周 凡,屈 云,譚家聲,張亞娟
(湖北省興發(fā)磷化工研究院有限公司,湖北 宜昌 443007)
蝦青素亦稱(chēng)蝦黃素,是一種酮式類(lèi)胡蘿卜素,廣泛存在于生物界中,具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng),抗氧化,抵御紫外線,增強(qiáng)人體免疫功能,改善視力、色素形成和神經(jīng)連通以及改善生育等作用,特別是抗氧化作用超強(qiáng),被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”。研究發(fā)現(xiàn),很多種類(lèi)的藻類(lèi)都含有蝦青素。其中,雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素具有細(xì)胞繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易于提取的特點(diǎn),且藻粉可直接應(yīng)用于食品及飼料工業(yè),降低成本,是目前公認(rèn)生產(chǎn)天然蝦青素最好的生物來(lái)源。
目前,檢測(cè)蝦青素含量的方法主要有分光光度法和液相色譜法[1-4]。因國(guó)內(nèi)更多企業(yè)對(duì)于蝦青素的測(cè)定方法更注重簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)等因素,故本文采用分光光度法測(cè)定蝦青素含量,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)比較了不同溶劑的提取效果,選擇了最佳提取溶劑二甲基亞砜,并對(duì)比了用二甲基亞砜做提取溶劑測(cè)定雨生紅球藻粉和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的準(zhǔn)確性。
7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司);ME-204E電子天平(梅特勒托利多);Milli-Q超純水儀(Millipore);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司) ;Cenlee 16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司);RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(青島明博環(huán)??萍加邢薰?;UltiMate3000液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)。
蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(BWRM,BW1827-20mg,純度98.2%),具有不同蝦青素含量的雨生紅球藻粉(山東金晶生物技術(shù)有限公司),磷酸鹽(食品級(jí),興發(fā)集團(tuán)湖北省興發(fā)磷化工研究院有限公司),碳酸氫鈉(食品級(jí),湖南銀橋食品添加劑有限公司),檸檬酸鈉(食品級(jí),大自然生物集團(tuán)有限公司),食鹽(食品級(jí),湖南省湘鹽化有限責(zé)任公司),甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、二甲基亞砜、石油醚、二氯甲烷、叔丁基甲基醚,均為分析純,磷酸、氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純,天津科密歐公司,水為超純水。
1.2.1 提取溶劑的選取
用天平稱(chēng)取5份蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2%的雨生紅球藻粉,放入 25 mL 的試管中。將 10 mL 的乙醇、丙酮、二甲基亞砜、石油醚、二氯甲烷分別加入到5個(gè)試管中。在常溫下提取 1 h 后,將溶液進(jìn)行旋蒸干燥,分別加入 10 mL 的二甲基亞砜溶液。將溶液置于分光光度計(jì)中 (吸收波長(zhǎng) 489 nm) 測(cè)定吸光度。
1.2.2 繪制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線
用二甲基亞砜作為溶劑,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品為溶質(zhì),配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用 1 cm 比色皿在分光光度計(jì)上 489 nm 處測(cè)定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3 樣本溶液的制備
實(shí)驗(yàn)樣本是蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別約為2%、3%、4%、5%的雨生紅球藻粉原料Ⅰ、原料Ⅱ、原料Ⅲ、原料Ⅳ和雨生紅球藻粉(蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2%)與磷酸鹽、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、食鹽分別按質(zhì)量比1∶9配成的復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅱ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅲ、復(fù)配產(chǎn)品Ⅳ。
精密稱(chēng)取樣品0.1~1 g(精確至 0.0001 g)左右于 50 mL 潔凈干燥的離心管中,使用 50 mL 二甲基亞砜少量多次萃取,直至樣品中無(wú)色素,每次倒入萃取溶劑后于50~52 ℃ 恒溫水浴鍋中至少靜置 10 min,分別固液分離,然后合并萃取液,再向合并的萃取液中加入二甲基亞砜定容 100 mL,避光靜置,測(cè)定所獲得溶液在 489 nm 處的吸光度值,計(jì)算樣品中蝦青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.2.4 回收率試驗(yàn)
以雨生紅球藻粉原料Ⅰ和復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ,同時(shí)進(jìn)行蝦青素三水平加標(biāo)回收測(cè)定,測(cè)定蝦青素回收率。
從圖1看出,5種不同溶劑對(duì)于蝦青素的提取效果差異明顯,其中二甲基亞砜溶液的提取效果最佳,所以選擇二甲基亞砜溶液為最宜提取溶劑。
圖1 不同溶劑的提取效果
在最大吸收波長(zhǎng) 489 nm 處測(cè)得蝦青素各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值 (如圖2所示) ,以吸光度值為縱坐標(biāo),蝦青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二甲基亞砜溶液中蝦青素質(zhì)量濃度和吸光度之間的關(guān)系式為y=0.1657x+0.0087,R2=0.9997,線性關(guān)系良好。
圖2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別用本方法和GB/T 31520—2015 《紅球藻中蝦青素的測(cè)定液相色譜法》測(cè)定雨生紅球藻粉Ⅰ和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品Ⅰ中蝦青素含量。從表1看出,本方法與國(guó)標(biāo)法比較,測(cè)定雨生紅球藻粉中蝦青素含量的誤差為0.02%~0.09%,測(cè)定含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的誤差為0.003%~0.011%。此方法能快速且準(zhǔn)確測(cè)定雨生紅球藻粉和含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素的含量。
表1 蝦青素含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比
從表2看出,雨生紅球藻粉中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.7%,含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.3%。
表2 蝦青素回收率測(cè)定結(jié)果
本文利用蝦青素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn),通過(guò)溶劑篩選選擇出最佳提取溶劑二甲基亞砜,在最大吸收波長(zhǎng) 489 nm 處利用分光光度法對(duì)雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量進(jìn)行測(cè)定,其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的R2是0.9997,線性關(guān)系良好。本方法與GB/T 31520—2015比較,測(cè)定雨生紅球藻粉中蝦青素含量的誤差為0.02%~0.09%,測(cè)定含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的誤差為0.003%~0.011%。且用本方法雨生紅球藻粉中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.7%,含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素平均加標(biāo)回收率為98.3%。本方法能用于雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量定量分析,方法操作簡(jiǎn)單、快速、不需要特別昂貴的檢測(cè)儀器,能夠滿(mǎn)足企業(yè)快速定量檢測(cè)雨生紅球藻粉及含雨生紅球藻粉的復(fù)配產(chǎn)品中蝦青素含量的需要。