魏航之,吳發(fā)洪,王滿才,肖國輝,白銀亮,張有成

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院1.普通外科;2.藥學(xué)部,蘭州 730030)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)毒性強,菌體沒有甘露糖敏感血凝素(mannose sensitive hemagglutinin,MSHA)帶來的廣譜免疫原性,原因是PA缺乏將MSHA表達于菌體外周的基因[1]。1984年中國微生物學(xué)家牟希亞教授應(yīng)用基因工程技術(shù)培養(yǎng)出菌體周身布滿MSHA菌毛的銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血細(xì)胞凝集素(Pseudomonas aeruginosa-mannose-sensitive hemagglutinin,PA-MSHA)菌株,該菌株經(jīng)滅活和減毒后作為一種低毒性廣譜免疫調(diào)節(jié)劑。該菌制劑注射于人體后通過廣譜免疫原性激活人體免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)免疫低下狀態(tài),抵抗多種致病微生物感染。PA-MSHA起作用的菌毛為I型菌毛,本質(zhì)是多種蛋白質(zhì)構(gòu)成的凝集素。I型菌毛的主要結(jié)構(gòu)是直徑約7 nm的空心圓柱體,由500～3 000個菌毛蛋白A(fimbrillin A,FimA)以右手旋螺旋狀纏繞形成?？招膱A柱體其頂端連接菌毛蛋白H(fimbrillin H,FimH),Ⅰ型菌毛粘連或凝集特定分子的性質(zhì)由FimH決定。FimH可以使菌毛通過與細(xì)胞膜上的甘露糖基特異性結(jié)合而凝集紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞,而D-甘露糖可以抑制這種凝集作用,所以Ⅰ型菌毛又被稱為MSHA[2-3]。

PA-MSHA已獲美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于抗感染、抗病毒和包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等的抗癌治療,PA-MSHA在中國也被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用于癌癥治療中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。PA-MSHA凝集紅細(xì)胞特性限制其靜脈給藥的可能,限制了其直接作用于腫瘤細(xì)胞的抗癌機制的發(fā)揮。當(dāng)前臨床中,PA-MSHA注射液的應(yīng)用主要是基于手術(shù)或化療的輔助用藥,給藥方式包括肌內(nèi)注射、胸腔灌注、膀胱灌注、腹腔灌注、術(shù)中腹腔噴灑、術(shù)中腸系膜組織注射等。筆者認(rèn)為PA-MSHA急需臨床應(yīng)用方式創(chuàng)新,克服PA-MSHA制劑全身用藥的限制,發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用;深入探索PA-MSHA作用于腫瘤及免疫的新機制,從基礎(chǔ)研究的突破促進PA-MSHA在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。筆者在本文就PA-MSHA的免疫調(diào)節(jié)和抗癌機制以及臨床應(yīng)用作了總結(jié)[3]。

1 PA-MSHA的抗腫瘤的機制

1.1PA-MSHA的抗腫瘤免疫應(yīng)答

1.1.1PA-MSHA對先天免疫的影響 有研究評估了PA-MSHA刺激后脾細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路的激活和PA-MSHA刺激后骨髓源性樹突細(xì)胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)的激活來確定PA-MSHA激活固有免疫應(yīng)答的能力,發(fā)現(xiàn)TLR通路上游的幾個分子(TLR1、TLR2、TLR3、TLR6、TLR7和TLR9)表達顯著增加,關(guān)鍵的adaptors和effectors (MyD88、Ticam1、Nfkb2和TAK1)在不同時間點上調(diào)。實驗中被PA-MSHA干預(yù)的樣本的都表現(xiàn)出NF-κB、JNK/ p38、NF/白細(xì)胞介素(interleulin,IL)-6和IRF通路的改變。TLR信號下游基因中,IL-1、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、G-CSF、IP-10、Cox-2等促炎因子和細(xì)胞因子呈時間依賴性增加[4],下游細(xì)胞因子或趨化因子包括Th1型細(xì)胞因子(IL-12、IL-27),Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5),炎癥因子(IL-1a、IL-1b、IL-6和IL-10)和趨化因子(IP-10、MIP-2)都顯著增加。該研究還評估PA-MSHA與DNA疫苗共同接種后增強機體對HIV-1 Env多肽的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng),小劑量(102～104CFU)PA-MSHA和DNA疫苗聯(lián)合接種增強了對HIV-1 Env的細(xì)胞和體液特異性免疫反應(yīng),促進了抗體活性的成熟,然而大劑量的佐劑(108CFU)PA-MSHA可導(dǎo)致免疫抑制作用。此外PA-MSHA還導(dǎo)致BMDC中CD86的大量上調(diào)并促進BMDC成熟[5]。

