楊 明,朱旭東,馬 波,盛夢鈺,蔡曉清,李海濤,邵軼群,葉和松

(1.南京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210017;2.沭陽縣中醫(yī)院,江蘇 宿遷 223600;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)臨床表現(xiàn)為腹壓增加時患者出現(xiàn)漏尿癥狀,發(fā)病人群主要為中老年女性。流行病學統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),SUI影響著50%以上中老年女性的日常生活[1-2]。該疾病嚴重影響患者的生活質(zhì)量,給患者心理和生理造成沉重負擔[3-5]。SUI發(fā)病機制較為復雜,目前認為SUI的發(fā)生主要與尿道括約肌解剖結(jié)構(gòu)異常和功能障礙以及尿道周圍的支撐和附屬結(jié)構(gòu)缺陷有關(guān)[6-7]。研究提示,SUI患者盆腔支撐組織中存在線粒體DNA(mtDNA)缺失和重排的累積,且隨著SUI病程的加重而明顯累積[8-9]。同時,線粒體質(zhì)控(MQC)高效運行的前提需確保線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整,MQC通過協(xié)調(diào)線粒體動力學的穩(wěn)定性以保障肌肉細胞的常規(guī)活動,因而MQC過程中斷是年齡或其他病因所致尿道括約肌功能障礙的潛在機制[10-11]。mtDNA突變和氧化損傷的累積,促進機體的老化,引起尿道支持結(jié)構(gòu)解剖及功能的異常,最終導致SUI的發(fā)生[12]。大量研究報道,針刺干預對SUI有較好的臨床療效,同時相關(guān)機制研究亦是如火如荼開展中[13-15],但鮮有關(guān)于電針調(diào)節(jié)盆底組織線粒體動力學從而治療SUI的作用機制研究。

課題組根據(jù)江蘇省名中醫(yī)顧兆軍主任創(chuàng)立的小腹三針(氣海、中極、關(guān)元穴)前期開展了大量的臨床和相關(guān)機制研究。臨床研究發(fā)現(xiàn),小腹三針治療可以協(xié)調(diào)SUI患者膀胱逼尿肌和尿道括約肌功能,提高尿道閉合壓[16-17]。根據(jù)代謝組學研究[18],推測電針氣海、中極、關(guān)元穴治療SUI的作用機制可能在于對線粒體功能的調(diào)控。為了進一步明確電針氣海、中極、關(guān)元穴對SUI尿道括約肌線粒體功能的影響,擬通過體內(nèi)實驗研究論證,探討電針改善SUI尿道括約肌病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠,雌性,SPF級,重180～220 g,鼠齡6～8周,購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2019-0002,動物飼養(yǎng)及操作按照南京市第一醫(yī)院實驗動物管理規(guī)定執(zhí)行,動物使用許可證號:SYXK(蘇)2021-0007,飼養(yǎng)條件為自然光照,溫度25 ℃,相對濕度70%,上述操作通過該實驗動物倫理委員會批準后實施,倫理號:QWSY-22144271。

1.1.2 實驗試劑:超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab65354、ab118970);琥珀酸脫氫酶(SDH)ELISA試劑盒(百奧萊博公司,貨號:SNM178);2.5%戊二醛(青島捷世康生物科技有限公司,貨號:RY0404);線粒體分離、膜電位、ATP含量相關(guān)試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab110171、ab112150和ab83355);RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab288006、ab102536);一抗:線粒體融合素1(Mfn1)、Mfn2、線粒體動力相關(guān)蛋白1(Drp1)、線粒體分裂因子(MFF)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和β-actin(英國Abcam公司,貨號:ab221661、ab205236、ab184247、ab129075、ab110304、ab106814和ab8226);二抗:辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(英國Abcam公司,貨號:ab172730)。

1.1.3 實驗儀器:針灸針(型號:0.25 mm×13 mm);電子針療儀(型號:SND-Ⅲ);尿動力學檢測儀(型號:UDS94,加拿大Laborie公司);微量恒流泵(型號:DP-S100,北京歐世盛科技有限公司);流式分析儀(型號:Cytoflex,美國Thermo Scientific);全波長酶標儀(型號:Multiskan Sky High,美國Thermo Fisher Scientific);垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號:1658033,美國BIO-RAD);全自動化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(型號:iBright CL1500,美國Thermo Fisher Scientific);透射電子顯微鏡(型號:H-7650,日本日立)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠造模與分組:50只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、假手術(shù)組、電針組、假針組,每組10只。模型組、電針組、假針組參照LIN等[19]造模標準進行大鼠陰道擴張合并雙側(cè)卵巢切除造模,具體造模步驟:經(jīng)10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉成功后的大鼠,取仰臥位并進行固定,向弗萊氏尿管球囊內(nèi)注入4 ml滅菌用水擴張陰道,導管深度為2～3 cm,行陰道縫合防止導尿管脫落,100 g重物進行垂吊牽拉,持續(xù)4 h;第7天對該組大鼠進行雙側(cè)卵巢切除;觀察7 d后開展噴嚏試驗,鑒別模型效果。假手術(shù)組:麻醉后打開腹腔,游離組織并找到卵巢,但不予摘除,然后縫合腹腔,與模型組給予相同的條件飼養(yǎng)。

