蔡承志

（茂名市農(nóng)業(yè)科技推廣中心，廣東 茂名 525000）

多鱗鱚在中國近海都有產(chǎn)出，屬于比較重要的經(jīng)濟魚類，又因其肉質(zhì)細膩鮮美，深受人們的喜愛。作為一種小型底棲魚類，多鱗鱚也是許多大型魚類的食物組成成分中不可缺少的部分。目前國內(nèi)外對多鱗鱚魚類的研究主要在種類區(qū)別、形態(tài)學、耳石、生長參數(shù)、養(yǎng)殖和仔稚魚發(fā)育等方面，有關(guān)其分子遺傳學研究相對較少。線粒體COI基因由于其較高的變異速率和易于擴增的特點，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定和群體遺傳學研究。通過對多鱗鱚線粒體COI基因序列的分析，我們發(fā)現(xiàn)該基因在物種鑒定和系統(tǒng)進化關(guān)系研究中具有很好的應(yīng)用潛力。此外，本研究還揭示了多鱗鱚遺傳多樣性水平較低，環(huán)境適應(yīng)能力較弱，進一步強調(diào)了保護措施的緊迫性。本文將詳細介紹研究方法、結(jié)果和討論，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

1 本研究的目的及意義

多鱗鱚外形特征與鱚屬其他魚類非常相似，特別是與少鱗鱚、中國鱚，主要區(qū)別在于三者的側(cè)線上鱗的數(shù)量，然而鱚屬魚類的鱗片極易脫落，尤其是在魚體不新鮮的情況下，單靠形態(tài)學的鑒定往往導致多鱗鱚的錯誤鑒定。因此，有必要對不同地理來源的多鱗鱚樣品進行DNA條形碼分析，從分子水平來鑒定和區(qū)分多鱗鱚，并估算該物種的遺傳多樣性水平。本研究通過檢測采集于南海北部13個不同地點的多鱗鱚線粒體COI基因序列，探究COI條形碼在多鱗鱚物種中鑒定能力和評估該物種的遺傳多樣性，以了解多鱗鱚的系統(tǒng)進化和群體遺傳多樣性。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

本實驗所用的77尾多鱗鱚樣品采集于海南東方漁港、海南文昌和雷州流沙灣等13個南海北部地區(qū)（表1）。參考《中國魚類檢索系統(tǒng)》《臺灣海峽常見魚類圖譜》《北部灣魚類圖鑒》，對采集的樣本進行種類鑒定，剪取適量的魚體樣本的背部肌肉于95%乙醇中的2 mL離心管中，放入冰箱急凍層冷凍保存。

表1 本試驗中的多鱗鱚樣品

2.2 試驗儀器

本研究所用實驗儀器：冷凍高速離心機、電熱恒溫水槽、基因擴增儀、電子天平、可見光凝膠透射儀、電泳儀。

2.3 試驗試劑

實驗試劑：苯酚、酚-氯仿、滅菌超純水（DDW）、DNA提取液、蛋白酶K（PK）、異戊醇、氯仿、無水冰乙醇、70%乙醇、EDTA、Tris—base、6×Loading Buffer、10×Taq Buffer（2+Mg）、瓊脂糖、SDS、Marker、硼酸、正向引物F1/F2、反向引物F2/R2、10 mM dNTP、EasyTaq DNA polymerase。

2.4 魚類肌肉DNA的提取

本實驗提取魚肉DNA采用酚/氯仿抽提法，提取DNA加入80 μL的DDW，放置4℃冰箱存放24 h后可使用。

2.5 PCR擴增

2.5.1 擴增線粒體DNA的細胞色素C氧化酶I序列

使用通用引物F1/R1（F2/R2）來擴增多鱗鱚的COI基因片段序列，引物為：

F1：5’-TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3’；R1：5’-TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA-3’。F2：5’-TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC-3’；R2：5’-ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA-3’。

2.5.2 PCR體系

本試驗所用的緩沖體系：39.5 μL滅菌超純水（DDW）、5 μL 10×Taq Buffer、1 μL10 mol dNTP、1 μL 正向引物（F1/F2）、1 μL反向引物（R1/R2）、0.5 μL Taq DNA Polymerase、2 μL Template DNA。

2.5.3 PCR程序

預變性：94℃ 4 min；循環(huán)94℃ 45 s、50℃ 45 s、72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃ 8 min，4℃保存。

