李 莉，楊春萍，商 輝*

（1.上海辰山植物園，華東野生瀕危資源植物保育中心，上海 201602；2.唐山漢沽管理區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，河北唐山 050701）

觀賞蕨類屬于觀葉植物，具有美化、彩化和凈化等功能。別具特色的觀賞特性、耐陰喜濕的生態(tài)習(xí)性使蕨類植物在園藝市場(chǎng)上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，需求量也逐漸增大。蕨類植物雖沒有艷麗的花朵，但在色彩、形態(tài)、習(xí)性等方面獨(dú)樹一幟。如：葉型奇特，從單葉至復(fù)葉；形體相差懸殊，小到匍匐地被，大到數(shù)米生長(zhǎng)，高大挺拔，生機(jī)盎然；孢子囊群造型獨(dú)特，圓形、腎形、線形等，其著生部位既有葉脈頂端、亦有葉中部位，變化多端，是種子植物不具備的觀賞價(jià)值。此外，蕨類植物的根狀莖、葉片、孢子囊也常常具備獨(dú)特的觀賞價(jià)值。

蕨類植物在園林綠化中的應(yīng)用形式多樣。在室內(nèi)以盆栽及微景觀形式應(yīng)用于大廳、主題會(huì)場(chǎng)、家庭及辦公室等；在城市建筑如商場(chǎng)、辦公樓、賓館的庭院綠化、陰生專類園、水景園、家庭庭院布置及城市園林綠化帶可使用蕨類植物作為地被及中下層植物[1-4]。

中國(guó)現(xiàn)有蕨類植物38 科，177 屬，2 215 種，228 個(gè)種下分類群，其中有1 200 余種屬于中國(guó)特有[5-6]。目前國(guó)內(nèi)觀賞蕨類在園藝市場(chǎng)上依舊呈現(xiàn)出種類少及應(yīng)用單一現(xiàn)象。觀賞蕨類植物相比種子植物占比極小，而野生蕨類植物的開發(fā)利用則是補(bǔ)充種類多樣性的有效途徑。

姬蕨（Hypolepis punctata）隸屬于碗蕨科（Dennstaedtiaceae）姬蕨屬（Hypolepis），生長(zhǎng)在熱帶亞熱帶區(qū)域，國(guó)內(nèi)主要分布于長(zhǎng)江中下游及以南地區(qū)，喜溫暖多濕半陰環(huán)境，在棄耕地、山谷溪流邊和林緣、林窗中經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)[7]，是園林觀賞和家庭種植的優(yōu)良物種。早在1994 年姬蕨就是英國(guó)最流行的觀賞蕨類植物之一[8]，但在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用幾乎沒有。姬蕨植株姿態(tài)飄逸優(yōu)美、適應(yīng)性強(qiáng)、易繁殖、資源量大，可以作為基礎(chǔ)種植材料應(yīng)用于園林綠化中，也可應(yīng)用于陰暗角落或高大喬木下較陰暗處，特別是在園林中較難處理的墻邊、籬邊、路邊的配置。飄逸優(yōu)美的羽狀復(fù)葉還可以作為切花配葉?？傊мЬ哂休^好的園藝市場(chǎng)應(yīng)用前景。

目前姬蕨的人工擴(kuò)繁以孢子萌發(fā)培養(yǎng)為主。由于配子體產(chǎn)生精子器和頸卵器的時(shí)期不同，甚至有些配子體可能一生只產(chǎn)生精子器，這使得在孢子批量混播的情況下，精卵結(jié)合絕大多數(shù)情況下發(fā)生在不同配子體之間，即配子體間。然而，園藝上進(jìn)行觀賞蕨類的培養(yǎng)，混播的方式很難保證性狀的穩(wěn)定性。為保持優(yōu)良蕨類品種的性狀穩(wěn)定性，許多蕨類開展了組培快繁技術(shù)，如波斯頓蕨[9]。可以通過對(duì)單個(gè)孢子進(jìn)行培養(yǎng)，或在配子體產(chǎn)生精子器和頸卵器前移栽進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，人為創(chuàng)造條件進(jìn)行配子體內(nèi)自交，從而保障品種性狀的穩(wěn)定性。但由于蕨類生活史的特性，配子體內(nèi)自交可產(chǎn)生基因組上所有等位基因完全的純合子，可能面臨著較嚴(yán)重的近交衰退[10]，因此該蕨類植物繁殖方案需要繁殖生態(tài)學(xué)的評(píng)估。

