毛海龍,保瑞,萬蕭,閆鴻麗

(云南中醫(yī)藥大學(xué)1.中藥學(xué)院;2.中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室,昆明 650500)

千金黃連丸出自《備急千金要方·卷第二十一·消渴第一》,書中寫到“黃連一斤,生地黃一斤。右二味,絞地黃汁,浸黃連,出曝之燥,復(fù)納之,令汁盡干之,搗末,蜜丸如梧子。服二十丸,日三,食前后無拘”。后《外臺》卷十一引《肘后方》寫到“黃連一斤(去毛),生地黃十斤,上為末,絞生地黃取汁,漬黃連,出,曬之燥,復(fù)納之,令汁盡干,為末,煉蜜為丸,如梧桐子大”。兩者不同之處在于前者地黃為一斤,后者為十斤。方中黃連為君,苦寒,具有瀉火解毒之功;生地為臣,味甘、苦,性寒,能夠養(yǎng)陰生津。二藥相須配伍,具有養(yǎng)陰清熱、生津止渴的功效,能夠治療陰虛燥熱而致的消渴,尤其善治療上消[1-3]。

現(xiàn)代研究表明,千金黃連丸具有較好的降糖效果,可用于糖尿病的治療[4-6]。目前臨床上治療糖尿病的西藥都以降糖為目的,治療相對單一,并且長期使用可能會出現(xiàn)胰島素抵抗和失效等問題,還可能發(fā)生低血糖、消化道反應(yīng)、肝腎功能損壞等多種不良反應(yīng)[7-9]。治療糖尿病的藥物開發(fā)需求仍然比較迫切,而現(xiàn)今單靶點降糖藥物開發(fā)也遭遇瓶頸期,因而在傳統(tǒng)藥物特別是經(jīng)典名方的基礎(chǔ)上開發(fā)中藥多靶點糖尿病治療藥物已成為研究熱點。但如今千金黃連丸的研究多采用水煎法,并且使用生地黃,對該方的研究并未忠于原方,古法制備與現(xiàn)代制備是否會與原方功效存在差異這一問題,缺乏系統(tǒng)深入的針對性研究。研究表明黃連中小檗堿和黃連堿是其發(fā)揮降糖作用的主要成分,而巴馬汀和表小檗堿在治療糖尿病方面具有協(xié)同作用[10-12]。地黃中梓醇為主要降糖成分[13-15]。筆者目前未見關(guān)于同時測定古今千金黃連丸中生物堿和梓醇的報道,故本文采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定古法與現(xiàn)代制備的1：1和1：10千金黃連丸中生物堿(表小檗堿、黃連堿、 巴馬汀、小檗堿)和梓醇的含量,具有創(chuàng)新性,并比較其含量差異,為后續(xù)探究其藥效差異奠定基礎(chǔ)。同時也是為經(jīng)典名方的研究提供一種新思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695型高效液相色譜(美國Waters公司);EX125DZH型電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司,感量:0.01 mg);JA2003N型電子天平(上海青海儀器有限公司,感量:0.1 mg);N1200BDOSB2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海泉杰儀器有限公司);SK2510HP超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 黃連、生地黃購買于云南省昆明市螺螄灣藥材批發(fā)市場,鮮地黃購買地為河南焦作,經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室古今老師鑒定,黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖,生地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根,鮮地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮塊根;表小檗堿(批號:20092104,含量:98.11%)、黃連堿(批號:20052005,含量:93.08%)、鹽酸小檗堿(批號:19050604,含量:94.08%)、梓醇(批號:21092702,含量:96.49%)對照品(森嵐科技有限公司);巴馬汀對照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號:21070705,含量:99.66%);磷酸二氫鉀(批號:7778770,含量:99.50%)、十二烷基硫酸鈉(批號:151213,含量:99.00%)(北京百靈威科技有限公司);甲醇、乙腈均為色譜純(默克股份聯(lián)合公司);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1梓醇的色譜條件 色譜柱:RD-C18柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(1：99);流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測波長:210 nm;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣時間:20 min。

