廖鑫琳，郭鑫，楊季學(xué)，邵嘉朱，袁歆瑜，胡佳燕，陳曉曉，蔣冬花

拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌篩選及其防病作用

廖鑫琳，郭鑫，楊季學(xué)，邵嘉朱，袁歆瑜，胡佳燕，陳曉曉，蔣冬花

浙江師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321000

【目的】青枯雷爾氏菌（）引起的青枯病是煙草的主要病害。本研究從不同生境的土壤中篩選出對(duì)青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌，探究其對(duì)青枯雷爾氏菌的生理特征影響以及對(duì)煙草青枯病的防治效果，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)防病微生物菌劑提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷霉才囵B(yǎng)法和牛津杯法篩出目標(biāo)放線菌后，通過(guò)形態(tài)學(xué)研究、生理生化試驗(yàn)和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行菌種鑒定。通過(guò)96孔板法測(cè)定目標(biāo)放線菌粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度（MIC）。粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌處理后，檢測(cè)青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化，并用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)的變化；通過(guò)測(cè)定-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶（PI）熒光試驗(yàn)以及傅里葉變換紅外光譜觀察對(duì)細(xì)胞膜通透性和膜成分的影響；通過(guò)測(cè)定胞外多糖（EPS）、胞內(nèi)活性氧（ROS）等探究目標(biāo)放線菌株對(duì)青枯雷爾氏菌的影響。并通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定目標(biāo)放線菌株對(duì)煙草青枯病的防治效果?！窘Y(jié)果】根據(jù)形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和測(cè)序結(jié)果，將篩選得到的目標(biāo)放線菌Sa-21菌株鑒定為雷帕鏈霉菌（），對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑達(dá)47.9 mm。Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度為0.5 μg·mL-1，對(duì)菌體增殖也有明顯的抑制作用，并且試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著粗浸膏濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。掃描電子顯微鏡觀察到粗浸膏處理后的青枯雷爾氏菌菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致菌體出現(xiàn)穿孔和皺縮等現(xiàn)象，試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著粗浸膏濃度的升高，破裂菌體數(shù)量增加，皺縮程度增強(qiáng)，并且粗浸膏處理后，碘化丙啶可以穿過(guò)細(xì)胞膜與胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合發(fā)出熒光，且-半乳糖苷酶活性顯著增加，說(shuō)明處理后的青枯雷爾氏菌細(xì)胞膜通透性提高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，粗浸膏處理可導(dǎo)致青枯雷爾氏菌胞內(nèi)活性氧積累，胞外多糖產(chǎn)量下降，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞膜造成了一定程度的損傷。盆栽防病試驗(yàn)表明，先接種病原菌后噴施發(fā)酵濾液10倍稀釋液的處理對(duì)煙草青枯病的相對(duì)防治效果為67.61%，而先噴施發(fā)酵濾液10倍稀釋液再接種的處理對(duì)煙草青枯病的相對(duì)防治效果為85.89%?！窘Y(jié)論】鏈霉菌Sa-21能抑制青枯雷爾氏菌菌體增殖、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)煙草青枯病有較好的防治效果，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。

青枯雷爾氏菌；雷帕鏈霉菌；放線菌；生物防治

0 引言

【研究意義】青枯病是一種世界性細(xì)菌病害，因其發(fā)病率高難以防治被稱(chēng)為“植物癌癥”[1]。煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（）引起的一種土傳性維管束病害，可造成植物大量死亡，危害十分嚴(yán)重。該病在我國(guó)分布廣泛，大部分煙草省產(chǎn)區(qū)中均記載了青枯病的發(fā)生[2]。青枯雷爾氏菌不僅能夠侵染煙草，還能侵染番茄、辣椒、花生、馬鈴薯等多種重要經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)作物品質(zhì)與產(chǎn)量均有影響，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。且隨著全球氣候變暖，青枯病發(fā)生的危害在世界范圍內(nèi)也呈現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的趨勢(shì)[3]。因此，篩選對(duì)青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌株，對(duì)青枯病的綠色防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前煙草青枯病的防治主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等措施。She等[4]研究了煙草植株長(zhǎng)期連作的土壤群落結(jié)構(gòu)，表明連作后煙草青枯病發(fā)病率明顯上升，因此，輪作或間作的種植方式有利于降低植物青枯病的發(fā)生率?？共∑贩N選育是農(nóng)業(yè)防治的重要措施，目前篩選的高抗品種有云煙311、云煙317、K596[5]和K326[6]等，但抗病品種的選育周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢，尤其是病原菌變異較頻繁，高抗品種不能完全適應(yīng)病原菌的快速變異?；瘜W(xué)防治是使用最多的防治辦法，具有見(jiàn)效快、方便和損失低等優(yōu)點(diǎn)。目前傳統(tǒng)防治青枯病的化學(xué)藥劑有噻菌銅、溴菌腈·壬菌銅、乙蒜素等，防治效果均在50%以上[7]，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥可能會(huì)影響植物的生長(zhǎng)，同時(shí)影響環(huán)境安全，對(duì)土壤造成損害。生物防治是通過(guò)利用生物資源保護(hù)植物免受病蟲(chóng)害危害的一種防治措施，相比化學(xué)防治，其具有綠色環(huán)保、低毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，更符合綠色發(fā)展理念[8]。目前，生物防治研究已取得較大進(jìn)展，如木霉菌（）早在20世紀(jì)20年代就作為生物抗菌劑應(yīng)用于植物病害的防治[9]，此外，假單胞菌（）、芽孢桿菌（）和放線菌也是生物防治中的重要成員。有研究表明多種微生物資源可應(yīng)用于防治作物青枯病，如Li等[10]篩選到的解淀粉芽孢桿菌（）Y4和假單胞菌（sp.）Y8，對(duì)青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，大田試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示處理組煙草青枯病發(fā)病率降至對(duì)照組發(fā)病率的25%—33.3%；Kaari等[11]研究表明，鏈霉菌UT4A49對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制率為78.5%；黃偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬JK19對(duì)青枯雷爾氏菌等多種植物病原菌均有明顯的抑制作用；賴(lài)寶春等[13]將親和性菌株灰銹赤鏈霉菌（）FX81和深紅紫鏈霉菌（）FX28等比例同時(shí)復(fù)合發(fā)酵，復(fù)合發(fā)酵液對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑達(dá)36.0 mm，且促進(jìn)了番茄地上部分的生長(zhǎng)，干重增加76.58%。綜上，對(duì)青枯病開(kāi)展生物防治能有效降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，減少經(jīng)濟(jì)損失?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期于香樟（）根際土壤分離得到一株對(duì)青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌Sa-21，鑒定為雷帕鏈霉菌（），其對(duì)青枯雷爾氏菌的生理特征影響和對(duì)青枯病的防治效果還需進(jìn)一步明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從不同生境的土壤中篩選出拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株，利用96孔板法、傅里葉變換紅外光譜、熒光染色法等方法對(duì)目標(biāo)放線菌拮抗青枯雷爾氏菌進(jìn)行探究。以煙草為材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)分析目標(biāo)放線菌對(duì)煙草青枯病的防治效果，為作物青枯病防治提供借鑒，為放線菌在生物防治中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年2月至2023年8月在浙江師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物資源與開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室（以下稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株 放線菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室從腐殖質(zhì)豐富的煙草、香樟等根際土壤中篩選得到，共106株；青枯雷爾氏菌保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基 放線菌液體（高氏1號(hào)）和固體培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基和BGT培養(yǎng)基[14]。

