昝雨欣，丁 妍

1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院（湖北十堰 442000） 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所（湖北十堰 442000） 3. 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北十堰 442000）

喉癌是耳鼻喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于歐洲地區(qū)[1]。目前喉癌的治療手段包括手術(shù)、放化療及生物治療等，雖然有一定療效，但喉癌患者的5年生存率僅為30%～40%，且大多數(shù)患者在確診時(shí)往往處于晚期，多死于腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。因此，亟待找到一種有效可靠的方法對(duì)喉癌患者進(jìn)行早期診治，以改善預(yù)后。

腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化能力的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[3]。通過(guò)人工智能和深度學(xué)習(xí)算法，建立一種描述腫瘤干細(xì)胞的新方法，稱為腫瘤干性指數(shù)，用于描述腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞之間的相似程度。研究表明，mRNAsi 可能是腫瘤患者生存、分類和疾病進(jìn)展的有效指標(biāo)[4]。目前對(duì)喉癌的認(rèn)識(shí)主要依賴于頭頸部相關(guān)研究，其獨(dú)立研究相對(duì)缺乏，且基于生物信息學(xué)探索喉癌與mRNAsi 潛在聯(lián)系的研究較少。本研究采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA），基于大規(guī)模數(shù)據(jù)集識(shí)別喉癌潛在相關(guān)基因模塊，旨在識(shí)別mRNAsi 基因潛在生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，并驗(yàn)證與喉癌免疫預(yù)后相關(guān)的新生物標(biāo)志物[5]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源和處理

從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）中獲取11 個(gè)正常樣本和112 個(gè)喉癌樣本的FPKM 數(shù)據(jù)類型和相應(yīng)臨床特征的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)。采用R 軟件的limma 軟件包篩選喉癌和正常組織之間的差異表達(dá)基因，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR）＜0.05 且|log（FC）|＞1 被認(rèn)為是顯著的。

1.2 WGCNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

WGCNA 是一種評(píng)估基因之間相關(guān)性并將高度相關(guān)基因分類到同一模塊的方法。首先通過(guò)差異表達(dá)分析進(jìn)行處理，以過(guò)濾無(wú)關(guān)信息。拓?fù)渲丿B測(cè)度用于識(shí)別共表達(dá)基因模塊，以降低網(wǎng)絡(luò)對(duì)虛假連接的敏感性。通過(guò)將聚類樹(shù)切割成分支，將具有高度絕對(duì)相關(guān)性的基因聚類到相同模塊。只有超過(guò)50 個(gè)基因才會(huì)被定義為一個(gè)模塊。具有較高相關(guān)性的模塊將被合并（r＜0.25），每個(gè)模塊被分配不同顏色進(jìn)行可視化。

1.3 關(guān)鍵模塊和基因篩選

為了評(píng)估模塊的顯著性，將基因與樣本性狀之間的相關(guān)性計(jì)算為基因顯著性（gene significance,GS）。模塊自身基因和基因表達(dá)譜之間的相關(guān)性被定義為模塊成員（module membership, MM）。選擇mRNAsi 和表觀遺傳調(diào)控的mRNAsi（EGERmRNAsi）作為臨床表型進(jìn)一步分析。|r|＞0.3 被認(rèn)為具有相關(guān)性。

1.4 風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

首先進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，以評(píng)估預(yù)后相關(guān)模塊的mRNA，再采用LASSO 回歸分析確定mRNA 系數(shù)，采用以下算法計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)得分：

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=∑ni=coefi×mRNA 表達(dá)

采用Rtsne 和ggplot2 R 軟件包，在mRNAs 特征表達(dá)的前提下進(jìn)行主成分分析（principal component analysis, PCA），以區(qū)分喉癌患者的高低風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列。

1.5 藥物敏感性分析

在CellMiner 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do）[6]下載常用藥物敏感性和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，與上述風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，通過(guò)R 語(yǔ)言中impute、limma、ggpubr、ggplot2 包篩選具有高評(píng)分的基因和對(duì)應(yīng)的藥物。

1.6 免疫相關(guān)性分析

采用R 包GSVA 對(duì)免疫細(xì)胞和功能的基因表達(dá)譜進(jìn)行單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA），采用ggpubr 包將結(jié)果可視化。同時(shí)通過(guò)腫瘤免疫功能障礙與排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tide.dfci.harvard.edu）下載腫瘤評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，采用limma、ggpubr 軟件包得到高低風(fēng)險(xiǎn)基因與腫瘤免疫逃逸結(jié)果。

