毛柳英 陳靈麗 田 梅 馬 青 周曉春 馬麗娜 崔光紅 曹俊嶺

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100078；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥所，安徽合肥 230051；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院洛陽(yáng)醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471002

烏頭是烏頭屬植物中最具代表性的藥用植物，藥用歷史悠久，中藥川烏和附子來(lái)源分別為其干燥母根及子根的加工品，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)及祛風(fēng)止痛的功效[1]。二萜生物堿是其發(fā)揮臨床作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其以良好的鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕、抗心律失常及局部麻醉、降血壓、抗菌、抗癌等活性備受關(guān)注[2-7]。在我國(guó)，烏頭的人工栽培歷史約有1 000 年，烏頭栽培時(shí)保留摘尖（打頂）、掰芽、修根等工序，是主產(chǎn)地四川江油延續(xù)千年傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝。烏頭打頂工藝減少了開花對(duì)植株的養(yǎng)分爭(zhēng)奪，利于根部生長(zhǎng)[8-9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，烏頭不同部位二萜生物堿類成分存在組織特異性，尤其是烏頭非藥用部位頂葉蘊(yùn)含豐富的特異性二萜生物堿[10]。然而，烏頭頂葉及不同葉片中次生代謝產(chǎn)物如何分布？打頂?shù)墓に噷?duì)烏頭的次級(jí)代謝產(chǎn)物又產(chǎn)生哪些影響？這些問(wèn)題鮮見報(bào)道。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，對(duì)烏頭頂葉及不同部位的葉片（前6 片葉），頂葉摘除前后根進(jìn)行檢測(cè)，闡述烏頭的物質(zhì)基礎(chǔ)及不同部位中次生代謝產(chǎn)物的分布情況，為闡述烏頭打頂工藝的科學(xué)內(nèi)涵提供重要的依據(jù)。同時(shí)，結(jié)合不同二萜生物堿在不同部位的變化情況為烏頭頂葉資源的可持續(xù)利用提供物種基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試液

Acquity UPLCTMsystem，Waters Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)，Waters）；使用的Q-TOF 質(zhì)譜儀是Synapt質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)，Waters）；XS105 型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Centrifuge5415D型離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf 公司）；Millipore 純水系統(tǒng)（美國(guó)millipore 公司）。MM400 球磨儀（Retsch 公司）；粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FDU-1110 真空干燥機(jī)（東京理化器械株式會(huì)社）；SB-800-DTD 型超聲清洗機(jī)（超聲功率500 W，寧波新芝生物科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Acros 公司）；小檗堿（上海源葉生物科技有限公司，純度>98%）。

1.2 材料

本研究所用樣品地上部分及地下部分分別于2021 年5 月和7 月采自四川綿陽(yáng)烏頭種植基地。所有樣品經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院崔光紅研究員鑒定為烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.。將烏頭地上部分采集，其葉子由上至下分別收割，分別標(biāo)為L(zhǎng)-DY、L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6；各樣品重復(fù)3 份。將頂葉摘除和不摘除的植株下的根，分別記為Z1～Z6 及R1～R6。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 供試品溶液的制備 將上述所有樣品置于真空干燥器中干燥至恒重，并用組織破碎儀破碎。精密稱定不同樣品約10 mg，置于2 ml EP 管中。使用50%甲醇將小檗堿對(duì)照品配制2 μg/ml 的提取液，分別取1.5 ml 含內(nèi)標(biāo)物小檗堿的提取液加入各樣品中，稱重。經(jīng)超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，置入2 ml 樣品瓶中，即得。

2.1.2 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Wates，USA）。柱溫45 ℃，進(jìn)樣量0.4 μl，流速0.4 ml/min。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈溶液，梯度洗脫：0～0.1 min，95%～95%A；0.1～3.0 min，95%～88%A；3.0～5.0 min，88%～82%A；5.0～8.0 min，82%～82%；8.0～9.5 min，82%～78%；9.5～15.5 min，78%～72%；15.5～16.0 min，72%～70%；16.0-17.0 min，70%～50%；17.0～18.0 min，50%～20%；18.0～20.0 min，20%～2%；20.0～25.0 min，2%～2%；25.0～25.1 min，2%～95%；25.1～28.0 min，95%～95%。

