李經(jīng)堂 涂樂佳 陳 淼 魏 鵬 周璟瑜

江西省人民醫(yī)院(南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院) 1 創(chuàng)傷急救科 2 血管外科,江西省南昌市 330006 ; 3 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科

骨缺損是指骨組織中連續(xù)的骨結(jié)構(gòu)喪失,骨組織完整性被破壞進(jìn)而影響骨骼強(qiáng)度和功能[1]。外科手術(shù)是目前治療骨缺損的常用手段,主要是將自體或異體骨組織移植到骨缺損部位并應(yīng)用人工材料輔助支撐及修復(fù),但自體骨來源有限,異體骨移植可能會(huì)出現(xiàn)排異反應(yīng)等并發(fā)癥導(dǎo)致植骨失敗,同時(shí)手術(shù)有局部感染和術(shù)后愈合不良的風(fēng)險(xiǎn),在臨床應(yīng)用上有一定局限性[2-3]。祖國醫(yī)學(xué)博大精深,中醫(yī)藥治療骨科疾病經(jīng)驗(yàn)豐富,傳統(tǒng)中藥用于骨傷治療的歷史悠久,療效確切[4]。龍血竭是來源于百合科植物劍葉龍血樹樹脂的傳統(tǒng)中藥,具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效,對(duì)于扭傷、骨折、骨質(zhì)疏松等骨傷病癥均有較好療效[5-6]。龍血素B是其主要活性成分之一,研究表明,龍血素B可通過P38MAPK信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞增殖[7]。骨缺損的修復(fù)與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞相互協(xié)調(diào)作用密切相關(guān),而龍血素B對(duì)于成骨細(xì)胞的作用暫未見有文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?本研究培養(yǎng)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞),加入龍血素B單體共培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),觀察龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化、成骨能力的影響,并以P38MAPK信號(hào)通路為切入點(diǎn)探究其作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源和實(shí)驗(yàn)試劑 MC3T3-E1細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司,龍血素B、SB203580、茜紅素購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK8試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和龍血素B干預(yù)。MC3T3-E1細(xì)胞于-80℃冰箱中保存,取出凍存管置于37℃水浴鍋中快速解凍,酒精消毒后移入生物安全柜,配置含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液,使用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,接種于培養(yǎng)皿中,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～6代后,選取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,制備細(xì)胞懸液,調(diào)整密度為1.0×105個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔100μL,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)過夜;棄去原培養(yǎng)液,分別加入含龍血素B濃度為0、15、30、60、90、120μmol/L的完全培養(yǎng)基溶液各90μL,陰性對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基90μL,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。龍血素B干預(yù)24h、48h、72h后,棄去含藥培養(yǎng)液,每孔加入CCK-8溶液10μL,振蕩混勻,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h;酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長處吸光度(OD值),以此反映細(xì)胞增殖活性,增殖率=(OD加藥組-OD對(duì)照組)/OD對(duì)照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。取MC3T3-E1細(xì)胞,制備密度為1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于6孔板,每孔2mL。按上述步驟采用不同濃度及作用時(shí)間龍血素B干預(yù),消化收取細(xì)胞,離心后PBS洗2次,加入Binding Buffer重懸,按照細(xì)胞凋亡試劑盒方案染色,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.2.4 細(xì)胞分組。根據(jù)不同濃度及作用時(shí)間給藥干預(yù)后細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)結(jié)果,以MC3T3-E1細(xì)胞增殖率達(dá)到峰值的龍血素B濃度和作用時(shí)間為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板,按不同干預(yù)方式分為3組,空白組:常規(guī)培養(yǎng),不做任何干預(yù);龍血素B組:以最佳濃度及作用時(shí)間龍血素B干預(yù);龍血素B+阻斷劑組:以龍血素B+10μmol/L P38抑制劑SB203580干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后繼續(xù)棄去含藥培養(yǎng)液,更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含1%甘油磷酸鈉、0.2%抗壞血酸、0.01%地塞米松)繼續(xù)培養(yǎng),每3d換液。

1.2.5 各組細(xì)胞ALP活性測(cè)定。分別于干預(yù)結(jié)束后第1、3、5天測(cè)定各組細(xì)胞ALP活性。棄去培養(yǎng)液,PBS洗2次,加入細(xì)胞裂解液使細(xì)胞充分裂解,按試劑盒說明配制對(duì)硝基苯磷酸(PNPP)顯色底物溶液,樣品與底物在pH 10.3的反應(yīng)緩沖液內(nèi),37℃下反應(yīng)30min,加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm波長處吸光度(OD值),ALP活性與OD405值成正比。

1.2.6 qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞OPN、OCN、BSP基因表達(dá)水平。干預(yù)結(jié)束后,收取各組細(xì)胞,采用TRIzol法提取總RNA,依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲取cDNA,以cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參為GAPDH,OPN、OCN、BSP的mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.7 茜素紅染色法觀察各組細(xì)胞骨形成能力。干預(yù)結(jié)束后第21天對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色,觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況。棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞,加入95%酒精固定10min,PBS洗滌后使用0.1%茜素紅染色,避光孵育30min,去離子水洗去浮色,置于顯微鏡下觀察拍照,Image J軟件分析鈣化結(jié)節(jié)面積百分比。