PA-MSHA可使IgA腎病小鼠模型脾細(xì)胞Th2分化指數(shù)降低,Th1細(xì)胞移位增多。T細(xì)胞的極化方向決定了許多感染性疾病和癌癥的預(yù)后,Th1細(xì)胞高表達的腫瘤患者無病生存期較長,Th2細(xì)胞高表達的腫瘤患者進展較差。PA-MSHA通過刺激人單核細(xì)胞來源的未成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)釋放Th1-促進細(xì)胞因子來影響T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng),經(jīng)過PA-MSHA刺激的未成熟DCs降低內(nèi)吞噬能力,上調(diào)HLA-DR、CD80、CD11c和CD40的表達。DCs分泌的IL-12誘導(dǎo)1型應(yīng)答并增加IFN-c的產(chǎn)生,IFN-c在增強細(xì)胞免疫和發(fā)揮強大的抗腫瘤或抗感染作用方面起著關(guān)鍵作用。經(jīng)過PA-MSHA刺激的Mo-DCs 減少2型應(yīng)答的產(chǎn)物IL-10和IL-4,而2型應(yīng)答參與了腫瘤和感染的進展[6]。

在胃癌患者中腫瘤細(xì)胞的腹膜播散是最常見的復(fù)發(fā)模式,也是主要的死亡原因,大多數(shù)患者在手術(shù)切除時進行的腹腔化學(xué)治療(化療)并沒有獲得生存延長的療效。乳斑是大網(wǎng)膜相關(guān)的淋巴組織,通常被認(rèn)為是游離乳斑巨噬細(xì)胞(peritoneal milky spots macrophages,PMSM)的起源。腹腔游離癌細(xì)胞定植在腹膜乳斑(peritoneal milky spots,PMS)形成轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。位于這些結(jié)節(jié)內(nèi)的未成熟PMSM對腹膜腫瘤的生長預(yù)防能力不足。但可塑性是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志,巨噬細(xì)胞激活和極化后分別稱為M1和M2巨噬細(xì)胞。當(dāng)巨噬細(xì)胞處于高水平的Th1細(xì)胞因子如IL-12、TNF和干擾素(interferon,IFN)的環(huán)境中巨噬細(xì)胞發(fā)育為M1型,而暴露于Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的環(huán)境中巨噬細(xì)胞發(fā)育為M2型[7-8]。經(jīng)PA-MSHA刺激后,PMSM像M1型轉(zhuǎn)變,PA-MSHA增強PMSM的非特異性抗腫瘤作用。這些轉(zhuǎn)變后的M1型PMSM促進了許多對腫瘤細(xì)胞殺傷的至關(guān)重要的中間體的產(chǎn)生,其中最重要的是活性氮中間體(reactive nitrogen intermediates,RNI)。PA-MSHA激活PMSM的抗腫瘤活性明顯高于未激活PMSM和M2型PMSM。PA-MSHA通過TLR4/TLR9依賴性激活PMSM中的轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)。NF-κB作為炎癥的總開關(guān),其激活調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因參與編碼免疫和炎癥的蛋白。Western blotting分析檢測發(fā)現(xiàn)PA-MSHA可降解I降解,I降解對NF-κB的激活起決定性作用,當(dāng)添加了TLR4/9抑制劑后,PA-MSHA降解I解-的進程可部分阻斷[7]。PA-MSHA至少有兩種有效成分可能刺激PMSM向M1表型發(fā)展,第一個組分是表面甘露糖基豐富的肽聚糖,另一個組分是細(xì)胞核中的CpG DNA。這些成分分別通過受體TLR4和TLR9降解I解R9。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)也是激活PMSM的有效成分,在PA-MSHA制備工藝中確實存在少量的LPS污染,但LPS的含量較少,不被認(rèn)為是主要有效成分[7]。

M2巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)并經(jīng)PA-MSHA處理后轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞,TLR4阻斷抗體抑制了這個極化過程。該研究驗證了前面PA-MSHA通過TLR4作用于免疫細(xì)胞的結(jié)論[8]。PA-MSHA可以通過誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化抑制胃癌進展。PA-MSHA處理巨噬細(xì)胞后M1相關(guān)細(xì)胞因子(IL-12、TNF-2和IFN-2)表達水平上調(diào),促進了超氧陰離子、一氧化氮的產(chǎn)生。腫瘤缺氧環(huán)境有助于腫瘤的進展和侵襲,而超氧陰離子在破壞缺氧環(huán)境中發(fā)揮重要作用,從而部分破壞了腫瘤進展的基礎(chǔ)。在體外,PA-MSHA也促進小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子和NO的作用。該研究的創(chuàng)新點在于研究了PA-MSHA誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化涉及的通路。調(diào)控巨噬細(xì)胞成熟和活化的信號通路有多種,其中NF-κF信號通路起主要作用。此外,NF-κF在M1巨噬細(xì)胞的殺瘤功能中起重要作用,并觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的表達。結(jié)果顯示PA-MSHA在mRNA和蛋白水平均明顯激活NF-κF和p65的表達。PA-MSHA能有效誘導(dǎo)NF-κF的從胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位而發(fā)揮NF-κF對M1巨噬細(xì)胞極化的影響。該研究同樣提到了關(guān)于PA-MSHA濃度和劑量的問題,在胃癌細(xì)胞實驗中小、中劑量比較大劑量的PA-MSHA對M1巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的激活更有效[8]。