2.1.2生物堿的色譜條件 色譜柱:RD-C18柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(50：50)(每100 毫升中加十二烷基硫酸鈉0.4 g,再以磷酸調(diào)pH值為4.0);流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測波長:345 nm;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣時間:30 min。

2.2對照品溶液的制備

2.2.1梓醇對照品溶液的制備 取適量梓醇對照品,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加入甲醇：水(20：80)定容,超聲30 min使其溶解,制成濃度為0.45 mg·mL-1的對照品溶液。經(jīng)孔徑0.45 μm有機濾膜濾過,即得梓醇對照品儲備液,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2生物堿對照品溶液的制備 取表小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿4個生物堿的對照品適量,精密稱定,分別置于10 mL量瓶中,加入甲醇定容,超聲30 min使其溶解,制成濃度分別為0.48、0.48、0.49、0.50 mg·mL-1的對照品溶液。經(jīng)孔徑0.45 μm有機濾膜濾過,即得各生物堿對照品儲備液,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取表小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿的對照品儲備液,2、2、2、4 mL,置于10 mL量瓶中,混勻,制成濃度分別為0.096、0.096、0.098、0.20 mg·mL-1的生物堿混合對照品儲備液,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3供試品溶液的制備

2.3.1黃連供試品的制備 取黃連粉末0.2 g,用適量甲醇：水(20：80)超聲溶解,充分搖勻,濾過,即得梓醇條件樣品溶液;同上使用甲醇：鹽酸(100：1)溶解,即得生物堿條件樣品溶液。

2.3.2鮮地黃汁供試品的制備 取鮮地黃榨汁,取鮮地黃汁適量,離心,精密量取上清液2 mL,精密量取甲醇8 mL加入,超聲10 min,靜置30 min,離心,取上清液5 mL,60 ℃水浴揮干,加甲醇：水(20：80)定容至5 mL,搖勻,即得梓醇條件樣品溶液;同上使用甲醇：鹽酸(100：1)溶解,即得生物堿條件樣品溶液。

2.3.3黃連水煎液供試品的制備 取干燥至恒重的黃連飲片5 g,加入10倍量的純凈水,煎煮1 h后用4層100目紗布趁熱過濾殘渣,收集煎液,殘渣同法再繼續(xù)煎煮2次,棄去殘渣,合并3次煎液,制得黃連水煎液,煎液于60 ℃減壓濃縮成浸膏,使用適量甲醇：水(20：80)超聲溶解,充分搖勻,過濾,即得梓醇條件樣品溶液;同上使用甲醇：鹽酸(100：1)溶解,即得生物堿條件樣品溶液。

2.3.4生地黃水煎液供試品的制備 取干燥至恒重的生地黃飲片5 g,制備方法同“2.3.3節(jié)”。

2.3.5古法千金黃連丸供試品溶液的制備 取適量的黃連粉末,再分別取1倍、10倍量鮮地黃榨汁,用鮮地黃汁浸泡黃連,置于太陽光下暴曬直至干燥,制得1：1、1：10古法千金黃連丸,分別取其2 g使用適量甲醇：水(20：80)超聲溶解,充分搖勻,過濾,即得梓醇條件樣品溶液;同上使用甲醇：鹽酸(100：1)溶解,即得生物堿條件樣品溶液。

2.3.6今法千金黃連丸供試品溶液的制備 取干燥至恒重的黃連飲片5 g,再分別取生地黃5、50 g,加入10倍量純凈水,煎煮1 h后用4層100目紗布趁熱過濾殘渣,收集煎液,殘渣同法再繼續(xù)煎煮2次,棄去殘渣,合并3次煎液,制得1：1、1：10今法千金黃連丸,煎液于60 ℃減壓濃縮成浸膏,使用適量甲醇：水(20：80)超聲溶解,充分搖勻,過濾,即得梓醇條件樣品溶液;同上使用甲醇：鹽酸(100：1)溶解,即得生物堿條件樣品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性考察 移取“2.2節(jié)”下對照品溶液、“2.3節(jié)”下供試品溶液適量,按“2.1節(jié)”下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,采用origin 2018版軟件作圖。結(jié)果表明各供試品溶液中生物堿和梓醇的保留時間與對照品溶液中梓醇和生物堿的保留時間基本一致,說明此方法專屬性強。結(jié)果見圖1、圖2。