蕨類的擴(kuò)散，一般認(rèn)為是以風(fēng)力為主導(dǎo)，特別是一些大洋島嶼的蕨類植物分布證據(jù)，使得風(fēng)的長(zhǎng)距離傳播能力得以印證[11]。風(fēng)媒傳播下，單個(gè)孢子的傳播將不可避免，配子體上頸卵器成熟時(shí)將無(wú)法得到其他配子體的精子，而不得不進(jìn)行配子體內(nèi)自交。所以借助風(fēng)力進(jìn)行種群擴(kuò)張的同型孢子蕨類建立的新種群，配子體內(nèi)自交占主導(dǎo)，遺傳多樣性低下。許多試驗(yàn)證明，自交對(duì)于同型孢子的蕨類植物繁殖不利。人們普遍認(rèn)為蕨類植物孢子萌發(fā)后同配自交是有害的，異交才是蕨類配子體主要的繁殖模式[12-13]。

絕大多數(shù)蕨類植物產(chǎn)生同型孢子，即其孢子萌發(fā)產(chǎn)生的配子體既可以長(zhǎng)出精子器產(chǎn)生精子，也可以長(zhǎng)出頸卵器產(chǎn)生卵細(xì)胞，因此蕨類植物的交配模式可分為3 類：異配異交，即來(lái)源不同母本的配子體間的精卵結(jié)合；異配自交，即來(lái)源同一母本的配子體間的精卵結(jié)合；同配自交，即同一配子體間的精卵結(jié)合[10]。蕨類植物的孢子散播之后，大部分都散落在母株附近，只有小部分孢子長(zhǎng)距離散播到其他地方。近距離散播孢子發(fā)育成配子體后，周邊以來(lái)源于相同母株的配子體為主，少量同其他植株來(lái)源的配子體，所以交配模式以異配自交為主、異配異交為輔。長(zhǎng)距離散布的孢子，很難落在同種其他孢子旁邊，因此同配自交是其唯一可選擇的繁殖方式。由于遺傳負(fù)荷（致死基因或有害基因）的存在，推測(cè)同配自交產(chǎn)生的后代適應(yīng)性可能較弱，甚至直接死亡。但是如果同配自交發(fā)生概率高，可能會(huì)產(chǎn)生多代的過濾作用。即有害基因在長(zhǎng)期的迭代過程中已經(jīng)被淘汰，同配自交的適合率可能并不一定顯著低下。而在常規(guī)孢子培養(yǎng)中，蕨類的交配系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)生和質(zhì)量影響不夠重視，單獨(dú)孢子培養(yǎng)不常見，而通過混播孢子進(jìn)行蕨類繁殖，其后代可能來(lái)自于異配自交或異配異交，因?yàn)闊o(wú)法確定野外收集的孢子是否來(lái)自于不同植株，該文統(tǒng)稱它們?yōu)楫惻浠旖弧?/p>

該研究以姬蕨為材料，通過配子體單獨(dú)培養(yǎng)的方法，檢測(cè)同配自交是否產(chǎn)生嚴(yán)重的近交衰退，從而探討該方法在觀賞蕨類品種優(yōu)良性狀保持上是否具有可行性。