1.1.3 供試煙草品種 易感本氏煙，由浙江師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的分離與篩選

1.2.1 青枯雷爾氏菌活化 在滅菌后的BGT培養(yǎng)基中加入25%的葡萄糖和1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），使培養(yǎng)基中葡萄糖和TTC終濃度分別為5和0.05 mg·mL-1，將青枯雷爾氏菌劃線接種于平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于B培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.6時(shí)取出備用。

1.2.2 放線菌的分離、純化與保藏在煙草、香樟等植株根際收集土壤，去除大顆粒，自然風(fēng)干2 d，稱(chēng)取5 g土壤加入到95 mL無(wú)菌水中，并定容至100 mL，28 ℃、160 r/min搖床振蕩混勻30 min，室溫靜置10 min后取上層液體，用無(wú)菌水對(duì)上層液體進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-2—10-5），取每個(gè)梯度的稀釋液100 μL均勻涂抹在含重鉻酸鉀（每100 mL培養(yǎng)基加入330 μL）的高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5—7 d，挑取具有典型放線菌菌落特征的菌株用平板劃線法純化出單菌落，純化3次后，對(duì)已純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，25%甘油管保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的篩選采用共培養(yǎng)法對(duì)拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株進(jìn)行初篩：將1 mL的青枯雷爾氏菌菌液與99 mL BGT培養(yǎng)基混勻倒板，將放線菌菌餅置于平板中央，以空白高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)2 d，十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。利用牛津杯法對(duì)拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株進(jìn)行復(fù)篩：用無(wú)菌打孔器（6 mm）打取初篩中具有拮抗作用的放線菌菌株接種于高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d，吸取2 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，得發(fā)酵濾液。將1 mL的青枯雷爾氏菌菌液與99 mL BGT培養(yǎng)基混勻倒板，滅菌的牛津杯置于平板中央，取200 μL發(fā)酵濾液加入到牛津杯中，以空白高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)2 d，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 目標(biāo)菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照文獻(xiàn)[15-16]配制菌落特征培養(yǎng)基，用接種環(huán)劃線接種目標(biāo)菌株于各培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)情況。用無(wú)菌鑷子在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基中央制作凹槽，將目標(biāo)菌株用無(wú)菌棉棒均勻涂布在凹槽四周，蓋上滅菌蓋玻片，28 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，取蓋玻片于光學(xué)顯微鏡下觀察目標(biāo)菌株的菌絲和孢子絲形態(tài)。取培養(yǎng)7 d的目標(biāo)菌株菌絲，用PBS緩沖液清洗3次，加入500 μL 2.5%的戊二醛固定4 h，離心去上清，用30%—90%的梯度乙醇（每20%為一個(gè)梯度）進(jìn)行脫水，每次脫水30 min，再用無(wú)水乙醇處理30 min，離心留菌體，用叔丁醇置換3次，每次20 min，最后一次留少許叔丁醇，將樣品放在-20 ℃下冷凍30 min，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥過(guò)夜，取少量干燥后的菌絲粘于導(dǎo)電膠上，噴金，放入掃描電子顯微鏡下觀察菌絲顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.2 生理生化試驗(yàn) 根據(jù)《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類(lèi)》[17]和《放線菌系統(tǒng)學(xué)-原理、方法及實(shí)踐》[18]配制生理生化特征培養(yǎng)基，通過(guò)劃線、點(diǎn)接等方式將目標(biāo)菌株接種到各種鑒別培養(yǎng)基上，主要測(cè)定目標(biāo)菌株產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、脲酶、脂肪酶、過(guò)氧化氫酶和蛋白酶能力；測(cè)定目標(biāo)菌株是否能夠產(chǎn)生黑色素、硫化氫等；并測(cè)定目標(biāo)菌株對(duì)碳源和氮源的利用能力。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株的總DNA，使用通用引物27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)目標(biāo)菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增[19]，得到的PCR產(chǎn)物在上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定初步鑒定，再通過(guò)、和等引物[20-21]（如表1所示）擴(kuò)增相應(yīng)管家基因序列，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合多基因比對(duì)結(jié)果，使用MEGA 11鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育分析確定目標(biāo)菌株分類(lèi)地位。