A.生物堿混標(biāo)對照品;B.黃連供試品;C.黃連水煎供試品;D.地黃水煎供試品;E.鮮地黃供試品;F.古法1：1千金黃連丸供試品;G.古法1：10千金黃連丸供試品;H.今法1：1千金黃連丸供試品;I.今法1：10千金黃連丸供試品。1.表小檗堿;2.黃連堿;3.巴馬汀;4.小檗堿。

J.梓醇對照品;K.黃連供試品;L.黃連水煎供試品;M.地黃水煎供試品;N.鮮地黃供試品;O.古法1：1千金黃連丸供試品;P.古法1：10千金黃連丸供試品;Q.今法1：1千金黃連丸供試品;R.今法1：10千金黃連丸供試品。1.梓醇。

2.4.2線性關(guān)系考察 移取“2.2節(jié)”下對照品儲備液適量,分別用甲醇：水(20：80)、甲醇：鹽酸(100：1)依次以2倍梯度稀釋5次,即得6份濃度不同的溶液,按“2.1節(jié)”下分別進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,其回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(R2)等結(jié)果見表1。

表1 5種成分的回歸方程及線性范圍

2.4.3精密度考察 移取“2.3.5節(jié)”和“2.3.6節(jié)”下供試品溶液適量,按“2.1節(jié)”下色譜條件分別進(jìn)樣分析,均連續(xù)進(jìn)樣測定6次,記錄生物堿和梓醇的峰面積,并計算RSD值。測得古法1：1千金黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、梓醇峰面積的RSD值分別為1.30%、1.34%、1.42%、0.48%、1.23%;古法1：10千金黃連丸RSD分別為1.53%、1.51%,1.62%、1.50%、0.46%;今法1：1千金黃連丸RSD分別為0.36%、0.21%、0.14%、0.17%、0.72%;今法1：10的RSD分別為1.92%、1.41%、1.39%、1.36%、0.90%,表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性考察 移取“2.3.5節(jié)”和“2.3.6節(jié)”下所制供試品溶液適量,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12和24 h,按“3.1節(jié)”下色譜條件分別進(jìn)樣分析,記錄生物堿和梓醇的峰面積,并計算RSD值。測得古法1：1千金黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、梓醇峰面積的RSD值分別為1.27%、0.71%、0.76%、0.91%、0.83%;古法1：10千金黃連丸的RSD分別為1.65%、1.85%、1.67%、1.50%、0.56%;今法1：1千金黃連丸的RSD分別為1.19%、1.38%、1.26%、1.19%、1.48%;今法1：10千金黃連丸的RSD分別為1.45%、1.52%、1.14%、1.22%、0.47%,說明4種供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.5重復(fù)性考察 按“2.3.5節(jié)”和“2.3.6節(jié)”下供試品溶液的制備方法,各平行制備6份,按“2.1節(jié)”下色譜條件分別進(jìn)樣分析,記錄生物堿和梓醇的峰面積,計算各含量,并計算含量RSD值。測得古法1：1千金黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、梓醇含量的RSD值分別為1.87%、2.42%、2.87%、2.00%、1.90%;古法1：10千金黃連丸的RSD分別為1.86%、2.13%、1.76%、1.59%、1.82%;今法1：1千金黃連丸的RSD分別為2.64%、2.02%、2.85%、2.60%、1.60%;今法1：10千金黃連丸的RSD分別為2.06%、3.63%、2.82%、2.60%、1.66%,說明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率實驗 取6份已知梓醇含量的樣品,精密加入等量的梓醇對照品溶液,按“2.3.5節(jié)”和“2.3.6節(jié)”下制備供試品溶液,按“2.1.1節(jié)”下色譜條件進(jìn)樣分析,測定梓醇的含量,計算回收率;取6份已知生物堿含量的樣品,精密加入等量的生物堿對照品溶液,按“2.3.5節(jié)”和“2.3.6節(jié)”下制備供試品溶液,按“2.1.2節(jié)”下色譜條件進(jìn)樣分析,測定各生物堿的含量,計算回收率。結(jié)果見表2,結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 生物堿和梓醇加樣回收率實驗結(jié)果

