摘要：為促進(jìn)多胎性狀策勒黑羊品種的培育，以策勒黑羊多胎性狀和X染色體分子標(biāo)記為對(duì)象，探究策勒黑羊多胎性狀在X染色體上的遺傳解析。選擇100只策勒黑羊進(jìn)行基因分型，利用PLINKv1.90進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)對(duì)X染色體上的SNP位點(diǎn)和策勒黑羊的多胎性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，選取P＜0.01的SNP位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，將篩選出的SNP位點(diǎn)附近的基因進(jìn)行注釋和分析，獲得X染色體多胎性的候選基因。結(jié)果表明，有14個(gè)SNPs與策勒黑羊X染色體多胎性狀在全基因組范圍內(nèi)顯著相關(guān)。共篩選出20個(gè)候選基因，對(duì)20個(gè)候選基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析，多胎性狀相關(guān)聯(lián)的候選基因6個(gè)，其中，F(xiàn)TH1基因已有文獻(xiàn)報(bào)道是多胎性狀的候選基因。

關(guān)鍵詞：策勒黑羊；多胎性狀；X染色體；候選基因；

策勒黑羊作為南疆和田地區(qū)特有的地方品種，能夠適應(yīng)本地區(qū)干旱炎熱氣候還具有常年發(fā)情、繁殖率高等特點(diǎn)，充分利用其品種特性不但能促進(jìn)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展對(duì)未來(lái)新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展也具有十分重要的意義。目前關(guān)于策勒黑羊常染色體上與多胎性狀相關(guān)聯(lián)的基因研究較為廣泛，吳正明等［1］通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)對(duì)保山豬ESR基因的多態(tài)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其與產(chǎn)子數(shù)顯著相關(guān)，可作為保山母豬產(chǎn)子數(shù)的主效基因。張輝等［2］研究發(fā)現(xiàn)GDF9基因中的g.41769833位點(diǎn)與策勒黑羊多胎性狀顯著相關(guān)。易鳴等［3］通過(guò)混合DNA池測(cè)序和直接測(cè)序法在貴州黑山羊RBP4基因上篩選SNPs位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)和群體遺傳參數(shù)分析后發(fā)現(xiàn)其有兩個(gè)位點(diǎn)可能與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)。Woodlands （Fec X2w） 是母系印跡基因，位于X染色體上，其突變后可增加后代母羊的產(chǎn)羔數(shù)［4］。馬曉菲等［5］以寒泊羊群體為研究對(duì)象，揭示其BMPR-IB基因的SNP位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)群體母羊攜帶BMPR-IB基因中B基因數(shù)量與產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)。郭曉紅等［6］采用PCR-SSCP技術(shù)分析了RARG基因?qū)π∥埠蚋叻敝沉Φ挠绊?，結(jié)果推測(cè)RARG基因可能是與小尾寒羊多胎性狀相關(guān)的一個(gè)主效基因或標(biāo)記。然而X染色體上攜帶了大量的遺傳物質(zhì)若其缺失或發(fā)生異常則會(huì)導(dǎo)致母畜卵巢先天性的發(fā)育不全、流產(chǎn)、不孕不育等，因此探究X染色體上有關(guān)綿羊繁殖性狀的基因是十分必要的［7-8］。而策勒黑羊經(jīng)過(guò)新疆南疆地區(qū)長(zhǎng)期的自然選擇和人工培育，其適應(yīng)在干燥和惡劣的環(huán)境下生存，但隨著市場(chǎng)需求的變化和選育工作的滯后，近些年來(lái)策勒黑羊的存欄數(shù)越來(lái)越少，其多胎率也隨之下降。

因此研究并培育策勒黑羊的各種優(yōu)良性狀和特性對(duì)保護(hù)新疆和田地區(qū)的優(yōu)良品種具有十分重要的意義，本研究主要以分析策勒黑羊X染色體基因?qū)Χ嗵バ誀畹恼{(diào)控為目的，通過(guò)SNP芯片在基因?qū)用媾c多胎性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，篩選調(diào)控多胎性狀的候選基因，期望提高策勒黑羊的多胎性能和繁殖機(jī)制，以期為實(shí)現(xiàn)新疆南疆策勒黑羊品種的選育以及策勒黑羊的養(yǎng)殖發(fā)展提供參考，同時(shí)也為和田地區(qū)畜牧業(yè)增收奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)以新疆策勒和田地區(qū)昆侖綠源羊管家牧場(chǎng)100只營(yíng)養(yǎng)水平一致，健康狀況良好且年齡在1.5～3.0歲的策勒黑羊母羊?qū)ζ溥M(jìn)行頸靜脈采血，標(biāo)記后存放于-15 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2 DNA的提取與檢測(cè)

