張道良 李寧 姜偉峰 吳紹輝 仇興標(biāo) 楊奕清

心房顫動(dòng)（房顫）在一般人群中的發(fā)病率高達(dá)2%，可誘發(fā)智力下降甚至癡呆、血栓栓塞性腦卒中、急性腎損傷或慢性腎病、急性心肌梗死、心力衰竭、室性心律失常等并發(fā)癥，甚至心源性死亡[1]。臨床遺傳研究表明，遺傳缺陷是部分房顫的重要分子病因[2]。目前，除了已發(fā)現(xiàn)的140多個(gè)房顫相關(guān)遺傳位點(diǎn)外，還發(fā)現(xiàn)60多個(gè)房顫相關(guān)基因，包括編碼心臟離子通道、縫隙連接通道、心臟結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心臟轉(zhuǎn)錄因子TBX20可以轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)多個(gè)房顫致病基因的表達(dá)，包括GJA5、NPPA、GJC1和KCNH2基因等[1-2]。本研究將TBX20基因作為房顫的候選致病基因進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年3月至2017年12月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院的182例漢族孤立性房顫患者作為病例組，其中男性102例，女性80例，年齡32～56歲，平均年齡（53±6）歲。選取236名漢族無房顫健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性131名，女性105名，年齡35～57歲，平均年齡（53±7）歲。2組入選者均經(jīng)過個(gè)人史及家族史回顧、仔細(xì)體檢、標(biāo)準(zhǔn)心電圖檢查和心臟超聲檢查。孤立性房顫的診斷根據(jù)國際通用的房顫患者管理指南[3]。病例組中35例（約19%）有房顫家族史，對(duì)照組中均無房顫家族史。2組入選對(duì)象均無明確的可誘發(fā)房顫的環(huán)境因素。本研究遵守醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范，并經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的核準(zhǔn)。經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，收集其臨床信息和外周靜脈血標(biāo)本，常規(guī)純化、-20℃冰箱保存其基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 人TBX20基因的體外擴(kuò)增 使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）擴(kuò)增人TBX20基因的編碼區(qū)和剪接位點(diǎn)序列，引物序列見參考文獻(xiàn)[4]。以每個(gè)入選對(duì)象的基因組DNA作模板，應(yīng)用AccuPrimeTMTaq高保真DNA聚合酶試劑盒（美國Invitrogen公司）及化學(xué)合成的上述人TBX20基因的擴(kuò)增引物，在PCR儀（美國Bio-Rad公司）上對(duì)人TBX20基因各片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR混合液的總體積為50 μL，其中包括10×AccuPrimeTMPCR BufferⅡ（內(nèi)含dGTP、dATP、dTTP和dCTP各2 mmol/L）5.0 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL、AccuPrimeTMTaq 高保真 DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、基因組DNA（40 μg/L）2.0 μL、高壓滅菌蒸餾水40.8 μL。PCR的溫度循環(huán)條件設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性20 s，隨即進(jìn)入溫度循環(huán)36次，每次包括94 ℃變性20 s、62 ℃退火30 s和68 ℃ 延伸1 min，終末68 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳（80V、45 min）分離后，切膠回收并用GeneJET凝膠DNA回收試劑盒（美國Thermo Scientific公司）進(jìn)行純化。

1.2.2 人TBX20基因的PCR測(cè)序分析 以上述純化的PCR產(chǎn)物為模板，使用1條人TBX20基因擴(kuò)增引物（正向或反向）和 BigDye Terminator v3.1 循環(huán)測(cè)序試劑盒（美國Applied Biosystems 公司）在PCR儀（美國Bio-Rad公司）上進(jìn)行測(cè)序PCR。測(cè)序PCR混合液的體積定為20 μL，其中預(yù)混合液 Premix 8.0 μL、正向或反向引物（2 μmol/L）2.0 μL、人TBX20基因片段DNA（30 μg/L）2.0 μL、高壓滅菌蒸餾水8.0 μL。測(cè)序PCR的條件如文獻(xiàn)[5]所述：共30次循環(huán)，每1次循環(huán)包括95 ℃變性（20 s）、50 ℃退火（15 s）及60 ℃延伸（l min）。測(cè)序PCR產(chǎn)物使用BigDye XTerminator 純化試劑盒（美國Applied Biosystems 公司）進(jìn)行純化。純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物在遺傳分析儀（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行凝膠電泳測(cè)序。將測(cè)出的人TBX20基因序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中的人TBX20基因序列（登陸號(hào)：NM_001077653.2）進(jìn)行比對(duì)分析以發(fā)現(xiàn)人TBX20基因突變。如識(shí)別出人TBX20基因突變，則PCR測(cè)序分析236名對(duì)照者的TBX20基因，并且在線檢索單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）和gnomAD數(shù)據(jù)庫（http://gnomad-sg.org/）以明確所發(fā)現(xiàn)的人TBX20基因突變的新穎性。