2.6 電泳檢測與序列分析

2.6.1 電泳檢測

本試驗主要將5 μL PCR擴增產(chǎn)物或DNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化后的PCR擴增產(chǎn)物記錄包裝好送到廣州生工生物工程股份有限公司進行測序，采用單向測序。

2.6.2 序列分析方法

將得到的多鱗鱚線粒體COI基因序列用SeqManⅡ軟件人工校正，剪除COI基因序列前后引物序列。在GenBank中將多鱗鱚COI單倍型基因序列進行BLAST比對與分析；借助MEGA 6.0軟件統(tǒng)計多鱗鱚線粒體COI基因序列的單堿基變異位點、保守位點、多態(tài)位點、單倍型多樣度（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）、轉(zhuǎn)換/顛換比率（R=si/sv）和堿基組成等數(shù)據(jù)；根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計算出種間和種內(nèi)的遺傳距離；以NJ鄰接法（Neighbor joining）構(gòu)建多鱗鱚單倍型分子系統(tǒng)進化樹。

3 結(jié)果

3.1 COI基因序列特征

經(jīng)過PCR擴增與測序后，本試驗獲得77個多鱗鱚線粒體COI基因片段序列（剪除前后引物序列），序列長度約是593 bp。統(tǒng)計得知，COI基因序列堿基的平均含量分別為T：29.0%、G：19.4%、C：29.2%和A：22.4%，可看出序列反G偏倚，對C和T偏倚。A+T含量（51.4%）明顯高于C+G含量（48.6%）。3個密碼子的G+C含量差異較大，第2密碼子GC含量（56.6%）最大，第1密碼子（45.5%）次之，第3密碼子（43.6%）最?。ū?）。

表2 多鱗鱚COI基因序列各堿基平均分布頻率（%）

77個多鱗鱚COI基因序列未出現(xiàn)缺失、插入與終止現(xiàn)象。分析得知，保守位點584個，變異位點9個，約占1.5%。在變異位點中，單堿基變異位點有7個，多態(tài)信息位點有2個。轉(zhuǎn)換與顛換發(fā)生次數(shù)比值（R= si/sv）為6.29，3個密碼子都沒有發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換（表3）。

3.2 遺傳距離與多樣性

依據(jù)Kimura雙參數(shù)模型對鱚屬魚類種間和種內(nèi)的凈遺傳距離分析。結(jié)果顯示，6種鱚屬魚類兩兩之間的遺傳距離為0.1810～0.2493（均值為0.2110），種內(nèi)遺傳距離為0.0000～0.0092（均值為0.0028），種間平均遺傳距離為種內(nèi)的75倍。其中多鱗鱚和斑鱚之間的凈遺傳距離最小，為0.1810；銀鱚與砂鱚之間的凈遺傳距離最大，為0.2493（表4）。多鱗鱚種內(nèi)遺傳距離為0.0007，種內(nèi)遺傳基因變異程度較低。

表4 6種鱚屬魚類的線粒體COI基因序列的種間遺傳距離

對6種鱚屬魚類種內(nèi)遺傳多樣性分析，獲得個體數(shù)（n）、單倍型基因數(shù)（Hap）、單倍型基因多樣性（Hd）和核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）的信息（表5）。結(jié)果顯示，多鱗鱚和斑鱚的遺傳多樣性最低，其核苷酸多樣性指數(shù)僅0.00067；銀鱚、少鱗鱚和中國鱚的核苷酸多樣性指數(shù)較高，分別為0.0091、0.00616、0.00616。

表5 6種鱚屬魚類的線粒體COⅠ基因序列的種內(nèi)遺傳多樣性

3.3 分子系統(tǒng)進化樹

基于NJ法所構(gòu)建的6種鱚屬魚類104個COI基因序列系統(tǒng)樹顯示（圖1），多鱗鱚、少鱗鱚、中國鱚、銀鱚、砂鱚、斑鱚等每種不同來源的個體均各自形成一個單系，其置信度均為99%。而6種鱚屬魚類的種間系統(tǒng)進化關(guān)系并不明確，未能獲得高置信度支持（支持率＜70%）。

圖1 根據(jù)COI基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)數(shù)