表1 擴(kuò)增gyrB、recA和rpoB管家基因所用引物

1.4 目標(biāo)菌株拮抗青枯雷爾氏菌活性及對(duì)其生理特征的影響

1.4.1 粗浸膏的制備 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定活性物質(zhì)可用乙酸乙酯提?。ǚ謩e用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種極性有機(jī)試劑先后提取發(fā)酵液中的活性物質(zhì)，用牛津杯法測(cè)量提取的有機(jī)試劑是否有抑菌活性，純有機(jī)試劑作為對(duì)照）。取培養(yǎng)5 d的Sa-21菌株菌餅接種于高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中（100 mL/250 mL），28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d制成種子液，將種子液轉(zhuǎn)接至大容量錐形瓶中（1 L/3 L）同樣條件發(fā)酵7 d得到發(fā)酵液，用乙酸乙酯法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行反復(fù)萃取直至萃取液無(wú)色，將萃取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后得到粗浸膏。

1.4.2 粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度（MIC） 根據(jù)美國(guó)藥物敏感性試驗(yàn)方法適當(dāng)改動(dòng)，通過(guò)96孔微量培養(yǎng)板測(cè)定鏈霉菌Sa-21粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌的MIC。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為6 400、3 200、1 600、800、400、200、100、50、25和12.5 μg·mL-1的母液，備用。菌液準(zhǔn)備：將過(guò)夜培養(yǎng)的青枯雷爾氏菌菌液先稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋ň簼舛燃s為（1—2）×108cfu/mL），再稀釋100倍，備用。將粗浸膏母液用B培養(yǎng)基稀釋100倍，吸取100 μL加至96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板中，第1列加入64 μg·mL-1的粗浸膏溶液，第2列加入32 μg·mL-1的粗浸膏溶液，直至第10列加入0.125 μg·mL-1的粗浸膏溶液，第11列加入100 μL甲醇-B培養(yǎng)基混合液（1%甲醇，V/V），第12列加入200 μL甲醇-B培養(yǎng)基混合液（1/200甲醇，V/V），接著在第1列至第11列，加入100 μL的稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液（（1—2）×106cfu/mL），每孔總量為200 μL，使得最終第1列至第10列粗浸膏濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625 μg·mL-1，第11列為陽(yáng)性對(duì)照，判斷青枯雷爾氏菌是否正常生長(zhǎng)，第12列為陰性對(duì)照，判斷培養(yǎng)過(guò)程是否污染，將96孔板置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)22 h，觀察并記錄生長(zhǎng)情況，用酶標(biāo)儀檢測(cè)600 nm處的吸光值，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.4.3 粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化的影響 由1.4.2測(cè)定結(jié)果確定Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC值。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、2×、10×、20×、50×和100×MIC的母液，備用。菌液準(zhǔn)備：將過(guò)夜培養(yǎng)的青枯雷爾氏菌菌液稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋ň簼舛燃s為（1—2）×108cfu/mL）備用。取1 mL的粗浸膏母液與98 mL的B培養(yǎng)基混勻，再加入1 mL稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液，使錐形瓶中粗浸膏終濃度分別為0、0.02×、0.1×、0.2×、0.5×、1×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，檢測(cè)青枯雷爾氏菌在不同濃度粗浸膏處理下的生長(zhǎng)繁殖情況，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 粗浸膏對(duì)菌體形態(tài)的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、4×、20×和40×MIC的母液，備用。菌液準(zhǔn)備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用5 mL的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、2×、10×和20×MIC，28 ℃處理4 h，經(jīng)過(guò)洗滌（PBS）-固定（2.5%戊二醛）-洗滌（PBS）-脫水（乙醇）-置換（叔丁醇）-冷凍干燥后，在掃描電鏡下觀察病菌形態(tài)是否變化，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.5 粗浸膏對(duì)膜通透性的影響 用乳糖類(lèi)似物2-硝基苯基--D-吡喃半乳糖（ONPG）檢測(cè)細(xì)胞膜上-半乳糖苷酶活性的變化。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、0.4×、1×、2×、4×、20×、40×MIC的母液，備用。菌液準(zhǔn)備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入500 μL濃度為30 mmol·L-1的ONPG，再加入PBS緩沖液至5 mL，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.2×、1×、2×、10×、20×MIC，另取10 mL的PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，28 ℃、160 r/min處理4 h，1 000 r/min離心3 min，取上清液測(cè)定420 nm處的吸光值，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用PBS緩沖液等體積重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×、1×、2×、10×和20×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下孵育4 h，取500 μL在1 000 r/min條件下離心3 min，菌體用1×PBS緩沖液等體積重懸，加入30 μL的碘化丙啶（PI）染料，避光孵育15 min，PI染料的激發(fā)波長(zhǎng)400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)615 nm[22]，熒光顯微鏡下觀察不同處理的樣品產(chǎn)生的熒光，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各處理熒光強(qiáng)度，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.6 粗浸膏對(duì)胞外多糖（EPS）的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0和20×MIC，備用。菌液準(zhǔn)備同1.4.3。取1 mL的粗浸膏母液與98 mL的B培養(yǎng)基混勻，再加入1 mL稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液，使錐形瓶中粗浸膏終濃度為0和0.2×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600的吸光值達(dá)到0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5時(shí)取出，每個(gè)吸光值處取10 mL放入50 mL離心管中，離心留上清，加入3倍體積的無(wú)水乙醇與上清液混合，過(guò)夜沉淀得到EPS沉淀，將沉淀離心收集，50 ℃烘箱中干燥，直至3次稱(chēng)量恒重[23]，記錄數(shù)據(jù)，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.7 粗浸膏對(duì)膜成分的影響 粗浸膏母液配制同1.4.5。菌液準(zhǔn)備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用等體積的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×和20×MIC，28 ℃處理4 h，10 000 r/min離心3 min后用PBS沖洗3次，棄上清液，加入500 μL的2.5%戊二醛重懸，4 ℃條件下固定過(guò)夜，離心留菌體，用30%—90%的梯度乙醇（每20%為一個(gè)梯度）進(jìn)行脫水，每次脫水30 min，再用無(wú)水乙醇處理30 min，離心留菌體，脫水后用叔丁醇置換3次，每次20 min，最后一次留少量叔丁醇重懸菌體，置于冷凍干燥儀中干燥過(guò)夜，干燥后的菌體使用傅里葉紅外光譜儀通過(guò)壓片法測(cè)定光譜數(shù)據(jù)，再用OMNIC 7.3對(duì)膜成分的變化進(jìn)行分析，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.8 粗浸膏對(duì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、1×、2×、4×、20×和40×MIC的母液，備用。菌液準(zhǔn)備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用等體積的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×、1×、2×、10×和20×MIC，28 ℃、160 r/min處理4 h，取500 μL在1 000 r/min條件下離心3 min，菌體用無(wú)菌水等體積重懸，加入30 μL的2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），避光孵育15 min，DCFH-DA的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，通過(guò)熒光顯微鏡觀察不同處理的樣品產(chǎn)生的熒光，熒光強(qiáng)度由熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 目標(biāo)菌株對(duì)煙草青枯病的防治效果