1.7 功能注釋

利用clusterProfiler 包對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)表達(dá)組進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），下載MSigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的“c2.cp.kegg.v7.5.1.entrez.gmt”和“c5.go.v7.5.1.symbols.gmt”基因集，進(jìn)行基因本體（gene ontology, GO）分析及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，將FDR ＜0.05 設(shè)置為閾值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用R 4.0.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量采用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)變量采用秩檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析評(píng)估關(guān)鍵基因的表達(dá)與藥物敏感性之間的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mRNAsi相關(guān)差異表達(dá)基因

為進(jìn)一步探討與mRNAsi 相關(guān)的功能基因，計(jì)算正常組織和喉癌組織之間存在的顯著差異，紅色為高表達(dá)基因，綠色為低表達(dá)基因。共篩選得到5 302 個(gè)差異表達(dá)基因，并繪制火山圖，見(jiàn)圖1-A。其中，前14 個(gè)差異表達(dá)基因熱圖見(jiàn)圖1-B，KRT4、CRNIN、MAL等基因在正常組織中高表達(dá)（P＜0.05）。

圖1 喉癌的差異表達(dá)基因Figure 1. Differentially expressed genes in laryngeal cancer注：A. 火山圖；B. 前14個(gè)差異表達(dá)基因熱圖。

2.2 WGCNA篩選的重要模塊與基因

選擇上述差異表達(dá)基因作為WGCNA 分析的輸入端數(shù)據(jù)，構(gòu)建一個(gè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并從中識(shí)別與mRNAsi / EREG-mRNAsi 顯著關(guān)聯(lián)的基因模塊，軟閾值（β=5，R2=0.9）用于保證無(wú)規(guī)模網(wǎng)絡(luò)，最終獲得30 個(gè)符合要求的模塊。然后，對(duì)相關(guān)模塊的全基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，以確定相應(yīng)模塊與mRNAsi 之間的相關(guān)性，見(jiàn)圖2-A。在30 個(gè)模塊中，紫色模塊與喉癌樣本的mRNAsi分值呈顯著正相關(guān)（MS=0.53，P＜0.05），同時(shí)隨機(jī)選擇另一種正相關(guān)的模塊（淺黃色模塊）加以驗(yàn)證。紫色模塊內(nèi)共有7 個(gè)顯著差異表達(dá)基因（GS ＞0.5 且MM ＞0.7），見(jiàn)圖2-B。淺黃色模塊內(nèi)共有4 個(gè)顯著差異表達(dá)基因（GS ＞0.3 且MM ＞0.8），見(jiàn)圖2-C。最后，選擇上述淺黃色模塊差異表達(dá)基因（MTHFD2、LINC01932、AL121761.1、TBX2）和紫色模塊差異表達(dá)基因（NEK2、KPNA2、ASF1B、MCM10、RFC5、FAM72A、DBF4）共11個(gè)基因作為喉癌的關(guān)鍵基因。

圖2 WGCNA篩選的重要模塊與基因Figure 2. The important modules and genes for WGCNA screening注：A. 模塊-mRNAsi（EREG-mRNAsi）關(guān)聯(lián)圖；B. 紫色模塊散點(diǎn)圖；C. 淺黃色模塊散點(diǎn)圖。

2.3 預(yù)后基因篩選與驗(yàn)證

進(jìn)一步繪制11 個(gè)基因在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì)圖，發(fā)現(xiàn)淺黃色、紫色模塊中的候選基因在喉癌中大多上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3-A。模塊內(nèi)基因相關(guān)性分析結(jié)果顯示，紫色模塊協(xié)同表達(dá)關(guān)系較強(qiáng)的基因?qū)灿袃蓪?duì)，包括FAM72A和NEK2（r=0.77，P＜0.05）、MCM10和RFC5（r=0.71，P＜0.05）。淺黃色模塊協(xié)同表達(dá)關(guān)系較強(qiáng)的基因?qū)灿腥龑?duì)，包括MTHFD2和TBX2（r=0.74，P＜0.05）、LINC01932和TBX2（r=0.71，P＜0.05）、LINC01932和MTHFD2（r=0.70，P＜0.05），見(jiàn)圖3-B。對(duì)11 個(gè)基因進(jìn)行Cox 回歸和LASSO 回歸分析，構(gòu)建預(yù)后基因風(fēng)險(xiǎn)模型：風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)=TBX2×0.021+MTHFD2×0.085，見(jiàn)圖3-C。PCA 分析結(jié)果表明，所得的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分有效區(qū)分了高低風(fēng)險(xiǎn)組，見(jiàn)圖3-D。通過(guò)化療藥物數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出前12 個(gè)結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果顯示TBX2基因與維莫非尼（Vemurafenib）（r=0.587，P＜0.001）、達(dá)拉菲尼（Dabrafenib）（r=0.439，P＜0.001）均呈正相關(guān)；MTHFD2基因與奧沙利鉑（Oxaliplatin）（r=0.368，P=0.004）呈正相關(guān)，與凡德他尼（Vandetanib）（r=-0.354，P=0.005）呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖3-E。