1.2.3 構(gòu)建人TBX20基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 野生型人TBX20基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒TBX20-pcDNA3.1的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)[4]。以野生型人TBX20基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒TBX20-pcDNA3.1作模板，應(yīng)用定位誘變?cè)噭┖校绹鳬nvitrogen公司）和1對(duì)互補(bǔ)引物（長度為31個(gè)堿基、突變點(diǎn)在中心），通過PCR生成Lys236*-突變型TBX20-pcDNA3.1。用DNA酶DpnⅠ（美國Thermo Fisher Scientific公司）切除野生型TBX20-pcDNA3.1模板，并通過測(cè)序證實(shí)獲得Lys236*-突變型TBX20-pcDNA3.1。人KCNH2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)的KCNH2-luc質(zhì)粒的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)[1]。

1.2.4 人TBX20基因突變體的功能研究 將HeLa細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。借助Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）將多種表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法見參考文獻(xiàn)[1]。每次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用100 ng的空pcDNA3.1質(zhì)粒（–）或100 ng的野生型人TBX20-pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒（WT）或100 ng的Lys236*-突變型人TBX20表達(dá)質(zhì)粒（Lys236*）或50 ng的空質(zhì)粒+50 ng 的WT或50 ng的空質(zhì)粒+50 ng的Lys236*，同時(shí)共轉(zhuǎn)染1.0 μg的人KCNH2-luc和40 ng的pRL-TK 質(zhì)粒（美國Promega公司）。使用內(nèi)對(duì)照海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK平衡每次轉(zhuǎn)染的效率。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h進(jìn)行收集并裂解。借助熒光定量分析儀（瑞士Tecan 公司），應(yīng)用雙熒光素酶（雙報(bào)告基因）分析試劑盒（美國Promega 公司）分析HeLa細(xì)胞裂解液中2種熒光素酶的活性，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示靶基因KCNH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

連續(xù)變量參數(shù)如研究對(duì)象的年齡、靶基因人KCNH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性等以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；分類變量參數(shù)如研究對(duì)象的性別、種族等用數(shù)字或百分比表示。2組連續(xù)變量參數(shù)的比較用Student’st檢驗(yàn)（非配對(duì)）；2組分類參數(shù)的比較用Fisher’s精確檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)值P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)人TBX20基因新突變

本研究通過對(duì)182例孤立性房顫患者的TBX20基因進(jìn)行測(cè)序分析，在1例51歲的男性散發(fā)性孤立性房顫患者中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)TBX20基因雜合無義突變，即NM_001077653.2:c.706A＞T;p.（Lys236*）突變。該TBX20基因突變?cè)谄渌?81例孤立性房顫患者和236名無房顫對(duì)照者中均未檢測(cè)出，在SNP或gnomAD數(shù)據(jù)庫中也尚未報(bào)道，表明該TBX20基因突變是新發(fā)現(xiàn)的突變。該例散發(fā)性孤立性房顫患者的TBX20基因c.706A＞T雜合突變和1名無房顫對(duì)照者的純合野生型對(duì)照DNA序列見圖1。

圖1 人TBX20基因c.706A＞T雜合突變及純合野生型對(duì)照DNA序列

2.2 Lys236*-突變型人TBX20對(duì)靶基因KCNH2的轉(zhuǎn)錄激活作用喪失

在轉(zhuǎn)染了多種基因表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中，100 ng的TBX20和等量（100 ng）的Lys236*對(duì)人靶基因KCNH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)分別約為36倍（36.13±2.20）和2倍（2.29±0.67），2組之間的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝25.48，P＜0.01）；而在同時(shí)轉(zhuǎn)染50 ng的TBX20和等量（50 ng）的Lys236*時(shí)，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)約為18倍（17.71±1.91），顯著低于100 ng的TBX20對(duì)人靶基因KCNH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.94，P＜0.01）。