1.2.2 干預方法:電針組選取氣海、中極、關(guān)元穴進行電針治療,根據(jù)《實驗針灸學》[20]定位。大鼠置于治療固定架上,針灸針(0.25 mm×13 mm)斜刺進針3 mm,接電針儀,疏密波,電流強度1～3 mA,頻率2～10 Hz,30 min/次,1次/d,連續(xù)治療14 d,治療期間根據(jù)大鼠狀態(tài)進行電流強度和電壓峰值調(diào)整。假針組:針刺氣海、中極、關(guān)元穴對照點(氣海、中極、關(guān)元穴旁開1 cm),電針條件同電針組?？瞻捉M、假手術(shù)組及模型組給予同等條件置于治療固定架,不進行任何處理。各組均使用0.9%NaCl溶液進行膀胱灌腸測定充盈性膀胱壓力。治療結(jié)束后取大鼠尿道括約肌組織。

1.2.3 尿流動力學檢測:麻醉成功后的大鼠進行操作區(qū)域無菌消毒,排空大鼠膀胱,0.7 mm輸液導管潤滑后插入膀胱,三通連接微量灌注泵(流量:0.3 ml/min)泵入滅菌用水和尿動力學檢測儀開機檢測。記錄漏尿點壓力(Leak point pressure,LPP)、最大膀胱容量(Maximal bladder capacity,MBC)和腹腔漏尿點壓力(Abdominal leak point pressure,ALPP),重復2次操作,取平均值。

1.2.4 HE染色觀察尿道括約肌形態(tài):干預結(jié)束后處死大鼠,獲取尿道括約肌組織,部分組織進行甲醛固定,制片。根據(jù)HE染色步驟按試劑盒逐步操作,顯微鏡下觀察尿道括約肌病理形態(tài)的改變。

1.2.5 尿道括約肌線粒體功能檢測:干預結(jié)束后,大鼠麻醉后主動脈放血處死,獲取尿道括約肌組織,制備組織勻漿,利用線粒體分離試劑盒提取純化尿道括約肌線粒體,并根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測線粒體膜電位(ΔΨm)和ATP水平。

1.2.6 尿道括約肌氧化應(yīng)激指標檢測:取凍存尿道括約肌組織制備組織勻漿,取上清液經(jīng)ELISA試劑盒檢測SOD、MDA及SDH含量,觀察尿道括約肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

1.2.7 尿道括約肌線粒體形態(tài)觀察:尿道括約肌組織經(jīng)歷戊二醛固定、磷酸漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、固化、制片和染色等相關(guān)過程,電鏡觀察線粒體形態(tài)改變。

1.2.8 Western blot檢測線粒體動力學相關(guān)蛋白:取尿道括約肌組織制備組織勻漿,RIPA混合裂解液裂解、分離,收集上清液。BCA試劑盒測定總蛋白濃度,主要步驟如下:20 μg蛋白孔上樣,凝膠電泳進行蛋白分離2 h,分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉、TBST漂洗,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。顯影,采集圖片并使用Image J對條帶進行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠尿動力學指標比較 空白組和假手術(shù)組大鼠ALPP、LPP、MBC比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、假針組和電針組大鼠上述三項指標顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項指標比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠上述三項指標水平顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿動力學指標比較

2.2 各組大鼠尿道括約肌組織形態(tài)變化 HE染色結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠尿道括約肌肌纖維排列有序、完整,周圍組織排列連續(xù)、致密;模型組肌纖維數(shù)量減少、變薄、排列無序,周圍組織顯著增多且疏松;假針組與模型組肌纖維及周圍組織形態(tài)無差異;電針組肌纖維增多、變厚、排列較有序,周圍組織減少,排列較致密,基本恢復正常。

圖1 各組大鼠尿道括約肌組織病理學改變(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌ATP含量和線粒體膜電位比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、電針組、假針組大鼠上述兩項指標顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述兩項指標比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠ATP含量及線粒體膜電位顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較

2.4 各組大鼠尿道括約肌氧化應(yīng)激指標比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌SDH和SOD活性及MDA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、電針組、假針組大鼠SDH和SOD活性顯著降低(均P<0.05),MDA水平顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項指標比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠SDH和SOD活性顯著升高(均P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠尿道括約肌SDH、SOD和MDA含量比較

2.5 各組大鼠尿道括約肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變 電鏡下各組大鼠尿道括約肌線粒體結(jié)構(gòu)顯示,手術(shù)解剖操作并未對尿道括約肌線粒體形態(tài)有任何影響,SUI可顯著導致尿道括約肌線粒體形態(tài)腫脹紊亂和部分空泡化。電針氣海、中極、關(guān)元穴可顯著改善SUI尿道括約肌線粒體形態(tài)腫脹紊亂和部分空泡化情況。見圖2。

