曹 強(qiáng)

湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病率和死亡率呈快速增長趨勢［1-2］。盡管CRC 診療技術(shù)不斷改進(jìn)，但CRC的死亡率仍然較高，主要原因與CRC 早診率低、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率較高、敏感性分子靶向藥物較少等因素有關(guān)，因此，探索CRC新的診斷標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移相關(guān)分子靶標(biāo)對于CRC臨床診斷、治療尤為重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，不能翻譯蛋白質(zhì)，其在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平通過對靶基因調(diào)控參與眾多病理生理過程［3］。研究表明，lncRNA 與CRC 增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān)［4］。小核仁RNA 宿主基因1（SNHG1）是位于染色體11q12.3 的新型lncRNA，其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［5］。SNHG1 在CRC 中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制，目前研究報(bào)道較少，本研究旨在探討SNHG1 對CRC 增殖、遷移的影響及潛在的調(diào)控機(jī)制，以期為CRC潛在腫瘤標(biāo)志物及藥物治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供新的理論依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑和儀器

人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系FHC、結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29 均購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自江蘇齊氏生物科技有限公司。胰蛋白酶購自廈門海標(biāo)科技有限公司。青霉素、鏈霉素購自上海擇葉生物科技有限公司。磷酸鹽緩沖液PBS 購自廣州威佳科技有限公司。蛋白裂解液購自上?？道噬锟萍加邢薰尽PCR試劑盒購自江蘇天凈沙基因診斷技術(shù)有限公司。引物、SNHG1 小干擾RNA 序列，陰性對照序列均由上?？殿伾锟萍加邢薰驹O(shè)計(jì)合成。脂質(zhì)體liPofectamine2000 購自北京沃比森科技有限公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。STAT3、P-STAT3 抗體購自上海欽城生物科技有限公司。超凈工作臺購自濟(jì)南騰昊科學(xué)儀器有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海合恒儀器設(shè)備有限公司。SH2-16K 離心機(jī)購自深圳三莉科技有限公司。164-5050 電泳儀購自濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司。倒置顯微鏡購自上海工洲閥門有限公司。Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康科技有限公司。Tanon2500 凝膠成像儀購自上海橙誠科學(xué)儀器有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

將復(fù)蘇后的FHC、HT29 細(xì)胞接種于含1%青霉素-鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。48 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，棄去培養(yǎng)液、PBS 清洗3 遍，加入0.5 mL 事先配置好的胰蛋白酶消化液充分消化。當(dāng)細(xì)胞消化至變圓時(shí)棄去消化液終止消化，加入5 mL DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液狀態(tài)，1 200 r/min 離心5 min，棄上清，收集HT29 細(xì)胞，加入MEM 培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個(gè)/mL，吸取3 mL HT29 細(xì)胞懸液于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。按照liPofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將SNHG1 小干擾RNA 序列（si-SN?HG1）、陰性對照序列（si-NC）轉(zhuǎn)入HT29細(xì)胞，并將其設(shè)置為si- SNHG1組和si-NC組。

1.3 qRT-PCR

胰酶消化并收集各組處于對數(shù)期生長的細(xì)胞于6 孔板中，每孔加入150 μL Trizol 試劑，反復(fù)吹打細(xì)胞，移入無Rnase的EP管中，加入250 μL氯仿，振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，小心吸去上層液于另一個(gè)無RNase 的EP 管中，加入等體積異丙醇充分混勻，用同樣方法離心，棄去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500 r/min 離心5 min，棄上清，置于冰上晾干，采用分光光度計(jì)測量RNA 濃度。取1 μgRNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qPCR 試劑盒檢測SNHG1 mRNA 表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△CT法計(jì)算SNHG1相對表達(dá)量。

引 物 序 列： SNHG1 上 游 5'-CCTAAAGCCAC?GCTTCTTG-3'，下游5'-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3'。GAPDH上游5'-TGTAGGCTCATTTGCAGGGG-3'，下游5'-ATGGCATGGACTGTGGTCTG-3'。

1.4 MTT

將si-SNHG1 組和si-NC 組細(xì)胞以每孔2×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)箱中避光孵育3 h，棄去培養(yǎng)液，并加入100 μLDMSO試劑，充分振蕩，酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處光密度（OD）值，OD值大小表示細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱。

1.5 Transwell

胰酶消化并收集處于對數(shù)期生長的si-SNHG1 組和si-NC 組細(xì)胞。采用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105/mL，將Transwell 小室置于24 孔板中，取100 μL 上述細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，Tran?swell 下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，無菌棉簽擦去未穿膜的HT29 細(xì)胞，顯微鏡觀察并隨機(jī)取6個(gè)視野并計(jì)算遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.6 Western blot

