沈家林,許雨晴,曹若彤,郗春華,趙唯含

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

胃癌前病變(Precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)是指較易轉(zhuǎn)變?yōu)榘┙M織的病理學(xué)變化,對(duì)其施以有效干預(yù)是預(yù)防胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前的研究認(rèn)為幽門螺旋桿菌(HP)感染是PLGC的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[1-3],但根除HP往往并不能逆轉(zhuǎn)胃黏膜損傷[4]。有研究證實(shí)葉酸作為一種維生素,其有利于蛋白質(zhì)的合成,控制DNA合成,保持DNA的穩(wěn)定性和完整性,并修復(fù)異常的DNA甲基化和畸變,補(bǔ)充葉酸可能防止PLGC的進(jìn)一步惡化[5]。

PLGC癥屬中醫(yī)“胃脘痛”“痞滿”“反酸”“嘈雜”等范疇,本病主要由于情志失調(diào)、飲食不節(jié)、藥物、外邪等多種因素?fù)p傷脾胃所致[6-9]。金果胃康膠囊是國家級(jí)名中醫(yī)沈舒文教授治療PLGC的經(jīng)驗(yàn)方,該方基于PLGC瘀血與脾胃虛弱的病機(jī)特點(diǎn),攻補(bǔ)兼施,可顯著改善臨床癥狀,幫助修復(fù)胃黏膜損傷,但其作用機(jī)制尚不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),自噬參與了PLGC的發(fā)展,金果胃康膠囊可通過改善細(xì)胞的自噬水平起到修復(fù)胃黏膜的作用[10-11]。本研究擬觀察金果胃康膠囊對(duì)UNC-51樣激酶1(ULK1)/5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步明確金果胃康膠囊治療PLGC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠75只,體重(180±20)g,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(陜)2017-003,飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室,晝夜循環(huán)12 h,恒溫25 ℃,45%濕度。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):SUCMDL20190302002)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:金果胃康膠囊由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供(批號(hào)20190429);葉酸片(批號(hào)1905056);鹽酸雷尼替丁膠囊(批號(hào)20190004)。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG,批號(hào)M0527,日本TCI);無水乙醇(貨號(hào)10009218,國藥集團(tuán));ULK1(批號(hào)DF7588,Affiniy);胞漿胞核蛋白提取試劑盒(批號(hào)KGP150,南京凱基生物);兔單抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR(批號(hào)2603、2535、2983、5536,Cell Signaling Technology);HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(批號(hào)BA1051、BA1054,武漢博士德)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:電子天平(型號(hào)CPA,北京賽多利斯);離心機(jī)(型號(hào)HI650,湖南湘儀);生物顯微鏡(型號(hào)BX53,日本奧林巴斯);切片機(jī)(型號(hào)RM216,德國Leica);包埋機(jī)(型號(hào)B-P5,武漢俊杰);組織脫水機(jī)(型號(hào)JT-12J,武漢俊杰);微量分光光度計(jì)(型號(hào)Nano-100,杭州奧盛);PCR儀(型號(hào)EDC-810,東勝創(chuàng)新);紫外分析儀(型號(hào)JY02S,北京君意東方);酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiscan MK3,Thermo Fisher Scientific Inc.)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與給藥方法:75只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(12只)與造模組(63只)?？瞻捉M自由進(jìn)食飲水,造模組給予150 μg/ml的MNNG溶液避光自由飲用,每日灌胃雷尼替丁溶液0.03 g/kg,每7天斷食1次(16 h/次),次日給予45%乙醇溶液灌胃,1 ml/只,連續(xù)造模16周[12-13]。

確認(rèn)造模成功后將造模組大鼠運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、金果胃康高劑量組、金果胃康中劑量組、金果胃康低劑量組、葉酸組,每組12只?？瞻捉M與模型組大鼠每日灌胃0.9%氯化鈉溶液2 ml,金果胃康高、中、低劑量組每日分別予以含1.8、0.9、0.45 g/kg(按體表面積換算成人每日臨床等效劑量的2、1、0.5倍)的金果胃康溶液灌胃,葉酸組每日予以葉酸溶液2 ml灌胃,均連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.2 標(biāo)本采集:末次灌胃后禁食水16 h,腹腔注射10%水合氯醛,取出全胃并剪開,去除胃內(nèi)容物,胃竇部以4%多聚甲醛固定,石蠟包埋用于HE染色及免疫組化檢測(cè)。余組織液氮冷凍后-80 ℃保存,用于Western blot及qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HE染色觀察胃黏膜病理學(xué)變化:將固定好的胃竇組織進(jìn)行脫水-包埋-切片-脫蠟-染色-封片后,在光鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)ULK1蛋白水平:石蠟切片在3% H2O2中室溫孵育15 min,PBS沖洗后滴加山羊血清室溫封閉30 min,滴加一抗后4 ℃過夜。PBS沖洗后滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,然后滴加DAB顯色液。用Harris蘇木素復(fù)染、脫水、封片,顯微鏡下拍照觀察,陽性信號(hào)呈棕黃色或棕褐色。采用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化照片的光密度進(jìn)行分析。

