吳昭蓉 楊素芳 李文意 陳少鋒 滕紅麗 趙湘培

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤醫(yī)藥研究實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530201

我國育齡夫婦的不孕不育率已升至12%～18%，其中40%女性不孕癥與卵巢早衰（prematureovarianfailure，POF）有關(guān)[1-2]。POF 不僅降低育齡婦女的生育能力，還能導(dǎo)致自身免疫性疾病、骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生[3-4]。目前POF 治療手段如激素替代療法、免疫抑制劑，均伴隨較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而干細(xì)胞治療、靶向基因治療等技術(shù)復(fù)雜，多數(shù)尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[5-10]。因此，找到更安全有效的POF 治療方法是婦產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域的重要目標(biāo)。傳統(tǒng)醫(yī)藥治療POF 在臨床上取得較好的效果且毒副作用較小，壯醫(yī)民間驗(yàn)方及現(xiàn)代研究均證實(shí)蒲公英的顯著療效[11-21]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)及體外實(shí)驗(yàn)探索蒲公英治療POF 的作用機(jī)制，從而為其更為深入的研究指明方向。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 蒲公英的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn) 從文獻(xiàn)中收集蒲公英活性成分，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)、STITCH、BATMAN-TCM、GEO、中藥研究數(shù)據(jù)庫、Bindingdb、DAVID 數(shù)據(jù)庫預(yù)測相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并采用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.2 POF 靶點(diǎn)預(yù)測 以POF 為關(guān)鍵詞，以人類基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從OMIM、DrugBank、GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索POF 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與富集分析 利用維恩圖分析將蒲公英主要化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與POF 靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行交集，并構(gòu)建蒲公英-化學(xué)成分-靶基因-POF 網(wǎng)絡(luò)圖。利用String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。利用Cytoscape 3.7.1 軟件對(duì)蒲公英治療POF 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 試藥與儀器 蒲公英甾醇（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，M24GB149475）；30%H2O2（成都市科龍化工試劑廠，2015101401）；胎牛血清（澳大利亞Bovogen 公司，C0230）；不完全培養(yǎng)基DMEM/F12（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGM12500-500）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，S0033S）；低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，20960-1-AP）。CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CKX53 型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；FACS Caibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）。

1.2.2 細(xì)胞株 選取卵巢顆粒細(xì)胞（KGN 細(xì)胞）進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2.3 細(xì)胞氧化損傷模型的建立及給藥 實(shí)驗(yàn)采用H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型，KGN 細(xì)胞按1×104個(gè)/100 μl接種到96 孔板中，待細(xì)胞約融合至80%后，加入含有不同濃度H2O2（0、100、200、400、600、1000 μmol/L）的培養(yǎng)基，分別于2、4、6 h 后，加入CCK-8 試劑檢測，計(jì)算細(xì)胞活力，每種組合設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。選取合適的濃度、時(shí)間作為誘導(dǎo)氧化損傷模型的條件（模型組）。另采用不同濃度的蒲公英甾醇（0、1.875、3.750、7.500、15.000、30.000 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞，選擇后續(xù)干預(yù)的最佳濃度（蒲公英甾醇高、低劑量組）。加入含有不同濃度蒲公英甾醇的培養(yǎng)基作用24 h，再加入H2O2造模，隨后進(jìn)行CCK-8 檢測，每種組合設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的檢測KGN 細(xì)胞接種于6 孔板，設(shè)置空白組、模型組及蒲公英甾醇高、低劑量組。其中，蒲公英高、低劑量組以蒲公英甾醇預(yù)處理24 h，隨后模型組和蒲公英高、低劑量組加入H2O2造模。熒光探針DCFH-DA 檢測胞內(nèi)ROS 的含量，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，每組測3 次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法檢測HIF-1α 的入核情況 提取四組細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗HIF-1α 抗體（稀釋比例為1∶2 000）、GAPDH 抗體（稀釋比例為1∶2 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶20 000 稀釋）室溫孵育1 h，成像系統(tǒng)曝光顯影拍照，Image J 軟件分析蛋白條帶并計(jì)算灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 作圖，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英潛在活性化合物的篩選

從文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫檢索到的蒲公英化學(xué)成分共23 個(gè)。見表1。

表1 蒲公英潛在活性化合物的篩選

2.2 蒲公英-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

檢索得到蒲公英23 個(gè)化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)345個(gè)，POF 靶點(diǎn)497 個(gè)，二者靶點(diǎn)取交集得到61 個(gè)共同靶點(diǎn)基因，構(gòu)建蒲公英-化學(xué)成分-靶基因-POF網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1～2。