3 討論

本研究在1例男性散發(fā)性孤立性房顫患者中發(fā)現(xiàn)了1種新的TBX20基因雜合無義突變，即NM_001077653.2:c.706A＞T;p.（Lys236*）突變。該TBX20基因突變?cè)?36名無房顫對(duì)照者中未檢測(cè)出，在SNP或gnomAD數(shù)據(jù)庫中也尚未報(bào)道?；陔p報(bào)告基因定量分析表明Lys236*-突變型TBX20對(duì)靶基因KCNH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用喪失，而KCNH2基因變異已被證實(shí)可導(dǎo)致多種類型的心律失常，包括房顫、短QT綜合征和長QT綜合征[6-10]。因此，TBX20基因突變極有可能是該例孤立性房顫患者的分子病因。

人TBX20基因定位于7號(hào)染色體7p15-7p14區(qū)域，編碼1種由447個(gè)氨基酸組成的含有T-box的轉(zhuǎn)錄因子，屬于T-box家族的5號(hào)成員[1]。研究發(fā)現(xiàn)，TBX20大量表達(dá)于胚胎發(fā)育期的心臟，且在出生后及成年人的心臟中持續(xù)大量表達(dá)，對(duì)心血管正常發(fā)育和適應(yīng)性重構(gòu)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[11]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TBX20可以單獨(dú)調(diào)節(jié)或與其轉(zhuǎn)錄合作伙伴如TBX5、NKX2.5、GATA5或GATA4一起協(xié)同調(diào)節(jié)具有重要作用的心血管相關(guān)靶基因如GJA5、NPPA、GJC1和KCNH2的表達(dá)，從而影響心血管發(fā)育和重構(gòu)[1,12-14]。此外，已發(fā)現(xiàn)GJA5、NPPA、GJC1、KCNH2、TBX5、NKX2.5、GATA5和GATA4基因突變均可誘發(fā)房顫[1]。本研究在孤立性房顫患者中發(fā)現(xiàn)的TBX20基因功能喪失性突變，表明人TBX20基因單倍型不足是房顫發(fā)生的分子病理機(jī)制之一。

TBX20基因功能障礙誘發(fā)房顫可部分歸因于心臟結(jié)構(gòu)和電生理異常。既往研究證實(shí)，TBX20基因在胎心發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、成年心臟功能和病理生理適應(yīng)，以及心臟電生理尤其是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能等方面具有重要作用[11]。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育不良或穩(wěn)態(tài)失衡可致傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙，從而觸發(fā)心律失常甚至猝死[1,11,15]。在成年小鼠，特異性敲除心肌Tbx20基因可導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、收縮功能喪失、心臟傳導(dǎo)速度降低和嚴(yán)重心律失常[16-17]。此外，已有研究表明TBX20可以選擇性地調(diào)節(jié)KCNH2基因的表達(dá)[1,12]。KCNH2基因編碼Kv 11.1（hERG），形成快速激活延遲整流K＋通道α亞單位（輔助性β亞單位為KCNE2基因編碼），而快速激活延遲整流K＋通道所產(chǎn)生的心肌動(dòng)作電位3期復(fù)極電流是心肌復(fù)極的主要電流之一[17]。Caballero等[12]發(fā)現(xiàn)，TBX20基因功能喪失可降低hERG的表達(dá)，減少心肌內(nèi)向整流K＋電流，導(dǎo)致心肌動(dòng)作電位時(shí)程延長。經(jīng)典心臟電生理理論認(rèn)為，觸發(fā)和折返是房顫的主要電生理機(jī)制，而觸發(fā)活動(dòng)可由心肌動(dòng)作電位時(shí)程延長所致的早期后除極所引發(fā)[18]，因此，TBX20基因功能障礙誘發(fā)房顫可能主要與觸發(fā)活動(dòng)增加有關(guān)。

值得注意的是，既往有報(bào)道TBX20基因突變可導(dǎo)致多種不同類型的心血管疾病，包括先天性心臟病如法洛四聯(lián)癥、室間隔缺損、房間隔缺損、房室共同通道、主動(dòng)脈縮窄、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、右室雙流出道、異常肺靜脈連接、心臟瓣膜畸形及擴(kuò)張性心肌病[1,19]。本研究提示TBX20基因功能喪失性突變可誘發(fā)散發(fā)性孤立性房顫，從而擴(kuò)大了TBX20基因突變的表型譜。

總之，本研究識(shí)別出1種新的TBX20基因功能喪失性突變，該突變可誘發(fā)房顫，為部分房顫的精準(zhǔn)防治提供了新的分子靶標(biāo)。