1 材料與方法

設(shè)計(jì)配子體培養(yǎng)試驗(yàn)，比較單獨(dú)配子體和多配子體的孢子體萌發(fā)，即同配自交與異配混交的萌發(fā)狀態(tài)（萌發(fā)率、存活率），孢子體成長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)速率。播種生長(zhǎng)情況及步驟如圖1。

圖1 兩種交配系統(tǒng)的處理及播種生長(zhǎng)情況

1.1 孢子采收與保存

姬蕨孢子來(lái)自于湖南桑植縣野外種群。采集孢子時(shí)，取其成熟且尚未開裂的孢子葉，去除葉面雜質(zhì)，置于干凈的信封或硫酸紙袋中，使用變色硅膠于封口袋中干燥5~10 d。收集孢子時(shí)，拍打信封或硫酸紙袋致使孢子得以充分脫落，并移至干凈的硫酸紙上，去除多余的葉片及孢子囊群蓋，即可用于培養(yǎng)，或?qū)⑵涫占陔x心管中，置于-20℃冰箱保存[14]。

1.2 播種方法及培養(yǎng)過程

播種時(shí)所需基質(zhì)選用經(jīng)過清水浸泡、剪碎的水苔，121℃滅菌鍋20 min，將滅菌后的水苔均勻鋪于組培瓶的底部，壓實(shí)，使水苔平整，厚度為2~3 cm，無(wú)菌水浸潤(rùn)，備用。取適量孢子置于2 mL 離心管中，加入5% NaClO 水溶液1 mL，靜置消毒5 min，8 000 r/min 離心5 min，待孢子沉淀后用無(wú)菌水沖洗3~5 遍，放入容器中制成懸濁液，均勻噴灑在組培瓶中的水苔上，加上透明蓋。保持培養(yǎng)微環(huán)境溫度為20℃~25℃，白熾燈光1 500 lx，光照12 h/d，濕度保持90%以上。一般5~10 d 后萌發(fā)長(zhǎng)出原絲體，后者不斷發(fā)育，形成多細(xì)胞原葉體。

1.3 配子體隔離培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

待配子體萌出后，性器官精子器未長(zhǎng)出之前進(jìn)行配子體的移植。移栽基質(zhì)選用腐殖土，用網(wǎng)孔直徑小于2 mm的細(xì)篩篩出，121℃滅菌鍋滅菌20 min[10]。后將基質(zhì)置于培養(yǎng)皿中，厚度為1 cm。將配子體移植到腐殖土上，使基質(zhì)濕潤(rùn)，加蓋。成熟配子體上精子器在播種后50 d 左右成熟，頸卵器55 d 左右成熟，卵細(xì)胞在播種后2~3 個(gè)月完成受精，受精卵發(fā)育成胚胎，進(jìn)而長(zhǎng)成幼孢子體。

其中移植單獨(dú)的配子體24 株于單獨(dú)的直徑9 cm 培養(yǎng)皿中，作為同配自交處理。另將24 個(gè)配子體按5×5 的網(wǎng)格（中間留空）排列移植于15 cm 的培養(yǎng)皿中，作為異配混交處理，如圖1。每天統(tǒng)計(jì)2 種交配系統(tǒng)萌發(fā)情況，包括萌發(fā)的正常幼孢子體數(shù)量及萌發(fā)時(shí)間記錄，連續(xù)統(tǒng)計(jì)36 d。計(jì)算2 種交配系統(tǒng)的幼孢子體的萌發(fā)率及萌發(fā)時(shí)間。同時(shí)每周記錄幼孢子體的存活情況，連續(xù)記錄7 周，計(jì)算幼孢子體的存活率。