使用TIANGEN公司的TIANampBlood DNA Kit（血液基因組DNA提取試劑盒，離心柱型，50preps）進(jìn)行DNA的提取，并用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA樣品的濃度與純度進(jìn)行檢測(cè)（濃度大于50 ng·μL-1，純度OD260 nm/OD280 nm在1.6～2.0之間）。

1.3 PLINK質(zhì)量控制

使用PLINKv1.90軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，去掉0（線粒體DNA）染色體的 SNP數(shù)據(jù)；篩選個(gè)體和SNP缺失的位點(diǎn)；去掉最小等位基因頻率＜0.05的位點(diǎn)；過(guò)濾掉檢出率＜0.95 的位點(diǎn)；只留下X染色體。

1.4 X染色體關(guān)聯(lián)分析

采用TASSEL 5.0軟件（https：//www.maizegenetics.net）進(jìn)行混合線性模型進(jìn)行分析［9］。

Y=μ +Mu+Xg+e+W

式中，Y為表型向量，表示多胎性狀；μ為產(chǎn)仔數(shù)均值向量；u為多基因效應(yīng)向量；g為固定環(huán)境效應(yīng)向量；e為殘差。M、W和X分別為u、b和g的關(guān)聯(lián)矩陣；b是 SNP效應(yīng)向量。U～N（0，s2 K），s2 為全基因組關(guān)聯(lián)分析加性遺傳方差，K為親緣關(guān)系的關(guān)聯(lián)矩陣。e～N（0，s2G），s2 為剩余方差，G為殘差的關(guān)聯(lián)矩陣。

以2［-log10（0.01）］為閾值，將策勒黑羊X染色體上P值小于0.01的所有SNP位點(diǎn)確定為與多胎性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。確定閾值后，利用R語(yǔ)言工具繪制策勒黑羊X染色體的曼哈頓圖和Q-QPlot圖。

1.5 基因注釋

全基因組關(guān)聯(lián)分析與多胎性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)上下游50 kb附近的基因選定為候選基因，利用綿羊參考基因組（Oar_v4.0），對(duì)篩選出的SNP位點(diǎn)的基因進(jìn)行注釋。

1.6 關(guān)聯(lián)候選基因的注釋分析

將注釋的20個(gè)候選基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所有獲得SNPs基于Oar_v4.0 （https： //www.sheephapmap.org/）進(jìn)行注釋?；虻墓δ芊治?參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）以及相應(yīng)的參考文獻(xiàn)。使用DAVID工具［10］（http： //david.Abcc.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 和 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取、檢測(cè)和質(zhì)控結(jié)果

將策勒黑羊100份頸靜脈血液樣品分別進(jìn)行DNA的提取，經(jīng)基因組DNA凝膠電泳檢測(cè)合格后，經(jīng)過(guò)Ilumina Ovine SNP 50 K芯片SNP分型后獲得52 084個(gè)SNPs。經(jīng)過(guò)Plink質(zhì)量控制后，26對(duì)常染色體上剩余47 909個(gè)SNPs，X染色體上剩余1 249個(gè)SNPs。圖1所示為策勒黑羊綿羊基因組DNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，從圖中可以看出M孔為DM 2 000，1～10泳道為樣本孔，條帶清晰適合于后續(xù)DNA芯片的構(gòu)建。

2.2 X染色體關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)篩選后，獲得14個(gè)策勒黑羊X染色體多胎性狀上顯著相關(guān)SNP位點(diǎn)。圖2為策勒黑羊X染色體SNP位點(diǎn)的Manhattan圖，X軸表示策勒黑羊X染色體所有SNP位點(diǎn)，Y軸表示與所有位點(diǎn)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)顯著性P值。圖中的水平線即為設(shè)定的顯著性閾值線2［-log10（0.01）］，高于這條水平線的位點(diǎn)為與表型顯著相關(guān)的位點(diǎn)。

