杜 恒 吳安定 余 潔 王 飛 周 勇

湖北省黃岡市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北黃岡 438000

結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，如腫瘤炎癥微環(huán)境、基因突變等，引發(fā)多種信號(hào)通路的變化[1]。實(shí)際上，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并非均是線性傳導(dǎo)，信號(hào)通路間存在串話現(xiàn)象[2]。研究顯示，IL-6 可激活STAT3、Ras 和Notch 等多種信號(hào)通路，引發(fā)串話現(xiàn)象，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。消退素D1（resolvin D1，RvD1）是一種新型抗炎消退脂質(zhì)介質(zhì)，在許多炎癥相關(guān)疾病模型中可抑制白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6分泌[4-5]。有研究顯示，RvD1 可減輕炎癥微環(huán)境抑制肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，但RvD1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響尚不明確[5]。本實(shí)驗(yàn)基于IL-6 介導(dǎo)的信號(hào)途徑，探討RvD1 通過炎癥微環(huán)境介導(dǎo)Ras 串話Notch 信號(hào)通路的影響，及對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用，為RvD1 在結(jié)腸癌的臨床治療實(shí)踐中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620（ATCC 公司，HTX1675），Rv D1（Cayman 公司，10012554），K-Ras 質(zhì)粒（基因生物，G12D）；LipofectamineTM3000（ThermoFisher，L3000008）、IL-6 抗體（上海雅吉公司，0782R）。以下購(gòu)于Absin公司：K-Ras、NICD、p-p65、p65、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、ELISA 試劑盒（abs115469、abs131403、abs130624、abs131170、abs130068、abs155766、abs171412、abs830030、abs510003）；Cy3 標(biāo)記山羊抗兔(Abcam 公司，ab6939）；CCK-8 試劑（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，C0037）；吉姆薩染液（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，C0133）；BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（Biosharp 公司，BL521A）；Transwell 板（8.0 μm，Corning公司，3428），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS 公司，Ⅸ73），成像系統(tǒng)（Q-IMAGING 公司，MicroPublisher）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

SW620 細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基（10%的胎牛血清），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白組、RvD1 組、K-Ras 組、K-Ras+RvD1 組?？瞻捉M不處理，K-Ras 組、K-Ras+RvD1 組轉(zhuǎn)染K-Ras 質(zhì)粒（G12D），RvD1 組和K-Ras+RvD1 組細(xì)胞按2×105/孔接種于6 孔板，過夜后加入250nmol/L RvD1，孵育48h。SW620 細(xì)胞于6 孔板中轉(zhuǎn)染，按照每孔2 μl∶6 μg 比例混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒，48 h 后收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

SW620 細(xì)胞按照每孔2×103接種于96 孔板，每組4 個(gè)復(fù)孔，過夜后加入0、62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L的RvD1，48 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處OD 值。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

SW620 細(xì)胞按照每孔800 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，過夜后加入待細(xì)胞貼壁后0、62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L 的RvD1，每周更換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d 后，固定，吉姆薩染液染色，拍照，記錄每孔克隆數(shù)量。

1.5 Western blot 檢測(cè)

SW620 細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗、RIPA 裂解、BCA 蛋白定量后，40 μg 上樣蛋白經(jīng)上樣緩沖液稀釋、沸水浴5 min，然后經(jīng)10%SDS-PAGE 膠電泳，再通過濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%BSA 室溫封閉l h，加入IL-6、K-Ras、NICD、p-p65、p65、vimentin、N-cadherin、E-cadherin 一抗稀釋液（1∶500），4℃的條件下孵育過夜，之后加入二抗稀釋液（1∶500），常溫孵育30 min，TBST 清洗4 次，ECL 溶液曝光，最后完成顯影、定影。用AlphaEaseF 軟件分析目標(biāo)條帶OD 值?？瞻捉M和RvD1 組之間比較IL-6、K-Ras、NICD 的表達(dá)差異，空白組、RvD1 組、K-Ras 組、K-Ras+RvD1 組之間比較NICD、p-p65、p65、vimentin、N-cadherin、E-cadherin的表達(dá)差異，每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

收集空白組、RvD1 組細(xì)胞，每組3 個(gè)復(fù)孔。經(jīng)PBS清洗、固定、破膜、去除過氧化氫酶。于濕盒中加入IL-6、K-Ras 和NICD 一抗稀釋液（1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS 清洗，用Cy3 標(biāo)記的二抗稀釋液（1∶500）常溫孵育1 h，PBS 清洗。用100 μl DAPI 染液室溫孵育5 min，PBS 清洗后加入抗熒光淬滅劑并封片，顯微鏡觀察熒光表達(dá)。

1.7 Transwall 實(shí)驗(yàn)

K-Ras 組和K-Ras+RvD1 組細(xì)胞被重懸于無血清培養(yǎng)液中，調(diào)整為106個(gè)/ml。遷移檢測(cè)時(shí)，取100 μl細(xì)胞懸液加入Transwell 小室中，600 μl 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell 下室，培養(yǎng)48 h 后，取出小室，用棉簽輕擦拭去上室細(xì)胞，小室清洗、固定、吉姆薩染液染色10 min，于100 倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，每組3 個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)細(xì)胞侵襲時(shí)，先用50μg/孔Matrigel 包被Transwell 小室，成膠后余操作同細(xì)胞遷移方法。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞存活和增殖的影響

細(xì)胞活力和克隆形成數(shù)量隨RvD1 劑量升高而下降。濃度125.0、250.0、500.0 nmol/L RvD1 的細(xì)胞活力低于0 nmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A。濃度250、500 nmol/L RvD1 的細(xì)胞克隆數(shù)量低于0 nmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1B。濃度250.0、500.0 nmol/L RvD1 的細(xì)胞活力和克隆數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。最終250 nmol/L 處理48 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖1 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞存活和克隆形成能力的影響