1.5.1 煙草植株的培育 選取易感本氏煙作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。從保存的種子中選取顆粒飽滿(mǎn)的煙草種子播種在土壤中，噴灑無(wú)菌水至土壤濕潤(rùn)，用保鮮膜密封保濕培養(yǎng)，待其長(zhǎng)至3真葉時(shí)轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的育苗盆中培育。育苗盆尺寸為口徑7 cm、底徑5 cm、高7.3 cm，一個(gè)育苗盆種植一株煙草，每盆裝土至盆口鋪滿(mǎn)，用土約130 g。培養(yǎng)條件：光周期L﹕D=14 h﹕10 h、溫度（28±1）℃、相對(duì)濕度75%—85%。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)10 d左右，一周?chē)姙⒁淮螤I(yíng)養(yǎng)液，植株高度達(dá)到8—10 cm時(shí)，備用。

1.5.2 目標(biāo)菌株對(duì)煙草青枯病的防治效果 挑選長(zhǎng)勢(shì)大小一致的煙草成熟植株進(jìn)行試驗(yàn)，將青枯雷爾氏菌稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋ǎ?—2）×108cfu/mL），采用不傷根接種法接種病菌，每株煙草灌根接種15 mL菌液。設(shè)置對(duì)照1（CK1）、對(duì)照2（CK2）、處理1（T1）、處理2（T2）4種處理，每處理分3組，一組5株，共計(jì)60株煙苗，觀察植株21 d內(nèi)的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。具體處理方式：對(duì)照1（CK1），不接種病菌，施加等量的高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基稀釋液處理（高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基稀釋10倍，下同）；對(duì)照2（CK2），接種病菌，施加等量的高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基稀釋液處理；處理1（T1），先接種病菌，24 h后再施加發(fā)酵濾液稀釋液（發(fā)酵濾液稀釋10倍，下同）于根部（施加3次，每次15 mL，間隔1 h）；處理2（T2），先施加發(fā)酵濾液稀釋液于根部（施加3次，每次15 mL，間隔1 h），24 h后再接種病菌。對(duì)煙草青枯病進(jìn)行病情分級(jí)[24]，詳見(jiàn)表2。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；病情指數(shù)=∑[（各級(jí)病株或葉數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級(jí)值）]×100；防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

表2 煙草青枯病的病情分級(jí)

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，利用IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（＜0.05），選擇SNK（Student-Newman- Keuis）進(jìn)行多重比較，最后通過(guò)Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的分離與篩選

通過(guò)共培養(yǎng)法對(duì)分離得到的106株放線菌進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示Sa-21、Sa-48、Zl-5、Hs-17和Yl-76菌株能夠有效抑制青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)，菌餅周?chē)霈F(xiàn)直徑分別為（36.4±1.3）（31.2±1.7）（30.7±0.9）（25.4±1.5）（18.5±1.4）mm（圖1-A1—E1）的抑菌圈，說(shuō)明Sa-21菌株菌餅拮抗效果最好。同時(shí)，用牛津杯法對(duì)上述5種菌株進(jìn)行復(fù)篩，抑菌圈直徑分別為（47.9±1.4）（18.7±1.2）（12.2±0.8）（11.8±0.6）（10.3±0.9）mm（圖1-A2—E2），同樣表明Sa-21菌株拮抗效果最好。綜合兩種篩選方式結(jié)果，表明Sa-21菌株對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制作用最強(qiáng)，因此，選擇Sa-21菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 Sa-21菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 Sa-21菌株在5種菌落特征培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，菌落凸起，多呈粉堆狀，菌落顏色多為白色，且菌絲與培養(yǎng)基之間連接不緊密，易于刮落，菌絲不產(chǎn)生可溶性色素，生長(zhǎng)速率情況見(jiàn)表3，其中在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）上生長(zhǎng)速度較快，菌絲豐富，在察氏固體培養(yǎng)基、葡萄糖天門(mén)冬素瓊脂培養(yǎng)基和甘油天門(mén)冬素瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）上生長(zhǎng)速度較慢，菌絲相對(duì)稀疏，但在察氏固體培養(yǎng)基上的菌落邊緣放射狀明顯。埋片法觀察Sa-21菌株的顯微結(jié)構(gòu)，氣生菌絲多分枝，菌絲中間無(wú)隔（圖2-A），能產(chǎn)生大量孢子，孢子絲緊密螺旋（圖2-B、2-C）。

