周小合 譚 紅 李寶花 張潤(rùn)玲 吳祥林 夏成靜

中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明) 1 檢驗(yàn)科 2 神經(jīng)內(nèi)科,廣東省深圳市 518106

隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物使用不斷增多,導(dǎo)致深部真菌感染疾病而增多,然而支氣管和肺臟是最常受累臟器。肺真菌病以曲霉菌感染為主。曲霉菌以腐物寄生的方式存在于自然界中,以煙曲霉菌最為常見,占80%～90%[1]。有研究報(bào)道,曲霉性肺炎的病死率為 56%～88.1%[2]。研究表明早期識(shí)別早期抗真菌治療生存率可以提高80%以上[3]。然而,傳統(tǒng)檢測(cè)手段已不能滿足臨床早期診斷的需求;因此,迫切需要建立早期快速發(fā)現(xiàn)曲霉菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新方法。近年來(lái),免疫磁性分離技術(shù)應(yīng)用于病原體檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、易行、分離純度較高、可保持靶物質(zhì)活性等?？墒狗稚⒃跇悠分械纳倭坎≡w富集,且富集流程僅需要10min～1h[4]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于曲霉菌富集方法的研究比較少。本研究免疫磁珠技術(shù)是對(duì)煙曲霉菌富集方法的探究。制定免疫磁珠最佳加入量和煙曲霉菌最佳孵育時(shí)間,同時(shí)對(duì)此研究方案進(jìn)行敏感度和特異性的驗(yàn)證,以制定完善的煙曲霉菌富集研究方法,為以后曲霉菌快速、早期檢測(cè)技術(shù)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及抗體。白念珠菌(ATCC10231)、煙曲霉菌(ATCC16907)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、大腸埃希菌(ATCC25922):菌株來(lái)源省臨檢中心和菌種保存中心,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代保存;抗半乳甘露聚糖單克隆抗體:Creative Diagnostics公司。

1.1.2 磁珠。DynabeadsTMM-280 Tosylactivated微珠:賽默飛公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑。沙保氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(CBA):廣州迪景公司;BupHTM MES緩沖液干粉包:賽默飛。

1.2 儀器 MJ-250霉菌培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)公司;LMQ.C壓力蒸汽滅菌器:山東新華公司;QL-866振蕩儀:其林貝爾公司;鑫貝西生物安全柜:博科公司;磁力架:浙江寧波佳合誠(chéng)科技公司;HH-S恒溫水浴鍋:濟(jì)南歐萊博公司;醫(yī)用低溫保存箱:Biobase有限公司;BX43生物顯微鏡:奧林巴斯公司;質(zhì)譜儀:布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 煙曲霉菌菌種的活化及懸液配置。取出超低溫保存的煙曲霉菌株,接種于SDA培養(yǎng)基,28℃真菌恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)出菌落后挑取菌落,用生理鹽水配制菌懸液,使煙曲霉菌分生孢子充分懸浮于鹽水中,均質(zhì)化后配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫葻熐咕鷳乙骸?/p>

1.3.2 免疫磁珠添加量的確定。分別取抗半乳甘露聚糖單克隆抗體免疫磁珠(30mg/mL)10、30、50、80、100、120、140、170、190μL,加到1 000μL經(jīng)稀釋至104cfu/mL的煙曲霉菌懸液中,充分混勻后,在37℃輕輕振蕩孵育30min;將離心管置于磁力架,靜置2min,棄上層液體。加入1mL PBS緩沖液輕輕重懸,在磁力架上靜置2min,移除上層液體,重復(fù)操作2次。最后加入1mL PBS緩沖液振蕩混勻重懸磁珠,吸取10μL涂布于SDA平板,置于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d觀察菌落并計(jì)數(shù)。

1.3.3 免疫磁珠與煙曲霉菌液最佳反應(yīng)時(shí)間。分別取抗半乳甘露聚糖單克隆抗體免疫磁珠(30mg/mL)100μL,加到1 000μL經(jīng)稀釋至104cfu/mL的煙曲霉懸液中,輕微振蕩搖勻;放37℃孵育,分別孵育反應(yīng)15、30、45、60、120min;磁珠重懸、吸附、再接種平板重復(fù)1.3.2富集操作步驟。