2.1.3 質(zhì)譜條件 采用正離子模式掃描模式，電噴霧電離離子源，掃描范圍為m/z 50～12 00，掃描時(shí)間為0.15 s，檢測(cè)時(shí)間28 min，低能量碰撞電壓為6 V，高能量碰撞電壓40～60 V，錐孔電壓為40 V，除溶劑氣體為氮?dú)?，錐孔電壓為40 V，氮?dú)饬魉贋? L/min，使用leucine enkephalin（200 pg/L）進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理 Progenesis QI 軟件（Waters 公司）軟件對(duì)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基線過(guò)濾、峰比對(duì)和歸一化等處理，并結(jié)合EZinfo 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）來(lái)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維處理及特征提取。使用正交偏最小平方判別分析來(lái)生成VIP 值（VIP＞1），并結(jié)合差異倍數(shù)篩選閾值（|FC|＞2）篩選差異代謝物。

2.2 結(jié)果

2.2.1 烏頭不同位置葉片的二萜生物堿的分布與含量通過(guò)MassLynx 4.1 分析軟件，在28 min 內(nèi)，共有60 個(gè)主要化合物被在烏頭不同位置葉片中被檢測(cè)出來(lái)，其基峰離子流顯示在圖1 中，對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分顯示見表1。通過(guò)對(duì)每個(gè)化合物主峰的斷裂方式進(jìn)行分析，以丟失最明顯的碎片離子H2O-（18 Da）、CO-（28 Da）、CH3OH-（32 Da）、HCOOH-（46 Da）、CH3COOH-（60 Da）為特征推斷共有58 個(gè)二萜生物堿化合物。首先通過(guò)分子量、保留時(shí)間、離子碎片與文獻(xiàn)對(duì)比確定了35 個(gè)色譜峰的歸屬（其中包含3 個(gè)C20型生物堿）[4，6，10-16]。另有25個(gè)化合物為未知的二萜生物堿成分。

表1 60 個(gè)主要化合物對(duì)應(yīng)化學(xué)成分表

圖1 烏頭不同位置葉片的基峰離子流圖（A:L-DY,B～G:L-1～L-6）

烏頭植物頂葉部分（L-DY）富集了大量的二萜生物堿類成分，見圖1。而相對(duì)成熟的葉片（包括L1～L6，圖1B～G）二萜生物堿類成分種類明顯降低，見圖1A。neoline（#13）、carmichaenine C（#32）、DA39（#39）、carmichaenine A（#43）、mesaconitine（#44）是頂葉中主峰，尤其是DA19（#19）、DA20（#20）、DA21（#21）、DA36（#36）、DA38（#38）、DA57（#57）、DA59（#59）基本除頂葉外，其他葉片中基本檢測(cè)不出，可以認(rèn)為這些成分是頂葉的特征性成分，共有25 個(gè)。

將化合物按不同的類型劃分，不同類型化合物分布降低的數(shù)目依次為醇胺型（1～6 min）＜單脂型（5～11 min）＜雙酯型（11～18 min）。提示隨著葉片的成熟，雙酯型生物堿（包括2 種三酯型化合物3-acetylmesaconitine 和3-O-acetylacontine）會(huì)在葉片中快速消失。

通過(guò)對(duì)化合物進(jìn)行聚類分析及各葉片進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2A～B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)全株的葉片可聚成3類，分別是L-DY、L-1～L-3、L-4～L-6。相比于頂葉，在代謝物的分布上L-1～L-3 片之間與L-4～L-6 片之間的化合物相關(guān)性更強(qiáng)。這說(shuō)明，頂葉與1～6 片葉片中的次級(jí)代謝產(chǎn)物存在差距。對(duì)頂葉中的主要成分做PCA 分析，結(jié)果顯示頂葉可以與其他葉片完全分離，見圖2C，但是之間的差異并不明顯，基本不能分開，顯示了頂葉的特異性。

圖2 不同位置葉片成分分布及變化趨勢(shì)

通過(guò)內(nèi)標(biāo)物小檗堿進(jìn)行統(tǒng)一處理，獲得烏頭不同二萜生物堿的相對(duì)含量。根據(jù)葉片中生物堿成分的相對(duì)含量，初步將葉片中次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累特征分為3 種情況，如圖2D～F 所示。隨著葉片逐漸長(zhǎng)大，一些化合物如Songorine（#5）、12-epi-napelline（#6）、Fuzitine（#16）、DA29（#29）、DA30（#30）等8 個(gè)次級(jí)代謝物在葉片中逐漸積累，見圖2D。相對(duì)的另外一些化合物如Pengshenine A（#2）、karakoline（#3）、isotalatizidine（#4）、neoline（#13）、carmichaenine A（#43）、aconitine（#50）等11 個(gè)成分在葉片中逐漸消失，不再分布，見圖2E。但更多的成分是在頂葉中生成后幾乎不會(huì)在其余葉片中檢測(cè)出（圖2F），這些成分在頂葉與第6 片相對(duì)含量平均相差約350 000 倍。