2.2.2 生理生化特征 將Sa-21菌株接種至生理生化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表4所示。Sa-21菌株具有較強(qiáng)的分解淀粉、尿素和蛋白質(zhì)能力，能產(chǎn)生纖維素酶、脂肪酶和過(guò)氧化氫酶；MR和V-P試驗(yàn)陰性，不能產(chǎn)生黑色素和硫化氫；碳、氮源利用的結(jié)果顯示（表5），Sa-21菌株在所測(cè)定的碳源中都能夠生長(zhǎng)，當(dāng)唯一碳源為-乳糖、D-麥芽糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較為旺盛，在以蛋白胨、硝酸鉀、賴(lài)氨酸、亮氨酸、組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，但不能利用谷氨酸。

A1—E1：共培養(yǎng)法初篩Co-culture method for primary screening；A2—E2：牛津杯法復(fù)篩Oxford cup method re-screening。A1, A2: Sa-21; B1, B2: Sa-48; C1, C2: Zl-5; D1, D2: Hs-17; E1, E2: Yl-76

表3 Sa-21菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

A：光學(xué)顯微鏡下的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲Aerial mycelium and substrate mycelium under light microscope；B：光學(xué)顯微鏡下的孢子絲Chains of spores under light microscope；C：掃描電子顯微鏡下的氣生菌絲和孢子絲Aerial mycelium and chains of spores under scanning electron microscope

表4 Sa-21菌株生理生化特性

-：無(wú)該能力或試驗(yàn)結(jié)果陰性no ability or negative test results；+：有該能力或試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性Having the ability or positive test results

表5 Sa-21菌株在不同的碳源和氮源中的生長(zhǎng)情況

-：不能利用該種碳源或氮源this type of carbon source or nitrogen source can not be utilized；+：利用該種碳源或氮源能力一般the utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is average；++：利用該種碳源或氮源能力較強(qiáng)the utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is stronger；+++：利用該種碳源或氮源能力強(qiáng)The utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is strong

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析及鑒定 將得到的Sa-21菌株16S rDNA（PP391014）測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步鑒定為鏈霉菌，再將（PP429284）、（PP429282）和（PP429283）3個(gè)管家基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，取同源性較高的不同菌種的序列與Sa-21菌株序列通過(guò)MEGA 11采用鄰接法多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示，最終Sa-21菌株與雷帕鏈霉菌聚在同一分支，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定Sa-21菌株為雷帕鏈霉菌。

2.3 鏈霉菌Sa-21拮抗青枯雷爾氏菌活性及對(duì)其生理特征的影響

2.3.1 粗浸膏的制備 通過(guò)大量發(fā)酵培養(yǎng)獲得鏈霉菌Sa-21發(fā)酵液共15 L，用有機(jī)試劑乙酸乙酯反復(fù)萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到暗紅色膏狀物質(zhì)7.32 g，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 最低抑菌濃度（MIC） 通過(guò)96孔板法[25]測(cè)定鏈霉菌Sa-21粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的陽(yáng)性對(duì)照（第11列）渾濁，表明有青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照（第12列）澄清，表明培養(yǎng)過(guò)程無(wú)雜菌污染，而不同濃度的粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌的影響也不同，從第1列（32 μg·mL-1）至第7列（0.5 μg·mL-1）微孔液體透明，不渾濁，從第8列（0.25 μg·mL-1）至第10列（0.0625 μg·mL-1）液體出現(xiàn)不同程度的渾濁，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，如圖4所示，≥0.5 μg·mL-1濃度的吸光值與陰性對(duì)照無(wú)顯著性差異，表明無(wú)青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)，該數(shù)據(jù)與96孔板現(xiàn)象一致，因此0.5 μg·mL-1即為Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC。

2.3.3 生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) 根據(jù)2.3.2 MIC值設(shè)定0、0.01、0.05、0.1、0.25和0.5 μg·mL-1共6個(gè)粗浸膏濃度，測(cè)定36 h內(nèi)青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示（圖5），加入粗浸膏的處理組青枯雷爾氏菌菌體數(shù)量明顯低于對(duì)照組，并且隨著粗浸膏濃度增加，菌體開(kāi)始增長(zhǎng)的時(shí)間表現(xiàn)出滯后現(xiàn)象，增長(zhǎng)速率明顯降低，指數(shù)增長(zhǎng)期縮短，當(dāng)粗浸膏濃度達(dá)到0.5 μg·mL-1時(shí)，青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，表明Sa-21菌株粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌的增殖有抑制作用，并且隨著粗浸膏濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。

CK1：陽(yáng)性對(duì)照，加入菌液，但不加入粗浸膏Positive control, adding bacterial liquid, but not adding crude extract；CK2：陰性對(duì)照，不加入菌液和粗浸膏Negative control, not adding bacterial liquid and crude extract

