葉小輝

福建省光澤縣醫(yī)院泌尿外科 354100

腎癌占所有成人惡性腫瘤的2%～3%, 是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一[1],其中大約85%的腎癌是腎透明細胞癌(ccRCC)。免疫細胞調(diào)節(jié)腫瘤細胞進展,其逐漸成為腎細胞癌有效的治療靶點[2],相關(guān)靶基因及免疫檢查點的篩選及鑒定已成為晚期腎癌研究的熱點。亞甲基四氫葉酸脫氫酶2 (Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase-2,MTHFD2)調(diào)節(jié)活化 T 細胞中的嘌呤從頭合成和信號轉(zhuǎn)導,以促進增殖和炎性細胞因子的產(chǎn)生,是腫瘤潛在治療靶點[3]。然而,MTHFD2導致ccRCC細胞增殖和免疫浸潤的研究仍有待探索。本研究旨在探究MTHFD2在ccRCC中的預后價值及其表達與免疫浸潤的相關(guān)性,為ccRCC的診斷和預后尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從 TCGA 在線數(shù)據(jù)庫中(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載ccRCC的MTHFD2表達信息及相關(guān)臨床數(shù)據(jù),其中驗證隊列則采用了來自 EMBL-EBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/)的 E-MTAB-1980 隊列[4]。

1.2 MTHFD2在轉(zhuǎn)錄水平表達差異 利用 R 包(limma,ggplot2)分析了 TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中腎正常組織與腎透明細胞癌組織中MTHFD2轉(zhuǎn)錄水平的表達差異。

1.3 MTHFD2表達水平的生存分析 以數(shù)據(jù)庫采集的數(shù)據(jù)為基礎樣本,根據(jù)MTHFD2表達量的中位值,將病人分為2組:即MTHFD2高表達組和低表達組,以研究其表達與腫瘤總生存期、無瘤間期生存率及疾病特異性生存率的相關(guān)性。使用R語言的survminer和survival包描繪生存曲線。

1.4 MTHFD2表達的診斷價值分析 通過R包(pROC包、ggplot2包)對MTHFD2基因表達數(shù)據(jù)進行 ROC 曲線研究,并通過將其基因水平與臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合,構(gòu)建了諾模圖以估計病人的年生存率。

1.5 腫瘤免疫細胞浸潤與MTHFD2基因表達的相關(guān)性 利用TISCH在線數(shù)據(jù)庫 (http://tisch.comp-genomics.org/)探究單細胞水平的MTHFD2。TISIDB 在線網(wǎng)站(http://cis.hku.hk/TISIDB/)分析MTHFD2表達與腎細胞癌中淋巴細胞之間的相關(guān)性, CIBERSORT計算腎透明細胞癌中22種腫瘤浸潤免疫細胞的相對比率。R包(limma,ggplot2)分析MTHFD2高表達組和低表達組之間22種腫瘤浸潤免疫細胞比例的差異, MTHFD2表達與免疫檢查點分子間的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用R(4.2.2版本)統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析,各數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗和方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFD2的表達與ccRCC患者的臨床特征相關(guān) MTHFD2的mRNA在腎細胞癌組織高表達,差異具有重要統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖1a;MTHFD2表達與T、N、M分期呈現(xiàn)正向相關(guān)性,見圖1b～d;預示著MTHFD2高表達與ccRCC不良預后相關(guān)。

圖1 MTHFD2在ccRCC腫瘤組織及其不同T、N、M分期中的表達

2.2 MTHFD2的表達與ccRCC患者生存概率相關(guān) 與MTHFD2低表達的患者相比,MTHFD2高表達患者的總生存期、無瘤間期生存率及疾病特異性生存率明顯降低(P值均<0.05),見圖2a～c。E-MTAB-1980隊列作為獨立的驗證組,結(jié)果顯示MTHFD2高表達同樣降低腎細胞癌患者的總生存期(P<0.05),見圖2d。

圖2 MTHFD2的表達與腎透明細胞患者生存期的關(guān)系

2.3 MTHFD2表達對ccRCC具有診斷價值 ROC 曲線分析曲線下面積為0.817,表明MTHFD2具有一定的診斷價值,見圖3a。通過結(jié)合年齡、性別、種族等臨床信息,進行單因素以及多因素生存風險分析,最后運用有統(tǒng)計學意義的變量,構(gòu)建了諾模圖,見圖3b。

圖3 MTHFD2的表達在ccRCC中的ROC曲線圖及諾模圖

2.4 MTHFD2與免疫浸潤有關(guān) 單細胞水平的MTHFD2和ccRCC微環(huán)境之間的關(guān)系, 其中免疫細胞的分布情況見圖4a;據(jù)圖4b, MTHFD2在CD4+T細胞、CD8+T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、NK細胞、樹突狀細胞等多種免疫相關(guān)細胞中表達。