圖2 各組大鼠尿道括約肌線粒體形態(tài)(×100)

2.6 各組大鼠尿道括約肌線粒體生物發(fā)生信號分子表達比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、假針組和電針組大鼠Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達顯著降低(均P<0.05),Drp1和MFF蛋白顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平顯著升高(均P<0.01),Drp1和MFF蛋白顯著降低(均P<0.01)。見表4(圖3)。

A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:假針組;E:電針組圖3 電針對SUI環(huán)境下尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達的影響

表4 各組大鼠尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達比較

3 討 論

在古籍中,并沒有關(guān)于SUI的確切名稱,但從腹壓增大時出現(xiàn)尿液漏出的癥狀來看,SUI可歸類為“小便不禁”“遺溺”“膀胱咳”等[21]。SUI多發(fā)生在中老年女性人群,故該病機多為脾腎不足,肺氣虛弱,膀胱氣化失司,其病位主要在腎、膀胱,與脾肺相關(guān)。顧兆軍教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗,基于“固本培元、溫腎止遺”理論創(chuàng)立小腹三針(氣海、中極和關(guān)元穴)[22]。中極穴下方散布著髂腹下神經(jīng)分支,髂腹下神經(jīng)對膀胱和直腸有著重要的支配作用,因此,針刺該穴位能夠改善膀胱功能,緩解小便功能障礙[23]。

前期研究結(jié)果提示,針灸治療參與調(diào)控SUI患者線粒體代謝平衡。線粒體是細胞的動力工廠,是一種雙膜細胞器,為細胞的各項活動提供ATP,線粒體功能的平衡對于肌肉功能的維持尤為重要[24]。首先,肌肉維持節(jié)律性收縮需要線粒體持續(xù)地提供足夠的ATP為其發(fā)揮生理功能;此外,肌肉細胞根據(jù)外界細胞因子或信號刺激迅速調(diào)節(jié)代謝功能狀態(tài),這需要線粒體保持穩(wěn)定的功能[25]。尿道括約肌屬于人體骨骼肌的一部分,其線粒體功能對肌肉功能的維持具有顯著的影響。但研究表明,骨骼肌損傷后,線粒體自噬通量減少,這會導致蛋白損傷和細胞器的累積,誘發(fā)過度炎癥[26]。由此可以推斷,尿道括約肌線粒體功能障礙或許與SUI病變的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

線粒體功能障礙的主要表現(xiàn)之一為線粒體膜電位的破壞,其膜電位的消散一般早于其他凋亡表現(xiàn),標志著細胞凋亡事件的早期啟動,一旦細胞開始進入凋亡狀態(tài),就會導致大量的能量損傷,從而促發(fā)線粒體膜電位顯著降低[27]。中醫(yī)藥調(diào)控線粒體功能障礙的研究亦取得顯著臨床療效和機制研究成果[28]。本次研究結(jié)果顯示,模型組中氧化應(yīng)激相關(guān)指標較空白組顯著改善,結(jié)果提示,氧化應(yīng)激啟動細胞凋亡促進SUI疾病的發(fā)生。與模型組比較,電針組線粒體膜電位、SDH、SOD活性及MDA水平顯著升高,提示電針能改善SUI環(huán)境下尿道括約肌細胞的線粒體功能障礙,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,抑制細胞凋亡。以上研究結(jié)果提示,SUI環(huán)境下尿道括約肌細胞的線粒體功能障礙,促進氧化應(yīng)激及細胞凋亡啟動,而電針可部分逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。

線粒體動力學主要的調(diào)控因子包括Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α等,上述調(diào)控因子共同調(diào)控線粒體的分裂和融合,進而調(diào)控線粒體功能和形態(tài)的改變[29]。本研究通過電鏡觀察尿道括約肌線粒體微觀結(jié)構(gòu)改變,手術(shù)解剖并未對線粒體形態(tài)有明顯影響,而SUI模型中線粒體形態(tài)腫脹嚴重,線粒體內(nèi)間隙顯著增寬、嵴走向明顯不規(guī)則,PGC-1α和Mfn1、Mfn2和SIRT1蛋白表達顯著降低,而Drp1和MFF蛋白表達顯著升高;電針組線粒體腫脹程度顯著改善,線粒體內(nèi)間隙增寬、嵴走向不規(guī)則情況顯著降低,模型組上述6種蛋白的表達得到部分逆轉(zhuǎn);上述研究結(jié)果提示,電針可改善SUI環(huán)境下尿道括約肌細胞的線粒體形態(tài)的病理學改變與功能損傷。

綜上所述,SUI可導致尿道括約肌細胞的線粒體形態(tài)的病理學改變與功能損傷。電針可通過改善SUI尿道括約肌線粒體功能和形態(tài)的相關(guān)表達因子和蛋白,從而改善線粒體的形態(tài)與功能障礙,進而改善SUI尿道括約肌病變。