1.3.4 免疫磁珠富集煙曲霉菌的敏感性實(shí)驗(yàn)。將配置好0.5麥?zhǔn)蠞岫葻熐咕鷳乙?按10倍配比稀釋,每個(gè)濃度進(jìn)行定量培養(yǎng)計(jì)數(shù)。取10μL接種SDA平板,28℃ 培養(yǎng)3d觀察菌落并計(jì)數(shù)。另取抗半乳甘露聚糖單克隆抗體磁珠(30mg/ml)100μL,分別加到1 000μL各濃度煙曲霉菌懸液中,輕微振蕩混勻,置37℃孵育30min;按照1.3.2步驟磁珠重懸、吸附。再加入10μL PBS緩沖液振蕩重懸磁珠,吸取10μL涂布于SDA平板,置于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d觀察菌落并計(jì)數(shù)。

1.3.5 免疫磁珠富集煙曲霉菌特異性驗(yàn)證。把100μL抗半乳甘露聚糖單克隆抗體免疫磁珠,分別加入1mL經(jīng)稀釋至104cfu/mL的常見病原體:煙曲霉、白念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌懸液中。充分混勻后,置37℃ 40r/min振蕩孵育反應(yīng)30min后;按照1.3.2步驟磁珠重懸、吸附。再吸10μL重懸磁珠涂布于CBA培養(yǎng)基;同時(shí)吸未富集前各種菌懸液10μL涂布于CBA培養(yǎng)基;置28℃培養(yǎng)3d觀察菌落并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁珠添加量的確定 隨著免疫磁珠量的增多,煙曲霉菌生長(zhǎng)越旺盛,而在磁珠量約為100μL時(shí),煙曲霉菌繁殖生長(zhǎng)的菌落數(shù)量最多,此時(shí)煙曲霉菌富集效果最好。若當(dāng)加入的磁珠量過多,煙曲霉菌生長(zhǎng)狀態(tài)菌落數(shù)變少,富集效果不是最佳,可能是出現(xiàn)了帶現(xiàn)象,確定免疫磁珠100μL是富集最佳量。見表1。

表1 免疫磁珠添加量與煙曲霉菌生長(zhǎng)菌落數(shù)關(guān)系

2.2 免疫磁珠與煙曲霉菌液最佳孵育時(shí)間 免疫磁珠與煙曲霉菌富集孵育最佳時(shí)間為30min。若富集時(shí)間延長(zhǎng)或縮短,均能使抗原抗體結(jié)合的親和力減小,增加非特異性反應(yīng)等。見表2。

表2 免疫磁珠孵育時(shí)間與煙曲霉菌生長(zhǎng)菌落數(shù)關(guān)系

2.3 免疫磁珠富集煙曲霉菌的敏感性實(shí)驗(yàn) 將0.5麥?zhǔn)蠞岫葻熐咕?按照10倍稀釋梯度逐步稀釋到10-6,然后對(duì)各個(gè)稀釋度菌液,富集前、后各取10μL涂布SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后觀察菌落并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。當(dāng)菌懸液稀釋度為10-5時(shí),直接涂布接種SDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)3d無(wú)煙曲霉菌生長(zhǎng);但菌液稀釋度為10-6免疫磁珠富集煙曲霉菌后,再涂布SDA平板培養(yǎng)依然能夠檢出,免疫磁珠富集煙曲霉菌培養(yǎng)檢出率明顯優(yōu)于直接培養(yǎng)法。說明此富集方法極大提高了檢測(cè)敏感性。

表3 各稀釋度富集前、后的敏感性實(shí)驗(yàn)

2.4 免疫磁珠富集煙曲霉菌的特異性實(shí)驗(yàn) 將100μL抗半乳甘露聚糖單克隆抗體免疫磁珠,分別加入相同濃度梯度的煙曲霉菌、白念珠菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌菌液中,陰性對(duì)照(生理鹽水)。經(jīng)2次重懸洗滌、富集、培養(yǎng)、鑒別;實(shí)驗(yàn)表明煙曲霉菌經(jīng)磁珠富集后培養(yǎng),比直接接種培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)顯著增加;其他病原菌經(jīng)此免疫磁珠富集后培養(yǎng),相比直接培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)明顯減少或未檢出;陰性對(duì)照(生理鹽水)尚未檢出,說明此免疫磁珠富集方法特異性強(qiáng)。見表4。