2.2.2 打頂工藝對(duì)地下部分的影響 為探究打頂工藝對(duì)根的影響，首先對(duì)比了打頂前后根重量的差異。為防止個(gè)體差異，隨機(jī)選擇50 個(gè)鮮樣為一組樣品稱重，分別稱取打頂前后的鮮樣各6 組（每組50 個(gè)）。計(jì)算得到摘除頂葉和不摘頂葉根的鮮重平均值為9.93 g/個(gè)和9.02 g/個(gè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，摘除頂葉后，每個(gè)根增重約為0.91 g（10%）。

此外，通過(guò)Progenesis QI 軟件導(dǎo)出的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分別對(duì)地上部分在打頂前后做PCA 主成分分析圖（圖3A），橙色點(diǎn)和綠色點(diǎn)分別表示摘除頂葉前后的樣品，結(jié)果顯示兩類樣品可以分開，說(shuō)明打頂前后代謝物存在差異。為了進(jìn)一步分析摘除前后代謝物的差異，對(duì)兩組樣品進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（圖3B～3C），R2Y=0.998,Q2=0.707，提示所獲得的模型具有比較好的擬合。所有樣本的S-Plot 得分散點(diǎn)圖如圖3D，獲得兩組樣品的離群化合物，并結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析模型獲得的變量權(quán)重（VIP）值，以VIP 值＞1.0 的代謝物為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物，主要的差異成分包括Songorine、7-deoxylycoctonine、Fuzi line、chasmanine、14-acetyltalatizamine、10-OH-Mesaconi tine、Mesaconitine 等。

圖3 打頂前后地下部分的多元統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

3.1 葉中次級(jí)代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)分布

根據(jù)不同位置葉片的成分研究，得到以下結(jié)果：①烏頭頂葉中的化學(xué)成分的數(shù)量及相對(duì)含量絕對(duì)高于其他別的部位；②烏頭葉片中的二萜生物堿類成分隨著葉片的生長(zhǎng)會(huì)急速減少，僅個(gè)別成分會(huì)增加；③頂葉中產(chǎn)生了某些特異成分，如DA19（#19）、DA20（#20）、DA21（#21）、DA36（#36）、DA38（#38）、DA57（#57）、DA59（#59）僅在頂葉中被檢測(cè)到，carmichaenine C（#32）和carmichaenine A（#43）相對(duì)含量遠(yuǎn)超其他部位。推測(cè)頂葉中之所以產(chǎn)生出豐富的二萜生物堿成分（包括數(shù)量及含量），可能與隨著葉片的生長(zhǎng)，特異成分如carmichaenine C（#32）和carmichaenine A（#43）等重新匯聚于新的頂葉中，用于新的頂葉的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

3.2 打頂對(duì)烏頭產(chǎn)量及質(zhì)量的影響

打頂是指掐掉頂端的葉片，控制植物加高和抽長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)加粗生長(zhǎng)和加速果實(shí)發(fā)育的重要手段。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，打頂對(duì)烏頭的產(chǎn)量及質(zhì)量存在影響。一方面，頂葉儲(chǔ)存大量的二萜生物堿成分，需要大量的營(yíng)養(yǎng)和能量用以維持生長(zhǎng)。打頂之后多余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新分配，用于根部生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)量增加。另一方面，植物的地上部或地下部受到損傷，植物的所有組織都會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，遠(yuǎn)端的組織也不例外，因此頂部損傷后會(huì)引起根部的初級(jí)和次生代謝反應(yīng)，使得打頂前后檢測(cè)出一些差異代謝物[20]。同時(shí)考慮植物體內(nèi)調(diào)控的因素，與根部發(fā)育有關(guān)生長(zhǎng)素基因積極響應(yīng)，促進(jìn)根系發(fā)育，而打頂時(shí)間及打頂方式對(duì)烏頭的質(zhì)量有一定的影響，推測(cè)參與代謝物形成的基因及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控時(shí)間較生長(zhǎng)素響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，故對(duì)質(zhì)量產(chǎn)生的影響較產(chǎn)量弱[21-25]。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。