圖5 不同濃度粗浸膏處理下青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化

2.3.4 粗浸膏對(duì)菌體形態(tài)的影響 細(xì)胞形態(tài)對(duì)于病原菌侵染植物至關(guān)重要，形態(tài)的改變會(huì)導(dǎo)致菌體無(wú)法正常增殖、識(shí)別以及結(jié)合等。用不同濃度的粗浸膏處理青枯雷爾氏菌，并在掃描電鏡下觀察菌體表面形態(tài)變化。未處理過(guò)的青枯雷爾氏菌菌體飽滿(mǎn)，表面光滑無(wú)褶皺，菌體生長(zhǎng)良好，完整無(wú)破裂（圖6-A），Sa-21菌株粗浸膏處理后的菌體形態(tài)發(fā)生改變（圖6-B—D紅色箭頭所指），部分菌體表面出現(xiàn)破洞、皺縮和扭曲變形等現(xiàn)象，并且隨著粗浸膏濃度的升高，菌體破裂數(shù)量增加，皺縮程度增強(qiáng)。表明Sa-21菌株能夠直接作用于青枯雷爾氏菌的菌體表面，很可能引起病原菌的代謝紊亂，最終導(dǎo)致菌體死亡。

A：未處理Untreated (CK)；B—D：粗浸膏濃度分別為1、5、10 μg·mL-1 The concentration of crude extract was 1, 5 and 10 μg·mL-1, respectively

2.3.5 粗浸膏對(duì)膜通透性的影響-半乳糖苷酶是微生物普遍存在的一種胞內(nèi)酶，細(xì)胞內(nèi)膜通透性的改變會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)的-半乳糖苷酶泄漏，并與外源加入的2-硝基苯基--D-吡喃半乳糖（ONPG）反應(yīng)形成黃色化合物鄰硝基苯酚（ONP），該物質(zhì)在420 nm處有吸收值[26]。通過(guò)對(duì)420 nm處的吸光值測(cè)定結(jié)果表明（圖7），經(jīng)過(guò)0.1、0.5、1 μg·mL-1粗浸膏處理后的細(xì)胞內(nèi)膜通透性與對(duì)照無(wú)顯著差異，但當(dāng)濃度升至5 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)膜通透性顯著改變，吸光值增至0.083，而當(dāng)濃度升至10 μg·mL-1時(shí)，吸光值為0.108，接近陽(yáng)性對(duì)照的兩倍，表明Sa-21菌株能夠影響青枯雷爾氏菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性，并且隨著粗浸膏濃度的增加，內(nèi)膜通透性增加。

PI是一種膜不透性的熒光染料，活細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)阻礙該染料的進(jìn)入，但當(dāng)細(xì)胞膜通透性改變時(shí)，PI染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸結(jié)合[27]，因此，可以通過(guò)PI染料的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷膜通透性是否受損。如圖8所示，從熒光顯微鏡中可以觀察到，對(duì)照組基本不顯示熒光，表明細(xì)胞生長(zhǎng)正常，膜通透性較低，而經(jīng)過(guò)10 μg·mL-1粗浸膏處理菌體發(fā)出大量紅色熒光，說(shuō)明經(jīng)過(guò)粗浸膏處理后，青枯雷爾氏菌膜通透性增加，熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9，隨著處理的粗浸膏濃度增加，熒光強(qiáng)度升高，表示膜通透性逐漸增加，膜透性的改變不僅會(huì)使細(xì)胞外物質(zhì)侵入，還會(huì)使胞內(nèi)物質(zhì)大量流失，導(dǎo)致菌體無(wú)法正常生長(zhǎng)。

CK1：不加菌液的PBS緩沖液PBS buffer without bacterial solution；CK2：未處理Untreated

A：未處理Untreated (CK)；B：處理組Treatment group (10 μg·mL-1)

2.3.6 粗浸膏對(duì)胞外多糖（EPS）的影響 由圖10所示，對(duì)照組的EPS質(zhì)量隨著青枯雷爾氏菌菌群濃度的增加而增加，處理組的EPS呈同樣趨勢(shì)，不同的是，兩組試驗(yàn)起始值（OD600=0.25）相差不大，均在0.1 g左右，但隨著菌群濃度的增加，在同一菌群密度的條件下，處理組的EPS質(zhì)量相對(duì)對(duì)照組有一定的減少，表明粗浸膏的存在一定程度上阻礙了青枯雷爾氏菌EPS的產(chǎn)生，而且時(shí)間越長(zhǎng)，菌群濃度越大，這種差異就越明顯，當(dāng)OD600=1.25時(shí)，處理組的EPS被抑制了23.2%。表明鏈霉菌Sa-21菌株能夠抑制青枯雷爾氏菌EPS的產(chǎn)生。

CK：未處理Untreated。下同The same as below

2.3.7 粗浸膏對(duì)膜成分的影響 有機(jī)體的生命活動(dòng)伴隨著細(xì)胞的新生和死亡，在細(xì)胞死亡中又分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，細(xì)胞凋亡通常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞和染色質(zhì)的收縮，而細(xì)胞壞死往往會(huì)引起膜透性改變、DNA降解以及功能喪失[28]，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)解析，可以利用該技術(shù)分析細(xì)胞不正常死亡引起的成分變化。將處理后的青枯雷爾氏菌用FTIR測(cè)定500—4 000 cm-1的光譜數(shù)據(jù)，該范圍區(qū)域分別代表脂質(zhì)（2 800—3 000 cm-1）、蛋白質(zhì)（1 480—1 800 cm-1）、核酸和多糖（900—1 250 cm-1）[29]，結(jié)果如圖11所示，青枯雷爾氏菌的光譜數(shù)據(jù)在1 060.175、1 220.238、1 540.363、 1 644.982和3 279.358位置發(fā)生了偏移，表明處于以上光譜位置的成分發(fā)生了改變，如表6所示，3 279.358位置可能包含某些多糖，這與關(guān)于EPS的改變結(jié)果相符。表明鏈霉菌Sa-21粗浸膏會(huì)導(dǎo)致青枯雷爾氏菌表面膜成分變化。