1.4 孢子體移栽與測(cè)量

孢子播種120 d 后幼孢子體長(zhǎng)到3~5 cm 時(shí)，具有2~3 片真葉即可進(jìn)行分盆，移栽盆口徑5 cm 左右，基質(zhì)選用體積比5∶1 草炭土和蛭石。保持土壤濕潤(rùn)，環(huán)境溫度在15℃~25℃，自然光照10~12 h/d，噴水每天1 次，遮蔽保濕，濕度大于70%。做好盆土水分管理、病蟲害管理，以確保植物良好生長(zhǎng)。每天測(cè)量統(tǒng)計(jì)兩種交配系統(tǒng)孢子體生長(zhǎng)情況，包括葉片的數(shù)量、寬度及長(zhǎng)度，23 d 內(nèi)測(cè)量6次（第1、6、11、15、19 和23 天），并計(jì)算生長(zhǎng)速率和近交衰退系數(shù)（自交混交的差值除以混交的值）。自交和混交個(gè)體生長(zhǎng)速率的差異用SPSS 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)。待孢子體繼續(xù)長(zhǎng)到10 cm 以上，具有10 片以上真葉可換盆至口徑10 cm的盆器中培養(yǎng)，移栽時(shí)切記勿傷根，無(wú)須去除舊土。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同交配系統(tǒng)下孢子體萌發(fā)及存活率情況比較

姬蕨孢子隔離培養(yǎng)試驗(yàn)表明，在相同且適宜的人工培養(yǎng)條件下，姬蕨配子體單獨(dú)培養(yǎng)后，孢子體萌發(fā)率仍然較高，達(dá)到了87.5%；混合培養(yǎng)的孢子在萌發(fā)時(shí)間上早于單獨(dú)培養(yǎng)4 d，且最終孢子體萌發(fā)率為100%（圖2A）。在萌發(fā)出幼孢子體后，隨著時(shí)間的推移，自交的個(gè)體存活率在不斷下降，在最終的7 周統(tǒng)計(jì)時(shí)間內(nèi)，自交個(gè)體的存活率已經(jīng)下降到71.4%，最終存活率為62.5%（以配子體總數(shù)為基數(shù)），混交的存活率則依舊是100%（圖2B）。

圖2 兩種交配系統(tǒng)孢子萌發(fā)率（A）及存活率（B）

2.2 不同交配系統(tǒng)下萌發(fā)個(gè)體的生長(zhǎng)情況

姬蕨的孢子體幼苗經(jīng)過移栽后的生長(zhǎng)檢測(cè)表明，包括植物的葉片數(shù)量、長(zhǎng)度和寬度上一直弱于混交的配子體（圖3）。同時(shí)，自交的生長(zhǎng)速率也弱于混交個(gè)體（圖4），其中葉片長(zhǎng)度的生長(zhǎng)速率自交個(gè)體為（0.13±0.12）cm/d，混交個(gè)體為（0.17±0.07）cm/d（P=0.206）；葉片寬度的生長(zhǎng)速率自交個(gè)體為（0.06±0.04）cm/d，混交個(gè)體為（0.09±0.05）cm/d（P=0.036）；葉片數(shù)目的生長(zhǎng)速率自交個(gè)體為（0.1±0.08）片/d，混交個(gè)體為（0.19±0.11）片/d（P=0.003）。近交衰退系數(shù)分別為24.8%、35.1%和46%。

圖3 兩種交配系統(tǒng)幼孢子體生長(zhǎng)速率

圖4 兩種交配系統(tǒng)幼孢子體生長(zhǎng)速度

3 討論

3.1 同配自交存在近交衰退

單獨(dú)培養(yǎng)（同配自交）配子體上開始萌出孢子體的時(shí)間晚于混合培養(yǎng)（混交）配子體約4 d，這是因?yàn)轭i卵器約晚于精子器出現(xiàn)4~5 d，只有等到頸卵器出現(xiàn)后，才會(huì)發(fā)生配子體內(nèi)自交。單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的孢子體萌出速度大致相當(dāng)，最終混合培養(yǎng)的配子體全部萌出孢子體（100%），而單獨(dú)培養(yǎng)的孢子體萌出率為87.5%，即24 個(gè)配子體中有3 個(gè)配子體受精失敗或胚胎死亡，而萌出后又有6 個(gè)自交孢子體死亡。這些結(jié)果說(shuō)明相比于配子體間異交，配子體內(nèi)自交確實(shí)存在一定程度的致死率，總致死率為37.5%，配子體可能存在致死基因，在受精為孢子體后，由于形成純合子，在胚胎發(fā)育以及幼苗生長(zhǎng)階段發(fā)揮作用，導(dǎo)致胚胎和幼苗死亡。幼苗移栽后的生長(zhǎng)狀況，同配自交的孢子體弱于異配異交的孢子體，特別是葉片寬度和葉片數(shù)目具有顯著差異，這說(shuō)明同配自交具有近交衰退。

