周 凡，屈 云，譚家聲，張亞娟

(湖北省興發(fā)磷化工研究院有限公司，湖北 宜昌 443007)

蝦青素亦稱(chēng)蝦黃素，是一種酮式類(lèi)胡蘿卜素，廣泛存在于生物界中，具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)，抗氧化，抵御紫外線，增強(qiáng)人體免疫功能，改善視力、色素形成和神經(jīng)連通以及改善生育等作用，特別是抗氧化作用超強(qiáng)，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”。研究發(fā)現(xiàn)，很多種類(lèi)的藻類(lèi)都含有蝦青素。其中，雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素具有細(xì)胞繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易于提取的特點(diǎn)，且藻粉可直接應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)，降低成本，是目前公認(rèn)生產(chǎn)天然蝦青素最好的生物來(lái)源。

目前，檢測(cè)蝦青素含量的方法主要有分光光度法和液相色譜法[1-4]。因國(guó)內(nèi)更多企業(yè)對(duì)于蝦青素的測(cè)定方法更注重簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)等因素，故本文采用分光光度法測(cè)定蝦青素含量，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)比較了不同溶劑的提取效果，選擇了最佳提取溶劑二甲基亞砜，并對(duì)比了用二甲基亞砜做提取溶劑測(cè)定雨生紅球藻粉和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；ME-204E電子天平(梅特勒托利多)；Milli-Q超純水儀(Millipore)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司) ；Cenlee 16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；UltiMate3000液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(BWRM，BW1827-20mg，純度98.2%)，具有不同蝦青素含量的雨生紅球藻粉(山東金晶生物技術(shù)有限公司)，磷酸鹽(食品級(jí)，興發(fā)集團(tuán)湖北省興發(fā)磷化工研究院有限公司)，碳酸氫鈉(食品級(jí)，湖南銀橋食品添加劑有限公司)，檸檬酸鈉(食品級(jí)，大自然生物集團(tuán)有限公司)，食鹽(食品級(jí)，湖南省湘鹽化有限責(zé)任公司)，甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、二甲基亞砜、石油醚、二氯甲烷、叔丁基甲基醚，均為分析純，磷酸、氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純，天津科密歐公司，水為超純水。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 提取溶劑的選取

用天平稱(chēng)取5份蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2%的雨生紅球藻粉，放入 25 mL 的試管中。將 10 mL 的乙醇、丙酮、二甲基亞砜、石油醚、二氯甲烷分別加入到5個(gè)試管中。在常溫下提取 1 h 后，將溶液進(jìn)行旋蒸干燥，分別加入 10 mL 的二甲基亞砜溶液。將溶液置于分光光度計(jì)中 (吸收波長(zhǎng) 489 nm) 測(cè)定吸光度。

1.2.2 繪制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用二甲基亞砜作為溶劑，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品為溶質(zhì)，配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 1 cm 比色皿在分光光度計(jì)上 489 nm 處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣本溶液的制備

實(shí)驗(yàn)樣本是蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別約為2%、3%、4%、5%的雨生紅球藻粉原料Ⅰ、原料Ⅱ、原料Ⅲ、原料Ⅳ和雨生紅球藻粉(蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2%)與磷酸鹽、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、食鹽分別按質(zhì)量比1∶9配成的復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅱ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅲ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅳ。

精密稱(chēng)取樣品0.1～1 g(精確至 0.0001 g)左右于 50 mL 潔凈干燥的離心管中，使用 50 mL 二甲基亞砜少量多次萃取，直至樣品中無(wú)色素，每次倒入萃取溶劑后于50～52 ℃ 恒溫水浴鍋中至少靜置 10 min，分別固液分離，然后合并萃取液，再向合并的萃取液中加入二甲基亞砜定容 100 mL，避光靜置，測(cè)定所獲得溶液在 489 nm 處的吸光度值，計(jì)算樣品中蝦青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4 回收率試驗(yàn)

以雨生紅球藻粉原料Ⅰ和復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ，同時(shí)進(jìn)行蝦青素三水平加標(biāo)回收測(cè)定，測(cè)定蝦青素回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選取

從圖1看出，5種不同溶劑對(duì)于蝦青素的提取效果差異明顯，其中二甲基亞砜溶液的提取效果最佳，所以選擇二甲基亞砜溶液為最宜提取溶劑。

圖1 不同溶劑的提取效果

2.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

在最大吸收波長(zhǎng) 489 nm 處測(cè)得蝦青素各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值 (如圖2所示) ，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蝦青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二甲基亞砜溶液中蝦青素質(zhì)量濃度和吸光度之間的關(guān)系式為y=0.1657x+0.0087，R2=0.9997，線性關(guān)系良好。

圖2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 蝦青素含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比

分別用本方法和GB/T 31520—2015 《紅球藻中蝦青素的測(cè)定液相色譜法》測(cè)定雨生紅球藻粉Ⅰ和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ中蝦青素含量。從表1看出，本方法與國(guó)標(biāo)法比較，測(cè)定雨生紅球藻粉中蝦青素含量的誤差為0.02%～0.09%，測(cè)定含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的誤差為0.003%～0.011%。此方法能快速且準(zhǔn)確測(cè)定雨生紅球藻粉和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素的含量。

表1 蝦青素含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比

2.4 蝦青素回收率測(cè)定結(jié)果

從表2看出，雨生紅球藻粉中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.7%，含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.3%。

表2 蝦青素回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用蝦青素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，通過(guò)溶劑篩選選擇出最佳提取溶劑二甲基亞砜，在最大吸收波長(zhǎng) 489 nm 處利用分光光度法對(duì)雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量進(jìn)行測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的R2是0.9997，線性關(guān)系良好。本方法與GB/T 31520—2015比較，測(cè)定雨生紅球藻粉中蝦青素含量的誤差為0.02%～0.09%，測(cè)定含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的誤差為0.003%～0.011%。且用本方法雨生紅球藻粉中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.7%，含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.3%。本方法能用于雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量定量分析，方法操作簡(jiǎn)單、快速、不需要特別昂貴的檢測(cè)儀器，能夠滿(mǎn)足企業(yè)快速定量檢測(cè)雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的需要。