圖3為對(duì)多胎性狀繪制的Q-QPlot圖，橫坐標(biāo)表示預(yù)期值與取對(duì)數(shù)后的觀測(cè)值之間的差異，而縱坐標(biāo)表示實(shí)際觀測(cè)值與取對(duì)數(shù)后的觀測(cè)值之間的差異，從圖中可以觀察到在2～3之間實(shí)際值和預(yù)期值結(jié)果之間存在較大的偏離，這說(shuō)明有更多的SNPs與該性狀有較大的關(guān)聯(lián)（14個(gè)位點(diǎn)較為顯著），結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 基因注釋結(jié)果分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析與多胎性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)上下游50 kb附近的基因選擇為候選基因，使用綿羊參考基因組（Oar_v4.0），對(duì)篩選出的SNPs進(jìn)行基因注釋?；蜃⑨尳Y(jié)果如表1所示，共篩選出14個(gè)SNP位點(diǎn)與多胎性狀顯著相關(guān)且每個(gè)位點(diǎn)附近均有兩個(gè)候選基因。

2.4 多胎性狀關(guān)聯(lián)候選基因結(jié)果

與多胎性狀方面相關(guān)的候選基因有6個(gè)，分別為FTH1、PRDM9、MID1、EGFL6、GLUD1和ST6GAL1。其生物功能如表2所示。

3 討論

3.1 FTH1基因

FTH1（Ferritin Heavy Polypeptide 1）位于綿羊X染色體34 339 997～34 340 653 bp范圍內(nèi)，F(xiàn)TH1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育以及動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)和繁殖的作用。通過(guò)Ferreira等［11］研究發(fā)現(xiàn)，敲除FTH1基因后，小鼠胚胎發(fā)育至3.5～9.5 d之間時(shí)死亡，說(shuō)明 FTH1基因?qū)π∈笈咛ド窠?jīng)早期發(fā)育起著重要作用。楊宏星［12］通過(guò)對(duì)豬的卵泡腔形成的分子篩選實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1基因還可能參與卵泡囊腔的形成。Feng等［13］通過(guò)對(duì)多胎的濟(jì)寧青山羊和單胎的遼寧絨山羊的研究，發(fā)現(xiàn) FTH1基因與濟(jì)寧青山羊的多胎性存在密切的關(guān)聯(lián)。目前，關(guān)于FTH1基因與多胎繁殖性狀相關(guān)性的研究在人及家禽上頗多，而在綿羊多胎性等方面的研究卻鮮有報(bào)道［14］。王麗等［15］研究表明，F(xiàn)TH1基因g.163-5 Ggt;A 位點(diǎn)的突變和湖羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，推測(cè)FTH1基因可作為影響綿羊繁殖力的候選基因，為近一步培育提高策勒黑羊的繁殖力提供了研究方向。

3.2 PRDM9基因

PRDM9（PR Domaincontaining 9）位于綿羊X染色體7 439 275～7 709 731 bp范圍內(nèi)。關(guān)于PRDM9基因的研究多與減數(shù)分裂和雜交不育相關(guān)。PRDM9是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可啟動(dòng)減數(shù)分裂重組［16］，通過(guò)其C端鋅指（ZnF）結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合DNA。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)敲除了PRDM9基因的雄性小鼠是不育的，因其阻礙了DNA雙鏈的修復(fù)途徑、同源染色體的配對(duì)等導(dǎo)致減數(shù)分裂無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行［17］。

3.3 MID1基因

MID1（Midline-1）位于綿羊X染色體7 940 970～8 078 003 bp范圍內(nèi)，MID1基因是一組被稱為三重基序（TRIM）家族基因的一部分，這組家族基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)參與了許多細(xì)胞活動(dòng)。MID1在早期胚胎階段表達(dá)分布廣泛，與器官形成過(guò)程和疾病相關(guān)組織的發(fā)育有關(guān)，喬英英［18］的小鼠實(shí)驗(yàn)表明，MID1基因的敲除有可能會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎早期發(fā)育停止。Quaderi等［19］已經(jīng)確定MID1（Midline-1）是X連鎖的Opitz（G/BBB） syndrome（OS）的致病基因，與胚胎顏部及中樞神經(jīng)發(fā)育相關(guān)是導(dǎo)致面部畸形的相關(guān)基因之一。胚胎發(fā)生是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程，其中一系列重塑事件以順序方式發(fā)生，MID1蛋白廣泛存在于各類胚胎組織中，尤其在增殖中的組織中高水平表達(dá)［20］。通過(guò)譚海萍［21］的CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況實(shí)驗(yàn)可以看出MID1沉默影響細(xì)胞增殖，即MID1能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