2.5千金黃連丸中生物堿和梓醇的含量測定 按“2.3節(jié)”方法制備供試品6批,按“2.1節(jié)”下色譜條件分別進(jìn)樣分析,記錄峰面積,采用外標(biāo)法,計算確定各供試品中生物堿和梓醇的含量,結(jié)果見表3。由表3可知當(dāng)黃連與鮮地黃配伍,生物堿與梓醇含量均少于單藥,黃連與地黃配伍,生物堿含量少于單藥,但增加了梓醇含量。4種千金黃連丸相互比較,古法1：1中4種生物堿含量都最高,梓醇含量最低;古法1：10中4種生物堿含量最低;今法1：1各含量均高于古法1：10,今法1：10中僅小檗堿含量略低于今法1：1,其余均高于今法1：1。

表3 不同供試品中5種成分含量測定結(jié)果

2.6千金黃連丸的主成分分析(principal component analysis,PCA)分析 以上述24批千金黃連丸5個成分的含量為變量,運用SIMCA-P 14.0版軟件進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見圖3。24批千金黃連丸直觀的分為4類,且符合所做的4種千金黃連丸,表明4種千金黃連丸的化學(xué)成分含量有很大差異。

圖3 千金黃連丸主成分分析

3 討論

本實驗采用HPLC法分析了黃連、鮮地黃汁、黃連水煎,生地黃水煎以及古今千金黃連丸中的化學(xué)成分。由圖1可知,黃連、黃連水煎及古今千金黃連丸中均檢測到了表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿,地黃汁和地黃水煎未檢測出。由圖2可知,鮮地黃汁、地黃水煎及古今千金黃連丸中均檢測到了梓醇,黃連、黃連水煎未檢測出。說明黃連與鮮地黃汁、生地黃配伍后,主要藥效成分仍穩(wěn)定存在。

當(dāng)黃連與地黃,鮮地黃配伍后,主要有效降糖成分生物堿和梓醇含量減少,但制備過程中是否有新物質(zhì)生成需要進(jìn)一步研究。賀夢云[5]報道黃連丸治療糖尿病優(yōu)于單藥黃連,并且提高了小檗堿和黃連堿在糖尿病大鼠體內(nèi)的吸收。雷蕾[4]報道黃連、生地黃及其主要成分小檗堿、梓醇對血糖、血脂、葡萄糖耐量、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)等指標(biāo)均有一定療效,但是效果不如千金黃連丸。這體現(xiàn)了中藥復(fù)方通過多成分、多途徑、多靶點的協(xié)同作用發(fā)揮了單味藥無法獲得的治療效果[16-17],同時也揭示了中藥復(fù)方無法單純以含量來判定其藥效差異,后續(xù)將結(jié)合動物實驗探究其藥效差異。

本實驗建立了HPLC法測定不同配比古今千金黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿和梓醇的含量,經(jīng)驗證該法5個成分分離度良好,線性考察、重復(fù)性考察、精密度考察、加樣回收率考察均符合要求,含量測定結(jié)果表明2種制備方法在有效降糖成分含量中各有優(yōu)勢,PCA分析表明4種千金黃連丸化學(xué)成分含量有很大差異,可以初步判定其降糖效果存在差異。