圖3 喉癌與mRNAsi相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)Figure 3. Expression of key genes related to mRNAsi in laryngeal cancer注：A. 模塊基因表達(dá)水平；B. 模塊基因的相關(guān)性；C. 單變量Cox回歸分析；D. 基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的PCA圖和t-SNE圖；E. 化療藥物篩選；*P＜0.05，***P＜0.001。

2.4 預(yù)后基因免疫微環(huán)境

探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與mRNAsi 的相關(guān)性，其與RNAss 呈正相關(guān)（r=0.35，P＜0.05），與DNAss 的相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.073，P=0.44），見(jiàn)圖4-A。同時(shí)檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤免疫逃逸的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)高低風(fēng)險(xiǎn)組存在顯著差異。TIDE 是一種模擬腫瘤免疫逃逸機(jī)制的計(jì)算方法，以預(yù)測(cè)樣本對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)。兩基因構(gòu)建的低風(fēng)險(xiǎn)組TIDE 明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.001），見(jiàn)圖4-B。在低風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）和輔助性T 細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）的比例增加，見(jiàn)圖4-C。在低風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中，趨化因子受體（chemokine receptor，CCR）、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）及T 細(xì)胞共刺激(T cell co-stimulation） 3 種免疫功能均有差異表達(dá)，見(jiàn)圖4-D。

圖4 喉癌特異性腫瘤微環(huán)境Figure 4. Laryngeal carcinoma specific tumor microenvironment注：A. 風(fēng)險(xiǎn)曲線與mRNAsi相關(guān)性；B. 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與TIDE的關(guān)系；C、D. 低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)之間免疫相關(guān)細(xì)胞與途徑的ssGSEA富集分?jǐn)?shù)比較隊(duì)列；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5 GO和KEGG富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，MTHFD2主要富集于表皮細(xì)胞分化，TBX2主要富集于結(jié)締組織替代的正向調(diào)節(jié)，且二者與角化作用、角化細(xì)胞分化密切相關(guān)，見(jiàn)圖5-A。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，MTHFD2主要富集于嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TBX2主要富集于同種異體移植排斥反應(yīng)和蛋白酶體，見(jiàn)圖5-B。

圖5 MTHFD2與TBX2基因功能富集分析Figure 5. Functional enrichment analysis of MTHFD2 and TBX2 genes注：A. GO富集分析；B. KEGG富集分析。

3 討論

喉癌的發(fā)病率較低，每10 萬(wàn)人中僅有1.5 例發(fā)病，臨床較少見(jiàn)[1]。隨著人口老齡化，喉癌的發(fā)病率逐漸上升，喉癌患者在生物學(xué)行為、治療反應(yīng)和預(yù)后方面的表現(xiàn)具有較大異質(zhì)性。年齡、腫瘤分級(jí)和TNM 分類等常見(jiàn)的預(yù)后因素?zé)o法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)喉癌患者的預(yù)后，因而聚焦該疾病具有重要的臨床實(shí)際意義。

腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤無(wú)限增殖和復(fù)發(fā)的來(lái)源。然而，早期研究缺乏對(duì)癌癥干細(xì)胞的統(tǒng)一描述，喉癌的個(gè)體化治療進(jìn)展緩慢。而mRNAsi 作為量化腫瘤患者腫瘤干性的指標(biāo)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，可以更加高效便捷地探索與腫瘤干性相關(guān)的基因。腫瘤干細(xì)胞在喉癌中的研究仍處于初級(jí)階段。Prince 等曾報(bào)道在原發(fā)性喉癌中檢測(cè)到CD44+癌細(xì)胞，雖然其占比不到10%，但在體外具有很強(qiáng)的成瘤能力[7]。研究表明，CD133 是喉癌干細(xì)胞的標(biāo)志物之一，可以為靶向治療提供證據(jù)[8]。這表明腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物與喉癌治療相結(jié)合，可能對(duì)喉癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后產(chǎn)生積極影響，并為癌癥治療帶來(lái)新思路。本研究構(gòu)建了一個(gè)基于WGCNA 的mRNAsi 的喉癌預(yù)測(cè)模型，得到了關(guān)鍵基因MTHFD2和TBX2，為喉癌的機(jī)制研究提供了新見(jiàn)解。

