吳啟弘 張永祥 余 江 何立民 潘 杰 楊 頗

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，貴州貴陽 550000

骨愈合延遲或失敗仍是困擾骨科醫(yī)生的關(guān)鍵問題，5%～10%的骨折患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)愈合延遲或骨不連，影響預(yù)后[1-2]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等的潛能，其成骨向分化是骨折愈合及軟骨內(nèi)成骨的關(guān)鍵[3-4]。淫羊藿苷是淫羊藿中黃酮類化合物的衍生物，其可促進(jìn)大鼠脂肪干細(xì)胞成骨分化[5-6]。但關(guān)于淫羊藿苷對(duì)BMSCs 成骨分化的影響及機(jī)制尚未明確。本研究采用不同濃度淫羊藿苷干預(yù)BMSCs，觀察其增殖及成骨情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠5 只，8 周齡，雌雄不限，體重（290±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，合格證號(hào)110322211100491267，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。本研究經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核通過（ls201912007）。

1.2 主要材料與儀器

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購于武漢純度生物科技有限公司，批號(hào)：150206；CCK-8 試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)試劑盒購于上海吉至生化科技有限公司，批號(hào)：140809、200118、170614；茜素紅染色液購于伊勢(shì)久（江蘇連云港）生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：110917；兔抗鼠FITC-CD29、PE-CD90、FITC-CD45 抗體，兔抗鼠Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transducers and activator of transcription 5，STAT5）、p-STAT5 一抗購于美國Abcam 公司，貨號(hào)：ab254514、ab192256、ab17202、ab108596、ab32364、ab278764。

HSG9832 型Elx800 酶標(biāo)儀購于美國Thermo 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購于美國Beckman 公司；StepOne Puls 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀購于美國ABI 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 BMSCs 來源、分離、培養(yǎng)及鑒定 麻醉大鼠，于右膝髕骨內(nèi)側(cè)做一切口，暴露股骨髁間凹，在髁內(nèi)鉆孔后，將克氏針插入脛骨髓腔，鋼鋸橫行截?cái)喙晒?，形成橫行骨折，縫合。骨折后2 d，麻醉后斷頸處死，剝離股骨，DMEM 培養(yǎng)基沖洗股骨髓腔并收集帶有骨髓細(xì)胞的沖洗液，過濾，加入等體積Percoll 細(xì)胞分離液離心，收集中間白色層，PBS 沖洗2 遍，重懸，以5×107個(gè)密度接種于培養(yǎng)皿，2 d 后更換培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 天換液1 次，傳三代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD29、CD90、CD45 陽性率。

1.3.2 細(xì)胞分組 取第三代BMSCs，重懸并接種于24孔板。將細(xì)胞分為對(duì)照組，低、中、高劑量組。對(duì)照組不做特殊處理；低、中、高劑量組加入含終濃度1、10、100 μmol/L 淫羊藿苷溶液的DMEM 培養(yǎng)液[7]。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10-8mol/L 地塞米松+50 μmol/L 左旋抗壞血酸+10 mmol/L β 甘油磷酸鹽）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8 法檢測(cè)BMSCs 增殖情況 取“1.3.2”項(xiàng)下培養(yǎng)24 h 的各組BMSCs，接種至24 孔板（2.5×105個(gè)/孔）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照CCK-8 試劑盒說明書加入CCK-8 試劑，培養(yǎng)2 h，檢測(cè)490 nm 處各孔細(xì)胞光密度（optical optical density，OD）值。每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 ALP 活性檢測(cè)“1.3.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化第15 天時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗，離心取上清，參照試劑盒說明書檢測(cè)ALP 活性，以全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔520 nm 處OD 值，在ALP 標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取活性值。

1.3.5 茜素紅染色觀察成骨向誘導(dǎo)分化“1.3.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化第21 天時(shí)，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 次，茜素紅染色，顯微鏡下觀察成骨分化效果。

1.3.6 免疫印跡法檢測(cè)JAK2/STAT5 通路蛋白表達(dá)情況 取“1.3.2”項(xiàng)下各組培養(yǎng)24 h 的BMSCs，裂解、提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉（5%）室溫封閉2 h，加入兔抗鼠JAK2、STAT5、p-STAT5 一抗（1∶1 000），次日加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影定影，分析蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)；兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 細(xì)胞鑒定