圖10 粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌胞外多糖的影響

2.3.8 粗浸膏對(duì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的影響 胞內(nèi)ROS的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，通過(guò)2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）與ROS反應(yīng)，可以生成2,7-二氯熒光素（DCF），該物質(zhì)可以發(fā)出綠色熒光。結(jié)果顯示（圖12），對(duì)照組的青枯雷爾氏菌只有少數(shù)的菌體發(fā)出綠色熒光，而經(jīng)過(guò)粗浸膏處理的青枯雷爾氏菌發(fā)出大量熒光，表明菌體內(nèi)有較多的ROS產(chǎn)生。同時(shí)，將孵育的樣品置于熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)，結(jié)果（圖13）與熒光顯微鏡情況一致，對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為5.235，而經(jīng)過(guò)粗浸膏處理的青枯雷爾氏菌熒光強(qiáng)度隨粗浸膏濃度的增加而增加，當(dāng)粗浸膏濃度為10 μg·mL-1時(shí)，熒光強(qiáng)度為20.65，遠(yuǎn)高于對(duì)照組，說(shuō)明鏈霉菌Sa-21粗浸膏會(huì)導(dǎo)致青枯雷爾氏菌的胞內(nèi)ROS增加，改變菌體膜的性質(zhì)，從而造成菌體的氧化損傷[30]。

圖11 粗浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌成分影響的FTIR圖譜

表6 粗浸膏處理后的青枯雷爾氏菌傅里葉變換紅外的振動(dòng)峰分配

A：未處理Untreated (CK)；B：處理組Treatment group (10 μg·mL-1)

2.4 鏈霉菌Sa-21對(duì)煙草青枯病的防治效果

Sa-21菌株的發(fā)酵液對(duì)煙草青枯病具有較好的防治效果。陰性對(duì)照（CK1）植株生長(zhǎng)正常，陽(yáng)性對(duì)照（CK2）植株接種青枯雷爾氏菌后發(fā)病率為86.68%，病情指數(shù)28.15，通過(guò)施加Sa-21菌株發(fā)酵濾液稀釋液可以顯著降低煙草植株的病理情況，其中T1組發(fā)病率和病情指數(shù)分別為60.02%和8.89，T2組發(fā)病率和病情指數(shù)分別為26.64%和3.70，兩組最終防治效果分別為67.61%和85.89%，此外，先施加發(fā)酵濾液稀釋液防治效果優(yōu)于先接種，表明預(yù)防處理是防止煙草青枯病發(fā)生的更好選擇（表7）。

圖13 粗浸膏促進(jìn)青枯雷爾氏菌ROS的積累

表7 Sa-21菌株發(fā)酵濾液對(duì)盆栽煙草青枯病的防治效果

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在＜0.05水平差異顯著

The data are mean±SD, and different lowercases after the data indicate significant differences at＜0.05 level

3 討論

3.1 鏈霉菌代謝產(chǎn)物價(jià)值

鏈霉菌的種類(lèi)繁多，其代謝產(chǎn)物豐富多樣，在多個(gè)領(lǐng)域都有研究和應(yīng)用的價(jià)值。Zheng等[31]從病害嚴(yán)重的土壤中篩選到鏈霉菌FJAT-31547，盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株使番茄枯萎病和青枯病的發(fā)病率分別降低80.59%和76.92%，且對(duì)番茄植株有促生作用；Ling等[32]從土壤中篩選到一株放線菌，經(jīng)鑒定為鏈霉菌屬的一種，對(duì)于番茄青枯病有較好的防治效果，并且從其代謝產(chǎn)物中分離出放線菌素D，該物質(zhì)對(duì)于青枯病有顯著的預(yù)防作用；JIANG等[33]研究表明鏈霉菌可抑制南方根結(jié)線蟲(chóng)（），明顯減少線蟲(chóng)和植物根部卵團(tuán)的數(shù)量。此外，鏈霉菌所產(chǎn)生的聚酮化合物對(duì)于流感病毒有抑制活性，表明這些化合物可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[34]。Sa-21菌株于浙江省金華市浙江師范大學(xué)校園香樟根際土壤分離得到，該菌株發(fā)酵液抑菌圈達(dá)47.9 mm，并對(duì)多種其他病原真菌和病原細(xì)菌有抑制作用，其發(fā)酵液提取的粗浸膏MIC值為0.5 μg·mL-1。Promnuan等[35]分離得到的放線菌DSC3-6粗提物能夠抑制青枯雷爾氏菌，MIC值為32 μg·mL-1，本研究中鏈霉菌Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC值更低。