分別收集處于對數(shù)期生長的si-SNHG1組和si-NC組細(xì)胞于離心管中，加入RIPA 裂解液，置于冰上裂解10 min，離心取上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)說明書配置SDS-PAGE 膠，每孔上樣量為25 μg蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下5%的脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗（STAT3、P-STAT3 稀釋濃度均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，TBST 充分洗膜后，使用辣根酶二抗標(biāo)記物室溫下孵育2 h。采用化學(xué)熒光發(fā)光法（ECL）顯影，以GAP?DH 為內(nèi)參，Image J 軟件分析目的蛋白和內(nèi)參光密度值，將目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG1在CRC 細(xì)胞系HT29、結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測CRC 細(xì)胞系HT29、結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 中SNHG1 的表達(dá)水平，HT29、FHC 細(xì)胞中SNHG1 的相對表達(dá)量分別是（4.26±0.15）、（1.06±0.08），與FHC 細(xì)胞相比，HT29 中SNHG1 的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.045，P=0.000）。

2.2 干擾SNHG1表達(dá)對HT29細(xì)胞增殖、遷移的影響

si-SNHG1 組、si-NC 組HT29 細(xì)胞中SNHG1 表達(dá)分別是（1.21±0.07）、（4.15±0.32），si-SNHG1 組顯著低于si-NC 組（t=16.317，P=0.000）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SN?HG1 組HT29 細(xì) 胞在培養(yǎng)24h 的OD 值與si-NC 組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.014，P=0.079），但在48 h、72 h 的OD值顯著低于si-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.173，P=0.006；t=8.426，P=0.002）。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SNHG1 組HT29 細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于si-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.714，P=0.001），見表1。

表1 干擾SNHG1表達(dá)對HT29細(xì)胞增殖、遷移的影響（±s）

組別si-NC（n=3）si-SNHG1（n=3）t值P值SNHG1 4.15±0.32 1.21±0.07 16.317 0.001細(xì)胞活性（OD490 nm）24 h 0.37±0.03 0.34±0.03 2.014 0.079 48 h 0.59±0.07 0.42±0.04 5.173 0.006 72 h 0.91±0.08 0.51±0.06 8.426 0.002細(xì)胞遷移數(shù)（個(gè)）67.48±7.14 25.13±6.37 12.714 0.001

2.3 干擾SNHG1 表達(dá)對JAK-STAT 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測si-SNHG1 組、si-NC 組HT29 細(xì)胞中STAT3、P-STAT3 的表達(dá)，其表達(dá)量分別為（0.73±0.09）、（0.71±0.15）；（0.23±0.06）、（0.68±0.14），STAT3 在si-SN?HG1 組和si-NC 組中的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.063，P=0.084），與si-NC 相 比，P-STAT3 在si-SN?HG1組中的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.473，P=0.000）。

3 討論

CRC 是我國常見的消化道惡性腫瘤，CRC 早期癥狀隱匿，缺乏特異性、敏感性較高的診斷標(biāo)志物，大多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期并伴有局部浸潤和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致CRC患者總體生存率較低。CRC 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今尚未完全闡釋，其涉及體內(nèi)外多種因素，包括飲食習(xí)慣、生活方式的變化；吸煙飲酒等不良生活習(xí)慣；遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變等。因此，深入探索CRC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對于CRC 特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，CRC 新型分子靶點(diǎn)藥物的開發(fā)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。lncRNA 是一類長度超過200個(gè)核苷酸，無編碼蛋白功能的轉(zhuǎn)錄本，在腫瘤發(fā)生、增殖、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。已有研究表明，多種不同類型的lncRNA 參與CRC 進(jìn)展，Zhang 等［6］采用qRT-PCR 檢測臨床CRC 原發(fā)癌組織及轉(zhuǎn)移癌組織中l(wèi)ncRNA H19 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)顯著上調(diào)并與CRC 不良預(yù)后呈正相關(guān)，過表達(dá)lncRNA H19 可促進(jìn)CRC 細(xì)胞遷移及EMT 的 發(fā)生。此外，lncRNA AGAP2-AS1 在CRC 中 表達(dá)同樣上調(diào)并參與CRC 進(jìn)展［7］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究同樣表明lncRNA 參與CRC 發(fā)生發(fā)展調(diào)控，Shang 等［8］通過構(gòu)建異種移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA CCAT1 組移植瘤生長受到明顯抑制。另有研究指出，部分lncRNA 在CRC 中可發(fā)揮抑癌作用，Lin 等［9］通過對CRC 癌旁組織與原發(fā)癌組織中l(wèi)ncRNA AGER-1 表達(dá)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其在原發(fā)癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，與CRC 臨床分期呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)AGER-1 可抑制CRC 增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)凋亡。lncRNA 在CRC 中具有促癌和抑癌雙重作用，不同類型的lncRNA 在CRC 中可能發(fā)揮不同的作用，因此，lncRNA在CRC中的功能有待進(jìn)一步深入探討。