3.2 同配自交的近交衰退率對(duì)種群延續(xù)的影響

不同于種子植物有大孢子和小孢子的區(qū)別，蕨類具有同形孢子，也就是說(shuō)單個(gè)孢子產(chǎn)生的配子體既可以產(chǎn)生精子，也可以產(chǎn)生卵細(xì)胞。蕨類這種特殊的生活史，使得同配自交成為可能，其產(chǎn)生的孢子體基因組上所有的等位基因都會(huì)純合。對(duì)于完全純合的孢子體來(lái)說(shuō)，只要有一個(gè)位點(diǎn)存在有害基因就會(huì)發(fā)揮作用，特別地如果是致死基因，會(huì)直接導(dǎo)致死亡。而該結(jié)果表明，至少高達(dá)62.5%的孢子沒有致死基因（并不是所有的死亡都能歸結(jié)到致死基因，但沒有死亡可以說(shuō)明沒有致死基因），這說(shuō)明在野外條件下，單個(gè)孢子同配自交的情況也經(jīng)常發(fā)生，在強(qiáng)烈的自然選擇作用下，致死基因得到了有效清除。

而在幼苗生長(zhǎng)過程中，雖然同配自交的個(gè)體長(zhǎng)勢(shì)要弱一些。但以異配異交的個(gè)體為標(biāo)準(zhǔn)，同配自交的近交衰退率僅為24.8%~46%，這說(shuō)明在自然條件下，有害（非致死）基因也得到一定程度的清除，使得同配自交的后代仍然保持一定生活力，也使得單個(gè)孢子也能在很大概率上延續(xù)種群。筆者將在后續(xù)的培養(yǎng)過程中逐代檢測(cè)其生活力的變化趨勢(shì)。

3.3 配子體單獨(dú)培養(yǎng)在觀賞蕨類繁殖上的應(yīng)用前景

種子植物育種過程中，往往需要多代自交才可以得到穩(wěn)定的自交系，而對(duì)于蕨類植物來(lái)說(shuō)，一次同配自交就可以得到完全純合的個(gè)體，這是蕨類植物育種的優(yōu)勢(shì)。該試驗(yàn)所用的孢子皆來(lái)自于野外采集，其致死基因和有害基因已經(jīng)得到很大程度的過濾，在人工培養(yǎng)的情況下，可以繼續(xù)進(jìn)行人工選擇，盡最大程度地清除致死基因和有害基因，同時(shí)保留優(yōu)良基因，從而獲得有價(jià)值且生命力強(qiáng)壯的園藝品系。

該研究證明了姬蕨同配自交產(chǎn)生的后代仍然具有較高的生活力，通過單獨(dú)培養(yǎng)的方式可以在短時(shí)間內(nèi)得到完全純合的自交系植株，同時(shí)可以得到具有較高觀賞特性和遺傳穩(wěn)定的品系，可作為進(jìn)一步雜交育種的優(yōu)良親本，在園藝育種方向具有很好的應(yīng)用價(jià)值，為觀賞蕨類的育種提供理論支持。

致謝：感謝嚴(yán)岳鴻博士、王瑩、齊新萍、邵文在本研究過程中特別是在孢子繁殖方面給予的幫助；感謝潘向艷對(duì)論文修改的建議。