2 結(jié)果

2.1 龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 同一時(shí)間點(diǎn),MC3T3-E1細(xì)胞增殖率與龍血素B濃度正相關(guān),藥物濃度為90μmol/L時(shí),細(xì)胞增殖率相比于藥物濃度較低時(shí)明顯升高(P<0.05),且與藥物濃度為120μmol/L時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);相同濃度下,龍血素B干預(yù)48h時(shí)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率明顯高于24h和72h(P<0.05)。見圖1。

圖1 龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

2.2 龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響 同一時(shí)間點(diǎn),MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率與龍血素B濃度負(fù)相關(guān),藥物濃度為90μmol/L時(shí),細(xì)胞凋亡率相比于藥物濃度較低時(shí)明顯降低(P<0.05),且與藥物濃度為120μmol/L時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);相同濃度下,龍血素B干預(yù)48h時(shí)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率明顯低于24h和72h(P<0.05),見表1?；?.1和2.2結(jié)果,選擇龍血素B濃度90μmol/L,作用時(shí)間48h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件。

2.3 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較 在干預(yù)后第1、3、5天時(shí),龍血素B組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性均高于空白組和龍血素B+阻斷劑組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較

2.4 各組MC3T3-E1細(xì)胞OPN、OCN、BSP基因表達(dá)水平比較 龍血素B組MC3T3-E1細(xì)胞OPN、OCN、BSP的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組和龍血素B+阻斷劑組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組MC3T3-E1細(xì)胞OPN、OCN、BSP基因表達(dá)水平比較

2.5 各組MC3T3-E1細(xì)胞骨形成能力比較 龍血素B組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域面積較空白組顯著增大,而龍血素B+阻斷劑組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域面積較龍血素B組顯著減小(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組MC3T3-E1細(xì)胞骨形成能力比較

3 討論

骨缺損一般由感染、創(chuàng)傷、腫瘤、骨質(zhì)代謝異常等因素引起,其癥狀與缺損部位和嚴(yán)重程度有關(guān),表現(xiàn)為疼痛、肢體畸形、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[8-9]。近年來,運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)方法提取分離中藥活性成分并進(jìn)行研究分析已成為熱門方向,單一活性成分即中藥單體的作用及機(jī)制研究對(duì)提升傳統(tǒng)中藥療效,減少副作用具有重要意義,已有多種中藥單體被證明對(duì)骨缺損的修復(fù)有促進(jìn)作用[10-11]。龍血素B是“活血圣藥”龍血竭中黃酮類的主要活性成分,相關(guān)研究顯示其具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化多種生物活性,對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、破骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖分化和功能發(fā)揮均有調(diào)控作用[12-13]。成骨細(xì)胞是人體骨組織的重要組成成分,也是參與骨形成的主要功能細(xì)胞,在骨骼生長發(fā)育及骨量維持方面扮演著關(guān)鍵角色。它來源于具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成、成熟及礦化后最終發(fā)展成為骨細(xì)胞,參與骨形成及骨修復(fù)[14]。本研究體外培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞,并分析其與龍血素B共培養(yǎng)時(shí)的增殖和凋亡情況,結(jié)果顯示,龍血素B可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,且效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,其促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞生長的最佳濃度和作用時(shí)間為90μmol/L、干預(yù)48h。而成骨細(xì)胞數(shù)量增加是骨基質(zhì)合成和骨組織生長的基礎(chǔ),提示龍血素B對(duì)骨的形成具有促進(jìn)作用。

MC3T3-E1細(xì)胞為成骨前體細(xì)胞,可分化為成熟成骨細(xì)胞,進(jìn)而合成分泌骨基質(zhì),并促進(jìn)鈣化和新骨形成,研究表明,P38MAPK信號(hào)通路對(duì)其成骨分化有重要影響[15]。為進(jìn)一步探究龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化和骨形成的影響,本研究使用龍血素B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并加入抑制劑SB203580阻斷P38MAPK信號(hào)通路,從細(xì)胞水平探討其刺激骨分化和骨形成的作用機(jī)制。ALP可促進(jìn)羥基磷灰石的沉積,是骨形成早期標(biāo)志物;OPN、OCN、BSP是成骨特定基因,其表達(dá)和相應(yīng)蛋白的合成可促進(jìn)羥磷灰石礦化的成核作用,并增加鈣結(jié)節(jié)形成,可反映MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化程度[16]。本研究結(jié)果顯示,龍血素B干預(yù)后,MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性和成骨相關(guān)基因表達(dá)水平均顯著升高,而阻斷P38MAPK信號(hào)通路后,MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性和成骨相關(guān)基因表達(dá)水平顯著下降,提示龍血素B可有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化,且這一作用與P38MAPK信號(hào)通路相關(guān)。成骨分化中晚期以鈣離子沉積為主,鈣結(jié)節(jié)形成越多,表明新骨形成能力越強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果顯示,龍血素B干預(yù)下,成骨誘導(dǎo)后MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域面積顯著增大,而加入P38MAPK阻斷劑后MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域面積顯著減小,表明龍血素B可通過P38MAPK信號(hào)通路在新骨形成過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

綜上所述,龍血素B可通過調(diào)控P38MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖,刺激成骨分化和骨形成。為臨床上骨缺損的治療提供新的思路和理論依據(jù),值得進(jìn)一步研究。