mRNAsi 相關(guān)基因的藥敏數(shù)據(jù)將有助于喉癌患者的治療。與MTHFD2相關(guān)的前兩種化療藥物維莫非尼和達(dá)拉菲尼均為有效的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶選擇性抑制劑，且前者在甲狀腺乳頭狀癌患者中顯示出抗腫瘤活性，后者可抑制成釉細(xì)胞癌與甲狀腺癌進(jìn)展[9-10]。奧沙利鉑和凡德他尼是兩種與TBX2相關(guān)的化療藥物，奧沙利鉑是一種DNA 合成抑制劑，可以誘導(dǎo)免疫原細(xì)胞死亡，并對(duì)喉癌細(xì)胞具有抑制作用[11]；凡德他尼是一種多通道腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞依賴性DNA 修復(fù)和腫瘤微環(huán)境，使頭頸鱗癌對(duì)光動(dòng)力學(xué)治療過(guò)敏，從而導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的顯著增加[12]。雙基因共相關(guān)的達(dá)沙替尼是一種具有抗實(shí)體腫瘤雙重SRC/ABL 激酶抑制劑，抑制SRC 磷酸化反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡，從而抑制腫瘤進(jìn)展[13]。這些藥物是喉癌患者的潛在新治療選擇。

腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞數(shù)量和比例隨著腫瘤進(jìn)展而變化，在某些情況下可以對(duì)抗癌治療產(chǎn)生反應(yīng)。豐富的抗腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（pDCs 和Th2）富集在低風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中，pDCs 和Th2 細(xì)胞均是參與免疫反應(yīng)并在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮積極作用的主要細(xì)胞。在扁桃體上皮中，pDCs 不僅可以通過(guò)識(shí)別病毒并釋放干擾素幫助抵御病毒感染，而且能夠在不受微生物過(guò)度刺激的情況下啟動(dòng)免疫。因此，pDCs可以被認(rèn)為是扁桃體上皮的“守護(hù)者”，幫助維護(hù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康[14]。此外，臨床證據(jù)顯示，使用pDCs 的藥物分類法識(shí)別惡性腫瘤治療敏感的患者，可有效提高治療反應(yīng)率[15]。以上均提示pDCs 在喉癌進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用。在喉鱗狀細(xì)胞癌患者中，Th2 型轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)[16]。經(jīng)批準(zhǔn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑可減少免疫逃逸，從而改善癌癥患者的臨床預(yù)后。臨床研究發(fā)現(xiàn)一例特殊的轉(zhuǎn)移性喉癌病例，患者在PD-1 抑制劑治療失敗后，出現(xiàn)了縱隔腹膜后淋巴結(jié)和骨質(zhì)進(jìn)行性疾病，但在經(jīng)過(guò)免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物治療后，其骨痛、腹膜后淋巴結(jié)和胸腔淋巴結(jié)病癥狀得到緩解，臨床狀況也得到改善，這與TIDE 評(píng)分結(jié)果一致[17]，有助于開(kāi)發(fā)個(gè)性化和精確的免疫治療方案。在功能富集研究中，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因與角化細(xì)胞密切相關(guān)，而喉癌前病變喉角化癥是一種常見(jiàn)的粘膜病變，起源于造血干細(xì)胞的細(xì)胞缺陷會(huì)導(dǎo)致喉角化狀癌發(fā)生，這提示未來(lái)治療可通過(guò)免疫學(xué)對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)[18]。

本研究存在一定局限性，盡管采用了生物信息學(xué)分析，但實(shí)際臨床研究的樣本量較少，降低了研究的可行性。綜上所述，TBX2和MTHFD2基因可成為喉癌早期檢測(cè)、診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。將WGCNA模塊與mRNAsi相結(jié)合，通過(guò)精準(zhǔn)定位這些模塊中的關(guān)鍵基因，可以確定在癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用的潛在治療靶點(diǎn)，這些特定基因或途徑的靶向可能為開(kāi)發(fā)喉癌新的治療策略和確定藥物靶點(diǎn)提供參考。