帥振虹 張婉菁

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳 518017

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40 歲之前卵巢功能明顯衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂同時伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，其發(fā)病率為1%～3%，且近年來呈明顯上升趨勢[1]。研究表明，各種原因?qū)е碌腜OI 大都伴隨著卵巢顆粒細胞的凋亡，因此卵巢顆粒細胞過度凋亡可能成為POI 發(fā)病的始動因素[2-4]。經(jīng)皮穴位電刺激（transcutaneous electric acupoint stimulation，TEAS）是以電刺激信號代替?zhèn)鹘y(tǒng)針灸機械刺激的一種新型針灸療法，具有無創(chuàng)、易操作、能定量控制時間和強度等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，TEAS 在治療POI 生殖內(nèi)分泌紊亂方面取得了良好的臨床效果，但關(guān)于TEAS 對POI 卵巢顆粒細胞凋亡的影響尚鮮見報道[5]。本研究旨在觀察TEAS 對POI 大鼠激素水平的調(diào)節(jié)及對微小RNA-23a（miR-23a）/SMAD 同源物5（recombinant SMAD family member 5，SMAD5）信號通路的影響，探討TEAS對POI 模型大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40 只10～12 周齡SPF 級雌性SD 大鼠，體重210～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[合格證號SYXK（粵）2015-0106；許可證號SCXK（京）2016-0006]。室溫控制在22～25 ℃，濕度50%，通風(fēng)良好。本實驗經(jīng)深圳市婦幼保健院倫理委員會批準（SFYLS[2021]008）。

1.1.2 主要藥物

雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力制藥有限公司，批號：Z43020228）、戊酸雌二醇片（德國拜耳醫(yī)藥有限公司，批號：J20220009）。

1.1.3 主要試劑與儀器

大鼠血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（estradiol，E2）抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）的ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司）；電泳儀（美國BIO-RAD 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國GE 公司）；SDZ-Ⅱ華佗電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；ME204E 電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，精密度0.01 g）。

1.2 實驗方法

1.2.1 POI 大鼠模型構(gòu)建及分組

每日上午8:00—9:00 時行陰道脫落細胞涂片檢查，選取動情周期規(guī)則的40 只雌性大鼠，采用隨機數(shù)字表法將其分成對照組、模型組、TEAS 組、激素組，除對照組外，其余30 只大鼠均使用雷公藤多苷片灌胃造模，每日上午給予生理鹽水配制的雷公藤多苷片懸浮液按50 mg/kg 連續(xù)灌胃14 d。對照組給予等量生理鹽水灌胃。當(dāng)大鼠陰道脫落細胞涂片顯示動情周期紊亂時提示造模成功[6-8]。

1.2.2 干預(yù)方法

于造模結(jié)束后次日開始干預(yù)，TEAS 組參照《實驗針灸學(xué)》[9]選取關(guān)元、腎俞、雙側(cè)子宮及三陰交穴，用電子針療儀予連續(xù)波、頻率2 Hz、刺激強度以刺激點出現(xiàn)輕微肌肉節(jié)律收縮為宜，20 min/次[10]。激素組給予戊酸雌二醇溶液1 mg/（kg·d）進行灌胃。對照組和模型組僅給予抓取和固定，不予任何治療。各組均為2 次/d，連續(xù)2 周。TEAS 干預(yù)結(jié)束后第2 天，腹股溝靜脈取血，分離血清，用于檢測血清性激素的表達。處死大鼠，開腹取出兩側(cè)卵巢，左側(cè)卵巢放于4%多聚甲醛溶液中，用于TUNEL 檢測；右側(cè)卵巢迅速用液氮保存，用于Western blot 實驗。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1 血清性激素水平檢測 各組大鼠TEAS 或灌胃結(jié)束后第2 天，腹股溝靜脈取血，離心半徑8 cm，離心速度4 000 r/min，10 min，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測血清FSH、E2、AMH 水平。

1.2.3.2 TUNEL 染色法檢測卵巢顆粒細胞凋亡率 對卵巢組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇及水合；蛋白酶K 工作液處理組織15～30 min；滴加50 μl TUNEL（試劑A5 μl+試劑B45 μl）反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，室溫孵育1 h；載玻片晾干后滴加50 μl 轉(zhuǎn)化劑POD 液，室溫孵育30 min；滴加50～100 μl DAB 底物溶液，室溫顯色10 min；用蘇木精染液復(fù)染后立即用自來水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；滴一滴PBS 于視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡顆粒細胞數(shù)并拍照，計數(shù)TUNEL 陽性細胞相對于總細胞的百分率。