圖1 蒲公英活性成分與卵巢早衰靶點(diǎn)的維恩圖

圖2 蒲公英-化學(xué)成分-靶基因-POF 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 生物分子網(wǎng)絡(luò)建立及富集分析

2.3.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 篩選網(wǎng)絡(luò)DC 值中位數(shù)為11.5，DC 值＞23 的關(guān)鍵靶點(diǎn)共有14 個(gè)，其包括白細(xì)胞介素-6、上皮生長因子受體等，繪制核心作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。

圖3 潛在作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 核心靶點(diǎn)富集分析 在DAVID 平臺(tái)對(duì)蒲公英潛在活性成分治療POF 的14 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，主要涉及的信號(hào)通路有HIF-1 信號(hào)通路、蛋白聚糖作用等。見圖4。

圖4 蒲公英治療卵巢早衰潛在作用靶點(diǎn)的富集分析

2.4 KGN 細(xì)胞氧化損傷模型的建立條件

當(dāng)用600 μmol/L H2O2處理細(xì)胞4 h，細(xì)胞活力為（59.70±2.99）%，最接近IC50。因此，選擇600 μmol/L和4 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度和時(shí)間。見圖5。

圖5 H2O2 誘導(dǎo)KGN 細(xì)胞氧化損傷模型（n=3）

2.5 蒲公英甾醇對(duì)H2O2 誘導(dǎo)KGN 細(xì)胞活力的影響

蒲公英甾醇濃度為7.5、15.0 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 蒲公英甾醇對(duì)H2O2 誘導(dǎo)KGN 細(xì)胞活力的影響（n=3）

2.6 蒲公英甾醇對(duì)細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的影響

模型組ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度高于空白組，蒲公英甾醇高、低劑量組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7。

圖7 蒲公英甾醇對(duì)細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的影響（n=3）

2.7 蒲公英甾醇對(duì)HIF-α 蛋白核移位的影響

四組細(xì)胞質(zhì)HIF-1α 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組細(xì)胞核HIF-1α 蛋白表達(dá)高于空白組，蒲公英甾醇高、低劑量組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8。

圖8 蒲公英甾醇對(duì)HIF-α 蛋白核移位的影響（n=3）

3 討論

由于環(huán)境污染、社會(huì)壓力等因素，不孕、POF 等已成為威脅婦女健康的重大問題，有效防治POF 迫在眉睫[22-23]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英在治療生殖疾病方面起到了積極作用，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)探索蒲公英治療POF 的作用機(jī)制。

本研究通過數(shù)據(jù)庫的檢索，獲得蒲公英與POS 共同靶點(diǎn)61 個(gè)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)包括白細(xì)胞介素-6、上皮生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子-A 等。蒲公英甾醇、蒲公英賽醇、ψ-蒲公英甾醇等均為蒲公英治療POF的有效成分，由此提示蒲公英發(fā)揮作用是多種化學(xué)成分量的積累作用的結(jié)果。KEGG 通路富集分析顯示了HIF 信號(hào)通路是蒲公英治療POF 的主要信號(hào)通路。根據(jù)通路情況，HIF-α 蛋白核移位表示該通路的激活。顆粒細(xì)胞受到氧化損傷，HIF-α 蛋白移位至細(xì)胞核，其在細(xì)胞核中表達(dá)升高，HIF 通路激活[24]；給予蒲公英甾醇治療后，HIF-α 蛋白核內(nèi)表達(dá)減少，提示其抑制HIF-α核移位等抗氧化作用發(fā)揮其治療POF 的功能。

有研究表明，卵巢細(xì)胞缺氧引起的慢性炎癥和氧化應(yīng)激是卵巢衰老和顆粒細(xì)胞功能障礙的主要原因，所以減輕氧化損傷是延緩卵巢衰老的重要切入點(diǎn)[25]。根據(jù)前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，體外實(shí)驗(yàn)用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型，檢測了蒲公英甾醇對(duì)H2O2刺激人卵巢顆粒細(xì)胞系中的氧化損傷的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蒲公英甾醇可能通過逆轉(zhuǎn)H2O2導(dǎo)致的卵巢顆粒細(xì)胞活力下降、抑制細(xì)胞內(nèi)過量的ROS 產(chǎn)生、抑制HIF-α核移位等抗氧化作用發(fā)揮其治療POF 的功能。

綜上所述，蒲公英治療POF 是多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑的直接或間接協(xié)同作用的結(jié)果。體外實(shí)驗(yàn)也提示蒲公英甾醇通過抗氧化損傷發(fā)揮治療POF 的作用。本研究有一定的預(yù)測性和客觀性，為后續(xù)進(jìn)一步探索提供依據(jù)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。