解度隨因素水平的增加呈先上升后降低的趨勢，與單因素試驗結果相符；且等高線圖整體呈橢圓形，表明存在顯著的交互作用，該結果與方差分析結果一致。通過該模型得到最佳工藝條件：第一步為動物蛋白酶酶解5 h、酶添加量2.6%、pH 6.5，第二步為木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃，水解度為30.16%。在此條件下通過3次重復試驗，所得水解度平均值為（32.62±0.79）%，與預測值較接近，表明該工藝具有可行性。

2.2.3 雙酶分步酶解順序

在雙酶分步酶解工藝中，采用不同的酶處理順序?qū)λ饨Y果有一定的影響。根據(jù)動物蛋白酶和木瓜蛋白酶的試驗結果，在其最優(yōu)反應條件下，按照反應的先后次序?qū)﹄u肉進行分步酶解試驗。由表8可知，先使用動物蛋白酶酶解，滅酶后再加入木瓜蛋白酶酶解水解度較高，選取此酶解順序進行后續(xù)試驗。

2.3 酶解液游離氨基酸分析

氨基酸作為蛋白質(zhì)的主要組成成分和重要風味前體物質(zhì)，其在食品中的種類和含量被作為一個重要指標來評價產(chǎn)品品質(zhì)和感官特性[25]，按照呈味特征可以分為鮮味、甜味、苦味及無味氨基酸。對雞肉酶解液中游離氨基酸進行分析，結果見表9。

雞肉酶解液中游離氨基酸總量為6.02 mg/mL，呈味氨基酸總含量為5.75 mg/mL，占游離氨基酸總量的95.51%。其中鮮味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，含量分別占游離氨基酸總量的1.83%、4.98%，是雞肉酶解液鮮味呈現(xiàn)的重要物質(zhì)。甜味氨基酸占游離氨基酸總量的18.60%，甜味氨基酸本身具有的鮮味對酸味和苦味有一定的消減作用，并能與其他風味物質(zhì)協(xié)同增鮮?？辔栋被嵴加坞x氨基酸總量的69.93%，此結果與Zheng等[26]、于亞輝等[27]的研究結果相似，在雞肉酶解液中苦味氨基酸是主要的呈味氨基酸。在鹽津烏骨雞肉酶解液中共檢測出7種人體必需氨基酸，其總含量為2.99 mg/mL，占游離氨基酸總量的49.67%，表明雞肉酶解液具有較高的營養(yǎng)價值。

2.4 雞肉酶解液中多肽分子量分布

最佳酶解工藝條件下雞肉酶解液中多肽分子量的分布情況見圖8。

由圖8可知，5～10 kDa的肽含量僅為1.95%，而小于3 kDa的肽占91.33%，平均相對分子量為1 128 Da，酶解液的營養(yǎng)、呈味特性與其所含的小分子肽具有密切關系。此研究結果與侯鈺柯等[28]利用肉雜雞雞骨架酶解后分子量分布具有相同趨勢，小于1 kDa的分子量占比最高，酶解過程為后續(xù)美拉德反應奠定了良好的物質(zhì)基礎。Liang等[29]研究發(fā)現(xiàn)雞湯中小于1 kDa的組分的鮮味較高，且小分子量組分的總體味道更加協(xié)調(diào)。吳明澤等[30]研究發(fā)現(xiàn)中華圓田螺肉中分子量小于1 kDa的肽抗氧化活性最強。

3 結論

本試驗得到分步酶解鹽津烏骨雞肉最優(yōu)工藝：先使用動物蛋白酶水解（酶解時間5 h、酶添加量2.6%、pH值6.5），滅酶后，再加入木瓜蛋白酶水解（酶解時間3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃）。此條件下水解度可達（32.62±0.79）%，所得酶解液中的游離氨基酸種類豐富，總量達到6.02 mg/mL，其中人體必需氨基酸含量占游離氨基酸總量的49.67%。此外，酶解產(chǎn)物中小于3 kDa的肽含量高于90%。酶解液中產(chǎn)生的游離氨基酸、多肽等呈味物質(zhì)為鹽津烏骨雞肉調(diào)味產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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