1.2.5 qPCR檢測(cè)胃組織AMPK、mTOR mRNA:運(yùn)用Trizol試劑提取樣本總RNA,以微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度。RT兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,95 ℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán);60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。引物序列見表1。相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理使用2-ΔΔCt法。

表1 目的基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)胃組織AMPK、mTOR蛋白:提取胃組織總蛋白,用BCA法測(cè)定各大鼠胃組織蛋白含量,經(jīng)電泳分離,轉(zhuǎn)膜,TBST(封閉液)封閉2 h。一抗(1∶1000)4 ℃過夜,洗凈后置于二抗(1∶10000)工作液中,室溫孵育2 h,洗凈后顯色曝光,晾干并掃描膠片,用Band Scan分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示正態(tài)分布的計(jì)量資料,方差齊采用單因素方差分析,方差不齊則采用Welch檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃黏膜病理學(xué)改變 空白組黏膜排列較為規(guī)則、緊密,固有腺體形態(tài)分布較為整齊,極性好,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組黏膜上皮結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞體積增大,腺體輕度擁擠,排列紊亂,可見異型細(xì)胞,異型細(xì)胞區(qū)域與周圍組織分界清楚,核染色深。金果胃康高劑量組黏膜結(jié)構(gòu)較為完整,細(xì)胞排列整齊,固有腺分布較為均勻,未見充血、水腫和糜爛面。金果胃康中劑量組黏膜可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),固有腺相對(duì)減少。金果胃康低劑量組可見黏膜萎縮,排列紊亂,固有腺數(shù)量減少,極性差,核染色較深,可見異型細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),伴有柱狀上皮脫落。葉酸組黏膜情況和金果胃康低劑量組較為相似,其炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較為明顯。見圖1。

A:空白組;B:模型組;C:金果胃康高劑量組;D:金果胃康中劑量組;E:金果胃康低劑量組;F:葉酸組圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色,×100)

2.2 免疫組化法檢測(cè)ULK1蛋白 較空白組,模型組ULK1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。較模型組,各給藥組ULK1的蛋白表達(dá)水平均不同程度升高(P<0.05),其中金果胃康高劑量組、中劑量組以及葉酸組升高更明顯(P<0.01)。見圖2(表2)。

表2 各組大鼠ULK1蛋白表達(dá)比較

2.3 qPCR檢測(cè)胃組織AMPK、mTOR mRNA水平 模型組AMPK mRNA表達(dá)水平較空白組顯著降低(P<0.01)。金果胃康高、中劑量組及葉酸組AMPK mRNA表達(dá)水平較模型組均升高(P<0.05)。其中金果胃康高劑量組及葉酸組升高更明顯(P<0.01)。模型組mTOR mRNA表達(dá)水平較空白組顯著升高(P<0.01)。金果胃康高、中劑量組和葉酸組mTOR mRNA表達(dá)水平較模型組均明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠胃黏膜AMPK、mTOR mRNA表達(dá)比較

2.4 Western blot檢測(cè)AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的蛋白水平 模型組AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)水平較空白組顯著降低(P<0.01),金果胃康高、中劑量組和葉酸組AMPK的蛋白表達(dá)水平較模型組均明顯升高(P<0.01),金果胃康高劑量組和葉酸組p-AMPK的蛋白表達(dá)水平較模型組均明顯升高(P<0.01)。模型組mTOR及p-mTOR蛋白表達(dá)水平較空白組顯著升高(P<0.01),各給藥組mTOR及p-mTOR蛋白表達(dá)水平較模型組均降低(P<0.05)。見表4(圖3)。

A:空白組;B:模型組;C:金果胃康高劑量組;D:金果胃康中劑量組;E:金果胃康低劑量組;F:葉酸組圖3 各組大鼠胃黏膜組織AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白電泳條帶