并且在ccRCC腫瘤組織中,CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞及巨噬細胞等免疫相關(guān)細胞的表達量與MTHFD2呈現(xiàn)了正向相關(guān)性,見圖5a。在MTHFD2高表達組中,記憶性CD4+T細胞、M0型巨噬細胞、γδT細胞明顯提高;但是,NK細胞、休眠肥大細胞則在MTHFD2低表達組中明顯增加,見圖5b。MTHFD2表達與腎透明細胞癌中免疫檢查點分子之間的關(guān)系,見圖5c。

圖5 MTHFD2與ccRCC免疫細胞浸潤及免疫檢查點相關(guān)

3 討論

腎癌是一種具有潛在高水平腫瘤異質(zhì)性和遺傳傾向的疾病,ccRCC是最常見的腎癌形式,其組織學特征包括富含脂質(zhì)和糖原的細胞質(zhì)沉積物增加,因此讓ccRCC引申了一個新的疾病概念,即代謝性疾病。細胞對缺氧或影響 von Hippel-Lindau(VHL) 腫瘤抑制基因的突變的反應穩(wěn)定了缺氧誘導因子轉(zhuǎn)錄因子,缺氧信號與葡萄糖攝取和糖酵解的直接聯(lián)系在腎癌中已被證實[5]。另外脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝等相關(guān)基因?qū)cRCC的調(diào)控作用在相關(guān)研究中已得到充分證實。本研究中的MTHFD2作為葉酸代謝的相關(guān)基因,為今后開發(fā)的專門針對 ccRCC 代謝組的藥物提供了新的見解。

免疫檢查點阻斷(Immune checkpoint blockade,ICB)是一種常用的免疫療法,并且已經(jīng)打開了癌癥治療的新格局[6]。免疫檢查點是調(diào)節(jié)T細胞功能的關(guān)鍵分子,其中附著于T細胞表面的程序性死亡受體及表達在腫瘤之上的配體被稱為“免疫檢查點”,免疫檢查點抑制劑(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)通過抑制二者的結(jié)合,從而提高宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊性。最新研究表明,在腎癌患者中,ICIs聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑能顯著提高患者生存率[7]。然而,仍有大多數(shù)患者未體驗到持久的臨床益處,因此合理篩選受益人群、準確預測治療反應的生物標志物的鑒定仍然是一個待解決的需求。MTHFD2作為新型代謝相關(guān)基因,擁有調(diào)節(jié)活化T細胞中的嘌呤產(chǎn)生的作用[5],而T細胞的耗竭被認為是腫瘤進展的一個重要因素。因此MTHFD2極有可能作為抗多種癌癥治療的新靶點,但暫未有其關(guān)于ccRCC的報道,因此本研究試圖探討ccRCC中MTHFD2表達與預后和免疫浸潤的相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)MTHFD2可獨立預測ccRCC的預后并影響腫瘤進展,還可刺激免疫細胞如CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞及巨噬細胞等的浸潤。先前研究表明MTHFD2影響許多腫瘤的進展和治療,并與較差的預后及免疫浸潤相關(guān)[8-9],這與本研究顯示相符。MTHFD2亦能通過上調(diào) PD-L1誘導癌癥免疫逃逸[10],且本研究發(fā)現(xiàn)其與CTLA4、CD80等其他免疫檢查點呈現(xiàn)出高度正相關(guān)。其中CTLA-4 作為T細胞抑制蛋白,對免疫調(diào)節(jié)同樣重要,缺乏CTLA-4所引發(fā)的自身免疫早被證實是致命的[11];它是一種在活化的 T 細胞表面表達的抑制性免疫檢查點,它與CD80、CD86結(jié)合后 可抑制T細胞活化,進而參與免疫檢查點阻滯,誘導腫瘤細胞的免疫逃逸。盡管腎癌中ICB和過繼性T細胞療法的臨床成功證明了CD8+T 細胞介導抗腫瘤反應的潛力,但在某些情況下腫瘤仍在進展[12];甚至有研究表明在腎細胞癌中的T細胞浸潤與預后不良相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)諸多免疫細胞上MTHFD2表達量頗高,遂推測MTHFD2作為一種促癌因子,使免疫細胞反應性增多,并通過某種機制逆轉(zhuǎn)免疫細胞正常功能,使其產(chǎn)生不良預后。因此筆者認為靶向MTHFD2能調(diào)節(jié)免疫細胞功能,是一種潛在的治療方法。

總之,本研究采用了相關(guān)生物信息學分析,首次闡明MTHFD2在ccRCC中的表達情況,以及其與臨床病理、免疫細胞的相關(guān)性。然而,本研究樣本量較小,且僅為異質(zhì)性患者,存在一定的局限性,仍需擴大樣本量,并進行相關(guān)的體外及體內(nèi)實驗以驗證以上結(jié)論,并探索出具體的作用機制。