1.2.3.3 Westernblot 檢測 卵巢中miR-23a、SMAD5、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate proteinase 3，Caspase-3）蛋白表達BCA 法測定蛋白濃度，取25～50 μg 蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉1 h 后4℃過夜孵育一抗，用PBST 洗滌5 次后室溫孵育二抗1 h，用PBST 洗滌5次后將PVDF 膜進行ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J軟件分析蛋白灰度值，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清性激素水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清E2、AMH 水平降低，F(xiàn)SH 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS 組大鼠血清E2、AMH 水平均上升，F(xiàn)SH 水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清性激素水平比較（）

表1 各組大鼠血清性激素水平比較（）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經(jīng)皮穴位電刺激；FSH：卵泡刺激素；E2：雌二醇；AMH：抗米勒管激素。

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較

與對照組比較，模型組顆粒細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS組大鼠顆粒細胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（%，）

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（%，）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經(jīng)皮穴位電刺激。

2.3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 的蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠卵巢SMAD5 蛋白表達減少，而miR-23a、Caspase-3 蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS 組大鼠卵巢SMAD5 蛋白表達增加，miR-23a、Caspase-3 蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白的表達

表3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表達比較（）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經(jīng)皮穴位電刺激；SMAD5：SMAD 同源物5；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認為POI 屬于“月經(jīng)后期、閉經(jīng)、不孕癥”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為腎精匱乏、沖任虛衰是其基本病機，肝郁脾虛是發(fā)病的關(guān)鍵因素。本研究選取雙側(cè)子宮及三陰交為主穴，關(guān)元、腎俞為配穴[11]。子宮穴為經(jīng)外奇穴，與胞宮相鄰，具有局部治療作用；三陰交為三條陰經(jīng)的交會穴，有通調(diào)沖任的作用；關(guān)元為任脈之穴，能健脾和胃、調(diào)經(jīng)理氣；腎俞穴是腎的背腧穴，能補益腎精?？v觀諸穴配伍，以補腎填精為主，使腎精充足而天癸盛，再通調(diào)沖任、養(yǎng)血行氣使精充血足，經(jīng)血有了物質(zhì)基礎(chǔ)，營血充盛，陰陽調(diào)和，五志七情調(diào)暢，諸證可解。

顆粒細胞是卵泡的主要功能單位，對卵母細胞發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[12]。POI 卵泡發(fā)育異常以竇卵泡發(fā)育阻滯在2～3 mm 階段、顆粒細胞過度凋亡引起的卵泡閉鎖加速導(dǎo)致卵子質(zhì)量下降為主要特征[13-14]。因此，顆粒細胞過度凋亡是觸發(fā)POI 的機制之一。研究表明，與卵巢功能正常的女性比較，miR-23a 在POI女性的血漿和顆粒細胞中的表達顯著上調(diào)[15-17]。作為miR-23a 靶基因之一的SMAD5 是一種受體調(diào)控的SMAD 蛋白，可通過激活Caspase-3 蛋白直接影響顆粒細胞凋亡[18-19]。

研究闡明，針刺對POI 女性下丘腦-垂體-卵巢軸有良性調(diào)整作用，但具體機制尚不明確[20-25]。本研究采用的TEAS 是以電刺激信號代替?zhèn)鹘y(tǒng)針灸機械刺激的一種新型針灸療法，通過雷公藤多苷建立POI 模型大鼠基礎(chǔ)上，觀察TEAS 對POI 模型大鼠血清激素水平的影響，證實了TEAS 的治療效果；進一步觀察結(jié)果顯示，TEAS 能上調(diào)SMAD5 蛋白表達，下調(diào)miR-23a、Caspase-3 蛋白表達，提示TEAS 可能通過調(diào)節(jié)miR-23a/SMAD5 信號通路，下調(diào)促凋亡蛋白的表達，從而抑制顆粒細胞過度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能。但是否存在其他作用機制，在今后的研究中有待進一步探索。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。