3.4 EGFL6基因

EGFL6位于綿羊X染色體10 849 978～10 870 015 bp范圍內(nèi)。EGFL6是EGF蛋白質(zhì)超家族的成員，EGFL6蛋白參與細(xì)胞膜的形成以及氨基酸的形成，在形成上皮細(xì)胞組織和細(xì)胞移植中有重要作用［22-23］。EGFL6基因同時(shí)也與腫瘤組織的形成有關(guān)系，比如在卵巢癌等組織中表達(dá)顯著，特別是在卵巢癌TEC中表達(dá)明顯［24-25］。通過(guò)激活ERK途徑觸發(fā)EC遷移和血管生成，EGFL6基因在成骨樣細(xì)胞上顯著表達(dá)，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和移植，同時(shí)作為類表皮生長(zhǎng)因子域重復(fù)超家族中的一員，參與調(diào)控了細(xì)胞周期、增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡過(guò)程，在多種腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞相比表達(dá)明顯增多［26］。

3.5 GLUD1基因

谷氨酸脫氫酶 1（GLUD1）基因位于X染色體86 415 995～86 417 283 bp范圍內(nèi)。研究表明，GLUD1與細(xì)胞代謝和增殖有關(guān)。谷氨酰胺在細(xì)胞成骨分化過(guò)程中主要提供能量，也是細(xì)胞形成蛋白質(zhì)的主要途徑［27］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺的缺失會(huì)抑制動(dòng)物成骨細(xì)胞的礦化形成［28］。經(jīng)谷氨酸脫氫酶基因編碼的谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase，GDH）是谷氨酰胺代謝中使谷氨酸轉(zhuǎn)化為α酮戊二酸的關(guān)鍵酶，該酶可通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酰胺的代謝水平，提供能量，促進(jìn)細(xì)胞代謝和增殖［29］。

3.6 ST6GAL1基因

ST6GAL1基因位于綿羊X染色體34 267 389～34 272 651 bp范圍內(nèi)。是 N-糖鏈上形成α2，6-連接唾液酸的主要唾液酸轉(zhuǎn)移酶的一種，而SNA凝集素可以特異性識(shí)別α2，6-唾液酸結(jié)構(gòu)。譚喜紅［30］使用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞增殖的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ST6GAL1基因介導(dǎo)的α2，6-唾液酸結(jié)構(gòu)對(duì)子宮上皮細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用，從而影響胚胎在子宮內(nèi)的附植情況。

3.7 其他候選基因

與X染色體連鎖的GlyRα2亞單位基因（GLRA2）具有控制發(fā)育中的皮層和脊髓中的細(xì)胞更新、神經(jīng)元遷移和突觸發(fā)生的功能，其罕見(jiàn)的錯(cuò)義突變和微缺失與人類自閉癥譜系障礙（ASD）、癲癇等疾病相關(guān)，在小鼠上敲除GLRA2嚴(yán)重影響動(dòng)作電位的形狀從而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞［31-32］。

FANCB基因促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生及發(fā)展并與范可尼貧血相關(guān)［33-34］，其致病變異與胚胎的多發(fā)畸形遺傳病相關(guān)。高璐等［35］認(rèn)為FANCB基因c.1162del（p.Y388Tfs*7）半合子變異可能與胎兒肢體畸形合并心臟發(fā)育異常的遺傳病因相關(guān)。

AFF2（FRAXE）是ALF轉(zhuǎn)錄因子旁系同源物、參與神經(jīng)發(fā)生和發(fā)育基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄超延伸復(fù)合物的組分之一，AFF2（FRAXE）基因是與X連鎖的導(dǎo)致智力發(fā)育障礙基因之一，且被證實(shí)了可能與孤獨(dú)癥譜系障礙的發(fā)生有關(guān)［36-37］。