原代細(xì)胞呈大小不規(guī)則形態(tài)，傳代至第三代時(shí)，細(xì)胞呈紡錘形或多角形，大小均一，見圖1；流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，CD29 和CD90 陽性率分別為99.2%及99.8%，CD45 陽性率為1.4%，細(xì)胞符合間骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來源特征，表明分離的細(xì)胞為BMSCs，見圖2。

圖1 細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

2.2 各組BMSCs 增殖情況及ALP 活性比較

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組OD 值、ALP 活性均升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組OD 值、ALP 活性均升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組OD 值、ALP 活性升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組BMSCs 增殖情況及ALP 活性比較（，n=3）

表1 各組BMSCs 增殖情況及ALP 活性比較（，n=3）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與中劑量組比較，cP＜0.05。BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；OD：光密度；ALP：堿性磷酸酶。

2.3 各組茜素紅染色結(jié)果比較

茜素紅染色結(jié)果顯示，BMSCs 可誘導(dǎo)成骨分化，形成鈣結(jié)節(jié)。對(duì)照組有較少深紅色鈣化結(jié)節(jié)形成，低、中、高劑量組有較多深紅色鈣化結(jié)節(jié)形成。見圖3。

圖3 各組BMSCs 成骨向分化結(jié)果（茜素紅染色，200×）

對(duì)照組，低、中、高劑量組礦化結(jié)節(jié)面積占比分別為（10.25±3.37）%、（29.57±3.42）%、（62.25±8.12）%、（75.76±9.17）%。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組礦化結(jié)節(jié)面積占比均升高（t=9.856、14.488、16.425，P＜0.001）；與低劑量組比較，中、高劑量組礦化結(jié)節(jié)面積占比均升高（t=9.085、11.560，P＜0.001）；與中劑量組比較，高劑量組礦化結(jié)節(jié)面積占比升高（t=2.702，P=0.022）。

2.4 各組JAK2/STAT5 通路蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組JAK2、p-STAT5/STAT5 均降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組JAK2、p-STAT5/STAT5 均降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組JAK2、p-STAT5/STAT5 均降低（P＜0.05）。見圖4、表2。

表2 各組JAK2/STAT5 通路蛋白表達(dá)比較（，n=3）

表2 各組JAK2/STAT5 通路蛋白表達(dá)比較（，n=3）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與中劑量組比較，cP＜0.05。JAK2：Janus 激酶2；STAT5：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5。

圖4 各組JAK2/STAT5 通路蛋白表達(dá)變化

3 討論

目前臨床常通過使用骨愈注射液促進(jìn)骨痂形成，但效果不理想，且有副作用[8-10]。天然藥物具有高效、低毒的特點(diǎn)，相對(duì)安全的中藥單體成分已應(yīng)用于骨折治療中[11-13]。

BMSCs 增殖及成骨分化在骨折愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷各劑量組OD 值、ALP 活性均高于對(duì)照組。提示淫羊藿苷可促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化。淫羊藿可補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨，益腎壯陽，淫羊藿苷是其主要有效成分之一。明磊國等[16]研究顯示，淫羊藿苷對(duì)人BMSCs 成骨分化具有促進(jìn)作用，對(duì)骨質(zhì)疏松有治療效果。另有研究認(rèn)為，淫羊藿苷可激活雌激素受體，上調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)；淫羊藿苷可增強(qiáng)BMSCs 的遷移能力，促進(jìn)其歸巢到受損部位[17-19]。

JAK2/STAT5 通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在成骨細(xì)胞發(fā)生、分化及成熟過程中發(fā)揮重要作用，抑制JAK2/STAT5 通路活化可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨分化[20-25]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，淫羊藿苷各劑量組JAK2、p-STAT5/STAT5 均降低。提示淫羊藿苷可能通過抑制JAK2/STAT5 通路促進(jìn)BMSCs 增殖及成骨向分化。

綜上所述，淫羊藿苷可能通過抑制JAK2/STAT5通路促進(jìn)創(chuàng)傷性骨折大鼠BMSCs 增殖及成骨向分化。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。