3.2 生物防治機(jī)制

生物防治主要是依靠胞外產(chǎn)物的產(chǎn)生、誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抗性增加以及植物根際定殖等來(lái)抑制病原菌對(duì)植物的危害[36]。Chen等[37]研究了解淀粉芽孢桿菌FJAT-2349所分泌的脂肽對(duì)青枯雷爾氏菌的抗菌活性，結(jié)果顯示，純化后的泛革素對(duì)青枯雷爾氏菌有抗菌活性，且脂肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)青枯病的生防效果達(dá)97.6%；Shiva等[38]報(bào)道了番茄植株與青枯雷爾氏菌和假單胞菌互作時(shí)，番茄植株防御基因表達(dá)增強(qiáng)；Achari等[39]研究了內(nèi)生細(xì)菌在茄子根際定殖對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)接種后的細(xì)菌會(huì)在根際土壤和植物內(nèi)生組織如根面、皮層和木質(zhì)部導(dǎo)管有不同程度的定殖，這種定殖可以防止青枯病對(duì)茄子的危害；Elsayed等[40]研究了植物、拮抗菌、根際微生物群落和青枯菌之間的復(fù)雜關(guān)系，結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌（）B63和假單胞菌P142可以降低青枯病菌在番茄根際的豐度，并且接種后的根際群落結(jié)構(gòu)變化，這可能引起植物對(duì)青枯病的防御。芽孢桿菌和假單胞菌對(duì)病原菌和植物的影響機(jī)制目前已逐漸清晰，但鏈霉菌對(duì)青枯雷爾氏菌致病機(jī)制的影響尚未完全了解，Xue等[41]研究表明，由白黃鏈霉菌（）TD1產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物能夠增加青枯雷爾氏菌的膜通透性和細(xì)胞壁完整性，抑制病原菌核酸和蛋白質(zhì)的合成。本文探究了鏈霉菌Sa-21對(duì)青枯雷爾氏菌膜通透性的影響，并對(duì)胞外多糖（EPS）產(chǎn)生、菌體表面膜成分以及胞內(nèi)活性氧（ROS）進(jìn)行了分析，結(jié)果表明Sa-21粗浸膏能夠?qū)е戮w變形、扭曲，膜通透性增加和內(nèi)容物外漏，這很大程度會(huì)導(dǎo)致菌體形態(tài)改變甚至菌體死亡。EPS等物質(zhì)是青枯雷爾氏菌致病力的關(guān)鍵因子，病菌菌體和EPS可以堵塞植物的維管束[42-43]，對(duì)EPS的測(cè)定結(jié)果表明，Sa-21能夠抑制青枯雷爾氏菌EPS的產(chǎn)生。而對(duì)菌體表面成分分析結(jié)果與前人結(jié)果相符，糖類(lèi)等物質(zhì)成分有所改變，同時(shí)，胞內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致青枯雷爾氏菌受到氧化損傷。

4 結(jié)論

鏈霉菌Sa-21能抑制青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)，對(duì)菌體和細(xì)胞膜有明顯的破壞作用，還能降低青枯雷爾氏菌胞外多糖合成，使其胞內(nèi)活性氧增加。盆栽試驗(yàn)表明鏈霉菌Sa-21能夠有效防治煙草青枯病，且預(yù)防效果好于治療效果。Sa-21菌株有望開(kāi)發(fā)成為一種新的生物防治菌劑。

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LIAO XinLin, GUO Xin, YANG JiXue, SHAO JiaZhu, YUAN XinYu, HU JiaYan, CHEN XiaoXiao, JIANG DongHua

College of Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321000, Zhejiang

【Objective】Tobacco bacterial wilt caused byis the main disease of tobacco in cash crops. In this paper, the actinomycetes with strong antagonism againstwere screened from the soil of different habitats, and their antibacterial mechanism and biocontrol effect were determined, which provided a theoretical basis for the further development of anti-disease microbial agents.【Method】After screening the target actinomycetes by co-culture method and Oxford cup method, the target strain was identified by morphological studies, physiological and biochemical experiments and polygenic phylogenetic analysis. The minimum inhibitory concentration (MIC) of actinomycetes crude extract againstwas determined by the 96-well plate method. After co-culture treatment ofwith crude extract, the growth dynamics ofwere detected and the morphological changes ofwere observed. The effects on membrane permeability and membrane composition were observed by measuring-galactosidase activity and propidium iodide (PI) fluorescence experiments and Fourier transform infrared spectroscopy. The antibacterial activity and mechanism of target actinomyces antagonisticwere preliminarily explored by measuring protein synthesis, extracellular polysaccharides (EPS), intracellular reactive oxygen species (ROS), and so on. The effect of the target actinomycetes on tobacco bacterial wilt control was determined by pot experiments.【Result】According to the morphological characteristics, physiological and biochemical experimental results and sequencing results, the target actinomyces strain Sa-21 was identified as, and the diameter of the inhibition zone againstwas 47.9 mm. The results of mechanism experiments showed that the minimum inhibitory concentration of Sa-21 strain crude extract inhibitingwas 0.5 μg·mL-1, which also had a significant inhibitory effect on bacterial proliferation, and the inhibitory effect increased with the increase of crude extract concentration in the test range. Scanning electron microscopy showed that the structure ofchanged after crude extract treatment, resulting in perforation and shrinkage of the bacteria, and with the increase of the concentration of crude extract in the test range, the number of ruptured bacteria increased, and the degree of shrinkage increased. After crude extract treatment, propidium iodide could pass through the cell membrane and bind to intracellular substances to fluoresce, and the activity of-galactosidase was significantly increased, indicating that the permeability of the cell membrane ofwas improved. Further studies showed that crude extract treatment could lead to the accumulation of intracellular reactive oxygen species and the decrease of extracellular polysaccharide production in, indicating that the cell membrane was damaged to a certain extent. The results of potted plant disease control test showed that the relative control effect of 10-fold dilution of fermentation filtrate of treatment group was 67.61%, while the relative control effect of 10-fold dilution of fermentation filtrate of prevention group was 85.89%.【Conclusion】Sa-21 can inhibit the proliferation ofand destroy the cell membrane structure, which has a good control effect on tobacco bacterial wilt, and has certain development potential and application value.

;; actinomycete; biological control

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.009

2023-09-22；

2024-01-11

浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃（LGN22C140004）

廖鑫琳，E-mail：1546109773@qq.com。郭鑫，E-mail：gx1121gx@163.com。廖鑫琳和郭鑫為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者蔣冬花，E-mail：jdh@zjnu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）