SNHG1 是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在多種不同類型的腫瘤中發(fā)揮促癌作用。Liu 等［10］研究表明SNHG1 在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)均上調(diào)，沉默SNHG1 可顯著降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。SNHG1在腦膜瘤中同樣具有促癌作用，SNHG1 在腦膜瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低SNHG1 后可抑制腦膜瘤細(xì)胞生長［11］。Meng 等［12］檢測了前列腺癌組織和癌旁組織中SNHG1 的表達(dá)，結(jié)果SN?HG1均呈現(xiàn)高表達(dá)，并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對前列腺癌增殖、遷移、凋亡的影響，轉(zhuǎn)染SNHG1 干擾RNA 可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡。本研究探討了SNHG1 在CRC 中的表達(dá)及功能，結(jié)果SNHG1 在CRC HT29細(xì)胞的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸上皮FHC細(xì)胞，表明SN?HG1 在CRC 中有可能同樣發(fā)揮促癌效應(yīng)，為驗(yàn)證SNHG1在CRC 中的促癌效應(yīng)，進(jìn)一步對SNHG1 能否促進(jìn)CRC 增殖、遷移進(jìn)行了研究，以HT29 細(xì)胞作為研究細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染si-SNHG1 RNA 以沉默SNHG1，MTT 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-SNHG1組HT29細(xì)胞增殖能力在培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)顯著低于si-NC 組，Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-SNHG1組HT29 細(xì)胞遷移能力顯著低于si-NC 組，提示SNHG1 能夠通過促進(jìn)CRC增殖、遷移，發(fā)揮其促癌效應(yīng)。

酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號通路是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，JAK-STAT信號通路廣泛參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理生理過程［13-14］。已有研究表明，JAK-STAT 信號通路在多種不同類型腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Huang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT 信號通路在膀胱癌中呈活化狀態(tài)，使用JAK-STAT 阻斷劑可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖活性。C/EBPβ 通過上調(diào)JAK-STAT 信號通路活性促進(jìn)乳腺癌增殖、侵襲及遷移［16］。此外，JAK-STAT 信號通路在肝癌中的活性同樣升高，Zhang等［17］采用qRT-PCR、Western blot等方法檢測了肝癌組織和癌旁組織中JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果其在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。另有研究報(bào)道指出，JAK-STAT 信號通路在CRC 中活化并參與CRC 進(jìn)展。Fang 等［18］體外驗(yàn)證了CPEB3 蛋白可抑制CRC 增殖、遷移，敲低CPEB3 蛋白表達(dá)后可上調(diào)JAK-STAT 信號通路活性并促進(jìn)CRC 進(jìn)展。在本研究中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證SNHG1 促CRC 增殖、遷移的分子機(jī)制，我們探討了SNHG1與JAK-STAT 信號通路的相關(guān)性，采用Western blot 實(shí)驗(yàn)方法檢測了si-SNHG1 組、si-NC 組HT29細(xì)胞中STAT3、P-STAT3的表達(dá)，結(jié)果STAT3在兩組細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異，與si-NC 相比，P-STAT3在si-SNHG1組中的表達(dá)明顯降低，STAT3 是JAK-STAT 信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其磷酸化被認(rèn)為是該信號通路活化的重要標(biāo)志，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SNHG1 促CRC 增殖、遷移作用與JAK-STAT信號通路活化有關(guān)。

綜上所述，lncRNA SNHG1 在CRC 中呈高表達(dá)并能夠促進(jìn)CRC 增殖、遷移，在調(diào)控機(jī)制方面，lncRNA SNHG1通過上調(diào)JAK-STAT 信號通路活性進(jìn)而發(fā)揮其促癌效應(yīng)。本研究初步探討了lncRNA SNHG1 對CRC 增殖、遷移的影響及調(diào)控機(jī)制，將為CRC臨床診治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。