2.2 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞中IL-6、K-Ras 和NICD蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，RvD1 組IL-6、K-Ras 和NICD 的蛋白水平和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白組和RvD1 組IL-6、K-Ras 和NICD 蛋白表達(dá)水平

2.3 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞K-Ras 串 話Notch 信號(hào)通路及EMT 的影響

與空白組比較，RvD1 組NICD、p-p65、vimentin和N-cadherin vimentin 水平降低，E-cadherin 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；K-Ras 組NICD、p-p65、vimentin 和N-cadherin 水平升高，E-cadherin水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；K-Ras+RvD1 組的NICD、p-p65、vimentin 和N-cadherin 水平低于K-Ras 組，E-cadherin 水平高于K-Ras 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 RvD1 對(duì)SWB20 細(xì)胞IL-6 和Ras、Notch 信號(hào)通路的影響

2.4 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

與空白組比較，RvD1 組和K-Ras 組的細(xì)胞遷移和侵襲能力分別降低和升高（P＜0.05）；與K-Ras 組比較，K-Ras+RvD1 組的細(xì)胞遷移和侵襲能力降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 RvD1 對(duì)SW620 細(xì)胞侵襲和遷移的影響

3 討論

RvD1 具有強(qiáng)大抗炎作用，可抑制腫瘤壞死因子-α 和IL-6 等炎癥因子分泌[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)RvD1 劑量依賴抑制SW620 細(xì)胞生長(zhǎng)，提示RvD1 發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。IL-6 在多個(gè)方面促進(jìn)了腫瘤惡化，包括誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)、化療抵抗、EMT、血管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8-13]。本研究發(fā)現(xiàn)RvD1 降低SW620 細(xì)胞的IL-6 水平，并且在降低炎癥水平同時(shí)，對(duì)Ras 和Notch 兩個(gè)代表性致癌通路均有抑制作用。研究顯示，IL-6 通過結(jié)合其受體促進(jìn)多種致癌通路活化，包括Ras/MAPK 和PI3K/Akt 通路。K-Ras 作為Ras 基因家族成員，位于12號(hào)染色體，正常情況下處于非活化狀態(tài)[14-16]。然而，K-Ras 異?；钴S會(huì)引起細(xì)胞大量生長(zhǎng)和增殖，誘發(fā)癌變[17]。研究顯示，部分結(jié)腸癌患者K-Ras 點(diǎn)突變可引起RAS 蛋白持續(xù)活化[18]。因此，K-Ras 基因?qū)儆诟哳l突變的結(jié)腸癌致癌通路，并且在臨床上對(duì)于靶向藥物治療的選擇以及治療效果和預(yù)后的評(píng)估具有重要意義[19]。

K-Ras 通過參與信號(hào)串話，協(xié)同Notch 通路進(jìn)程[20]。Notch 通路是結(jié)腸癌最為重要的信號(hào)通路之一，具有高度保守性。研究顯示，K-Ras 通過激活p38MAPK 通路增加Notch-1 表達(dá)[21]。鄰近細(xì)胞的Notch 跨膜受體與配體相互作用，改變受體構(gòu)象，隨后在γ 分泌酶的作用下，跨膜受體發(fā)生水解并釋放出NICD，NICD 進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)K-Ras 通過信號(hào)串話上調(diào)癌細(xì)胞中NICD 水平和Notch 信號(hào)通路活性，RvD1 則抑制K-Ras 上調(diào)NICD 的作用；其機(jī)制可能是通過干預(yù)K-Ras 與Notch 信號(hào)串話，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一發(fā)現(xiàn)為RvD1 的抗癌機(jī)制提供了新的線索。本研究觀察到RvD1 對(duì)K-Ras/Notch 信號(hào)通路的抑制，削弱了核因子（nuclear factor，NF）-κB 主要活性亞單位NF-κB p65 表達(dá)和下游EMT 水平。NF-κB是Notch 通路下游轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因，這是Notch 激活NF-κB 的一種機(jī)制[22]。此外，NICD 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NF-κB抑制蛋白IκB-α，可能是Notch 激活NF-κB 的另一機(jī)制[23]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，推測(cè)RvD1 通過抑制K-Ras 并干擾Notch 通路的信號(hào)串話，進(jìn)而影響上述機(jī)制，導(dǎo)致磷酸化型NF-κB p65 水平下調(diào)。EMT 是腫瘤細(xì)胞失去上皮極性特征和細(xì)胞-細(xì)胞連接，是導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散、組織浸潤(rùn)和定居的重要原因。NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄因子，可轉(zhuǎn)錄EMT 相關(guān)基因，激活并促進(jìn)EMT 進(jìn)程[24]。

本研究與最近的研究一致，高陳陳等[25]報(bào)道NF-κB參與消退素的炎癥消退作用，朱天琦等[5]研究發(fā)現(xiàn)RvD1可通過TGF-β 抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果揭示抑制K-Ras/Notch/NF-κB/EMT 信號(hào)串話，可能是RvD1 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移行為的原因之一。鑒于IL-6 下游靶信號(hào)通路眾多且易引發(fā)串話，RvD1 對(duì)信號(hào)串話的抑制現(xiàn)象符合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)改變的特征。

綜上所述，RvD1 通過下調(diào)IL-6 表達(dá)，抑制K-Ras對(duì)Notch 信號(hào)通路的串話。這一作用進(jìn)而降低下游NF-κB 活性和EMT，減弱結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力，為結(jié)腸癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。