表4 各組大鼠胃黏膜AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)比較

3 討 論

PLGC是指包含胃黏膜腺體萎縮、腸上皮化生和不典型增生/異型增生的病理學(xué)變化,早期防治PLGC是預(yù)防胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其主要臨床表現(xiàn)為胃脘痛、飽脹、噯氣、納差等[14-15]。中醫(yī)認(rèn)為PLGC的病因病機(jī)可分為本虛和標(biāo)實(shí)兩個(gè)方面,本虛以氣虛和陰虛為主,標(biāo)實(shí)則以血瘀為主,故應(yīng)遵循“益氣活血”的治療原則[6]。有研究表明,中藥通過辨證論治,可明顯改善PLGC患者臨床癥狀,改善胃黏膜病變[16-20]。國家級(jí)名中醫(yī)沈舒文教授根據(jù)中醫(yī)理論并結(jié)合臨證實(shí)踐認(rèn)為PLGC的核心病機(jī)是“毒瘀交阻”,即內(nèi)邪滋生與正氣虧損始終存在于疾病的全過程。虛以氣虛與陰虛為主,日久每致濕熱傷陰,最終氣滯經(jīng)血入絡(luò),毒瘀交阻胃絡(luò),即《臨證指南醫(yī)案》所謂:“凡氣既久阻,血亦應(yīng)病,循行之脈絡(luò)自痹”。沈舒文教授經(jīng)過多年臨床積累,結(jié)合中醫(yī)學(xué)理論,研制出金果胃康基本方,該方以半枝蓮為君藥,朱砂七為臣藥,佐以枸橘、太子參,四味藥物合用,共奏解毒化瘀、清解散滯、行氣破結(jié)、益氣養(yǎng)陰之功,具有良好的臨床療效[21-22]。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)部降解的復(fù)雜過程。自噬的分子機(jī)制涉及多個(gè)保守的Atg(自噬相關(guān))蛋白。營(yíng)養(yǎng)不足等各種刺激會(huì)導(dǎo)致吞噬泡的形成,這一步驟涉及兩種蛋白質(zhì)復(fù)合物:一種是含有Vps34、Beclin1、Atg14和Vps15的Vps34復(fù)合物[23];另一種是含有絲氨酸/蘇氨酸激酶ULK1的ULK1復(fù)合物,這是自噬體形成的重要正調(diào)控因子。磷酸化的ULK1是自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子,目前發(fā)現(xiàn)AMPK和mTOR這兩個(gè)激酶可催化ULK1的磷酸化,這兩種蛋白催化的特異性磷酸化活動(dòng)在自噬中起著重要作用[24]。在營(yíng)養(yǎng)饑餓條件下,AMPK有活性,而mTOR失活,AMPK會(huì)在Ser317、Ser467、Ser555、Ser574、Ser637和Ser777位點(diǎn)磷酸化ULK1,同時(shí)抑制mTORC1,從而促進(jìn)自噬。在營(yíng)養(yǎng)充足的時(shí)候,AMPK失活,mTOR在Ser757位點(diǎn)結(jié)合并磷酸化ULK1,防止AMPK激活ULK1,并破壞ULK1-AMPK相互作用,從而“關(guān)閉”自噬[25]。前期研究發(fā)現(xiàn),金果胃康膠囊可以降低P62蛋白表達(dá)、升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,參與調(diào)控細(xì)胞自噬,從而起到保護(hù)胃黏膜的作用[26]。在AMPK和mTOR調(diào)節(jié)自噬的過程中,AMPK因缺乏能量或營(yíng)養(yǎng)而激活ULK1,促進(jìn)自噬并抑制細(xì)胞生長(zhǎng),而mTOR營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富時(shí)抑制ULK1,抑制自噬并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),二者協(xié)同作用,維持著機(jī)體的平衡[27]。

本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)金果胃康膠囊干預(yù)后,各劑量組大鼠胃黏膜病變情況均有不同程度改善,其中以金果胃康膠囊高、中劑量組胃黏膜改善狀況最為顯著,表明金果胃康膠囊能有效改善胃黏膜病變的發(fā)展。模型組大鼠較空白組,AMPK蛋白及mRNA表達(dá)水平降低,mTOR蛋白及mRNA表達(dá)水平升高,p-AMPK及ULK1蛋白表達(dá)水平降低,p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高,說明在受到致癌物MNNG刺激后,ULK1同時(shí)受到mTOR激活和AMPK抑制的影響,使得自噬被抑制,胃黏膜損傷累積,這可能是PLGC發(fā)生的機(jī)制之一。金果胃康膠囊干預(yù)后,AMPK蛋白及mRNA表達(dá)水平升高,mTOR蛋白及mRNA表達(dá)水平降低,p-AMPK及ULK1蛋白表達(dá)水平升高,p-mTOR蛋白表達(dá)水平降低,說明金果胃康膠囊可能通過促進(jìn)AMPK的表達(dá),同時(shí)抑制mTOR,促進(jìn)自噬的發(fā)生,以清除受損細(xì)胞,促進(jìn)組織再生,起到治療PLGC,防止癌變的目的。

綜上,金果胃康膠囊可能通過調(diào)控ULK1/AMPK/mTOR信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬,修復(fù)胃黏膜,從而起到防治PLGC的作用。