4 討論

4.1 多鱗鱚COI基因序列特征

本研究分析77尾多鱗鱚的COI基因序列，獲得序列長度約為593bp，4種堿基平均含量分別為T：29.0%、G：19.4%、C：29.2%和A：22.4%；A+T含量（51.4%）明顯高于C+G含量（48.6%）。宮亞運等[1]研究中國南海6種緋鯉屬魚類的COI基因，發(fā)現(xiàn)其堿基A+T含量（50.6%）稍高于C+G含量（49.4%）。薛泰強等[2]對多鱗鱚、少鱗鱚、斑鱚和銀鱚四種鱚屬魚類COI基因片段進行研究，也發(fā)現(xiàn)其A+T平均含量（52.9%）高于G+C含量（47.1%）的現(xiàn)象。本研究得出平均堿基含量關(guān)系與他們的研究結(jié)果類似。

從COI基因片段的堿基C+G含量的貢獻來說，第2密碼子GC含量（56.6%）最大，第1密碼子CG含量（45.5%）次之，第3密碼子CG（43.6%）最小，3個密碼子CG含量有顯著差異。李獻儒等[3]在中國近海鯡形目線粒體COI基因研究分析，結(jié)果表明第1密碼子CG含量（57.5%）最高，第2密碼子CG含量（42.7%）次之，第3密碼子CG（41.6%）最小。彭居俐等[4]研究4種鲌屬魚類32個COI基因序列得知，第1密碼子位點的CG含量（51.6%）最高，第2密碼子位點（42.8%）次之，第3密碼子位點（42.3%）最小。綜合來看，3個密碼子CG含量在不同的魚類中分布有差異，這種差異是否可成為判斷魚類的分類地位的依據(jù)還待進一步研究。

4.2 COI條形碼在多鱗鱚物種鑒定中的適用性

Hebert等[5]對動物界大量物種研究得知，種內(nèi)遺傳距離大部分要小于0.010，種間遺傳距離要比種內(nèi)遺傳距離大10倍以上是COI基因有效鑒定物種條件之一。而本研究對多鱗鱚COI基因序列分析，并與少鱗鱚、中國鱚、銀鱚、砂鱚、斑鱚作參照，發(fā)現(xiàn)這6種鱚屬魚類兩兩之間的遺傳距離為0.1810～0.2493（均值為0.2110），種內(nèi)遺傳距離為0.0000～0.0092（均值為0.0028），種間平均遺傳距離為種內(nèi)的75倍，種間遺傳距離遠大于種內(nèi)遺傳距離。這結(jié)果符合COI基因有效鑒定物種的條件。

Hebert等[6]經(jīng)研究又提出了COI基因有效鑒定物種的判斷依據(jù)，最小種間遺傳距離為0.02，種內(nèi)遺傳距離要小于0.02。本研究的77尾多鱗鱚種內(nèi)遺傳距離為0.0007，遠小于0.02；多鱗鱚與斑鱚、銀鱚、砂鱚、少鱗鱚、中國鱚的種間遺傳距離分別為0.1810、0.2136、0.2129、0.2037和0.2156，均大于0.02，與前人研究結(jié)論相吻合。在NJ樹上，6種鱚屬魚類均可聚成獨立分支（置信度99%），不存在交叉情況，與多鱗鱚的形態(tài)學判定結(jié)果一致，說明線粒體COI基因能有效地對多鱗鱚進行物種鑒定。

4.3 多鱗鱚的遺傳多樣性水平

研究來自13個地區(qū)的77尾多鱗鱚的線粒體COI基因序列，統(tǒng)計得到其保守位點584個，變異位點9個（單堿基變異位點7個和多態(tài)信息位點2個），說明不同地理來源的多鱗鱚COI基因序列變異較小，也可能是供研究的各個地區(qū)魚體數(shù)量較少造成的。多鱗鱚77個COI基因序列的遺傳多樣性分析表明，77個個體的COI單倍型基因有10個，單倍型多樣性指數(shù)為0.329（＜0.5），核苷酸多樣性指數(shù)為0.00067（＜0.005），表現(xiàn)出低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式，總體遺傳多樣性水平較低。本研究中來自南海北部多個地理群體的多鱗鱚遺傳多樣性較低，提示該物種的南海北部種群的進化潛力較小，這可能與近二十年來南海北部持續(xù)的過度捕撈導致種群資源量急劇下降，種群低齡化、小型化等種群衰退有關(guān)。本研究表明，南海北部的多鱗鱚遺傳多樣性較低，其種群的種質(zhì)資源狀況不容樂觀，需要引起相當?shù)闹匾暫筒扇”匾谋Ｗo措施。