表4 各病原菌富集前、后培養(yǎng)計(jì)數(shù)

3 討論

曲霉菌是一種環(huán)境腐生菌,對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件要求低,一般在20～50℃潮濕和碳源充足的環(huán)境中可生存。而在臨床工作中,曲霉病臨床樣本的陽(yáng)性檢出率偏低。有研究數(shù)據(jù)表明,在侵襲性肺曲霉菌病患者痰液中,分離出曲霉菌的陽(yáng)性率僅為8%～34%,即使在肺泡灌洗液中,陽(yáng)性率也只有50%[5]。曲霉菌的分離率不高,推測(cè)可能與臨床樣本留取類型或采樣時(shí)機(jī)有關(guān),也有可能與檢驗(yàn)人員缺乏對(duì)病史的了解,培養(yǎng)條件或時(shí)間不足有關(guān);在檢測(cè)手段方面?zhèn)鹘y(tǒng)涂片、培養(yǎng)方法,所需的檢測(cè)數(shù)量閾值較高,假陰性結(jié)果延誤早診早治。因此檢測(cè)領(lǐng)域用于曲霉菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法迫切需求。

近年來(lái),真菌抗原檢測(cè)技術(shù)方面得到廣泛應(yīng)用,G試驗(yàn)是檢測(cè) (1,3)-β-D 葡聚糖,其含量是大部分真菌感染共同的指標(biāo),但作為真菌檢驗(yàn)指標(biāo)假陽(yáng)性或假陰性的情況也時(shí)有發(fā)生[6],常用于無(wú)菌體液和血液檢查。半乳甘露聚糖(GM)試驗(yàn)也被歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)納入真菌感染的證據(jù)之一。GM是曲霉菌細(xì)胞壁上的多糖成分,但是有些藥物對(duì)GM試驗(yàn)干擾,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[7]。目前分子生物學(xué)技術(shù)、二代測(cè)序技術(shù)用于致病真菌的核酸檢測(cè)是研究熱點(diǎn),但儀器價(jià)格昂貴、檢測(cè)費(fèi)用高,難以在臨床推廣應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌富集技術(shù)是提升細(xì)菌檢測(cè)效果的有效途徑,免疫磁性分離技術(shù)已被用來(lái)富集和檢測(cè)各類致病細(xì)菌。劉珂等[8]研究建立的IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法性能良好。有研究報(bào)道,人排泄物中有幽門螺桿菌、尿液中血吸蟲循環(huán)抗原以及水體中的賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊等[9]。因真菌抗原性不同, 單克隆抗體針可特異性地檢測(cè)病理組織中的致病菌[10]。黃茜等研究提取曲霉菌GM作為抗原免疫BALB/c 小鼠,可獲得針對(duì)曲霉菌GM的單克隆抗體[11]。馬夢(mèng)男等[12]研究顯示,曲霉半乳甘露聚糖磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)方法性能良好。

本研究證實(shí)了當(dāng)免疫磁珠加入量為100μL、免疫磁珠和煙曲霉菌液孵育時(shí)間30min,免疫磁珠對(duì)煙曲霉菌的富集分離作用最強(qiáng)。該方法與傳統(tǒng)真菌檢測(cè)方法涂片、培養(yǎng)相比較有顯著優(yōu)勢(shì),提高了檢測(cè)敏感性和特異性,有助于早期煙曲霉菌感染的檢出效率。本研究是對(duì)引起侵襲性肺曲霉菌感染的主要病原體煙曲霉菌而設(shè)計(jì),此方案對(duì)于其他曲霉菌屬真菌富集技術(shù)是否可行,有待后續(xù)研究再進(jìn)一步分析評(píng)價(jià)。

綜上所述, 通過對(duì)免疫磁珠富集煙曲霉菌的方法和條件研究,確定了富集煙曲霉菌最佳的免疫磁珠量以及煙曲霉菌液最佳反應(yīng)時(shí)間?；谠摲椒ǖ慕?對(duì)此富集技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,經(jīng)驗(yàn)證此研究方案具有較高的敏感性和特異性。由此推測(cè)此研究,能夠應(yīng)用于早期煙曲霉菌感染常規(guī)檢測(cè)技術(shù)中,能提高曲霉菌檢出效率。