RTPC5經(jīng)典瞬時(shí)電位受體通道5（TRPC5）是在細(xì)胞膜上的一種非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白，其在心血管系統(tǒng)有著廣泛的分布。王晟［38］研究發(fā)現(xiàn)TRPC5在肥胖狀態(tài)下對(duì)血管收縮具有調(diào)控作用，以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)現(xiàn)TRPC5參與了肥胖小鼠的主動(dòng)脈收縮反應(yīng)。同時(shí)TRPC5對(duì)攝入高糖引起的代謝失衡具有保護(hù)作用，并與腎臟疾病和血壓調(diào)節(jié)有關(guān)［39-40］。

癌/睪丸抗原FMR1NB在多種腫瘤中異常表達(dá)，而在除睪丸外的正常組織中不表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)FMR1NB與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)將來(lái)可作為膠質(zhì)瘤和大腸癌的潛在靶向治療點(diǎn)，而在小鼠身上進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)后觀察到FMR1NB與性取向相關(guān)［41-43］。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4（GPC4）是一種與胰島素受體相互作用的脂肪因子，可影響蛋白聚糖的胰島素敏感性，GPC4通過(guò)與胰島素受體相互作用和通過(guò)脂肪細(xì)胞分化來(lái)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)，對(duì)2型糖尿?。═2DM）具有一定影響［44］。Simpson-Golabi-Behmel綜合征（SGBS）是一種罕見(jiàn)的過(guò)度生長(zhǎng)綜合征，臨床特征為多種先天性異常、出生前/出生后過(guò)度生長(zhǎng)、獨(dú)特的顱面特征、小頭畸形和器官肥大，而GBC4基因的重排與發(fā)生SGBS有一定的關(guān)系［45］。

截至目前發(fā)現(xiàn)GLRA2、FANCB、AFF2、FMR1NB、GPC4和TRPC5等基因大多與疾病相關(guān)聯(lián)，在多胎繁殖性能方面的功能還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，在將來(lái)可作為策勒黑羊多胎性狀方面相關(guān)候選基因的研究，期望能夠發(fā)現(xiàn)與策勒黑羊相關(guān)聯(lián)的基因，為綿羊分子選育提供了參考，為策勒黑羊多胎性狀方面的發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究解析策勒黑羊多胎性狀和X染色體分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性，篩選出14個(gè)與策勒黑羊X染色體多胎性狀相關(guān)的SNPs，發(fā)現(xiàn)6個(gè)與多胎性狀相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步研究并培育策勒黑羊多胎的優(yōu)良性狀、促進(jìn)南疆地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和保護(hù)新疆和田地區(qū)的優(yōu)良品種奠定一定基礎(chǔ)，最終通過(guò)基因生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)FTH1可作為影響策勒黑羊X染色體多胎性狀的候選基因。

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Correlation Analysis of X Chromosome Multiple Embryonic Traits in Qira Black Sheep

PENG Yuwei1，WANG Shanglong1，WANG Yuanfeng1，WANG Quanfeng2，YANG Jianli2，MA Zhengwei2，ZUO Jianming2，LIU Shudong1

Abstract：In order to breed the Qira black sheep breed for multiple birth traits， the genetic resolution of multiple birth traits on the X chromosome of Qira black sheep was investigated by using multiple birth traits and X chromosome molecular markers. One hundred Qira black sheep were selected for genotyping， and PLINKv1.90 was used for quality control. At the same time， SNP loci on the X chromosome and multiparity trait of Qira black sheep were analyzed by association， and SNP loci with P＜0.01 were selected for labeling， and genes near the screened SNP loci were annotated and analyzed， so as to obtain the candidate genes for multiparity on the X chromosome. The results showed that 14 SNPs were significantly associated with X chromosome multiparity in Qira" black sheep on a genome-wide scale. A total of 20 candidate genes were screened and analyzed for their biological functions. Six candidate genes were associated with the multiple birth trait， among which， the FTH1 gene has been reported in the literature as a candidate gene for the multiple birth trait.

Keywords：Qira black sheep；multiple embryonic traits;X chromosome；candidate gene

收稿日期：2023-11-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060743）；新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)區(qū)高效肉羊品種選育項(xiàng)目（xjnqry-g-2006）；2022科技行動(dòng)自治區(qū)鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)發(fā)展（2022NC110）。

第一作者：彭玉薇（1999-），女，碩士研究生，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail： 1679691889@qq.com。

通信作者：劉書(shū)東（1988-），男，博士，副教授，碩導(dǎo)，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail： liushudong63@126.com。