1.2PA-MSHA的直接抗腫瘤機制

1.2.1膀胱癌 PA-MSHA使膀胱癌細(xì)胞系T24和5637停滯在G0/G1期,PA-MSHA處理24 h后T24和5637細(xì)胞呈劑量依賴性凋亡。PA-MSHA通過caspase-8和caspase-9誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡,表明PA-MSHA可以觸發(fā)內(nèi)在和外在的凋亡通路。PA-MSHA刺激的細(xì)胞表現(xiàn)出磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、雷帕霉素機械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)信號的下調(diào),推測PA-MSHA通過阻斷PI3K-Akt-mTOR信號通路誘導(dǎo)級聯(lián)依賴性凋亡和G0/G1細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮其抗腫瘤細(xì)胞毒性作用。PI3K/Akt/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路的2個主要下游通路[9]。

EGFR或其配體的表達升高在許多類型的上皮癌中都很常見,而這種變化已被證明是維持腫瘤細(xì)胞增殖能力的重要組成部分。通過不同的方法抑制EGFR會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加,并使腫瘤細(xì)胞對放療和化學(xué)治療敏感。膀胱癌細(xì)胞經(jīng)PA-MSHA處理后,caspas- 3、8和9呈劑量依賴性下降,而caspase裂解蛋白呈濃度依賴性增加。此外,PA-MSHA還能抑制EGFR以及Akt和ERK這兩個參與EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游分子的磷酸化。在PA-MSHA治療的膀胱癌細(xì)胞中,pEGFR、pAkt和pERK的蛋白水平也下調(diào)[10]。

PA-MSHA還可能通過誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化促進小鼠膀胱癌細(xì)胞的凋亡并抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。該研究驗證了PA-MSHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的直接作用和PA-MSHA促進M1型細(xì)胞因子表達、降低M2型細(xì)胞因子表達的抗腫瘤免疫機制[11]。在PA-MSHA作用膀胱癌細(xì)胞的研究中,極低濃度的PA-MSHA可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,PA-MSHA對細(xì)胞活性有抑制作用且呈劑量依賴性。PA-MSHA在長期高濃度的治療中有損傷正常尿上皮細(xì)胞的副作用,應(yīng)在臨床應(yīng)用中予以考慮。

1.2.2肝癌 在肝癌研究中,PA-MSHA在高分化Hep G2細(xì)胞和中分化BEL-7402細(xì)胞中均能抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡且呈劑量依賴性,但在正常人肝細(xì)胞中無作用,分析表明這種抑制的差異可能是由于甘露糖基在不同分化的細(xì)胞表面表達不同,目前還沒有直接證據(jù)驗證該分析。PA-MSHA處理后HepG2和BEL-7402停滯在S期,是PA-MSHA通過caspase-8介導(dǎo)外部凋亡通路信號引起Hep G2和BEL-7402生長抑制和細(xì)胞死亡的最主要原因[12]。

研究也發(fā)現(xiàn)PA-MSHA通過EGFR/Akt/IItβIt/IAk途徑在肝癌中的作用。該研究用熒光素標(biāo)記的雪花蓮凝集素測定肝癌細(xì)胞表面甘露糖基的情況,雪花蓮凝集素可以與含有甘露糖殘基的結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘露糖殘基在MHCC97L和HepG2細(xì)胞的質(zhì)膜上表達較強,而在HL-7702細(xì)胞上表達較弱。癌細(xì)胞和PA-MSHA孵育24 h后甘露糖基明顯減少,與正常肝細(xì)胞比較肝癌細(xì)胞中甘露糖基的表達水平較高。PA-MSHA通過與甘露糖基結(jié)合,競爭性地抑制了雪花蓮凝集素與甘露糖基的結(jié)合。PA-MSHA對肝癌細(xì)胞的增殖具有濃度和時間依賴性的累積抑制作用。PA-MSHA通過增強Fas和FasL的表達,進而激活caspase- 3和caspase 8,從而顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。異常糖基化途徑可以阻止GlcNAc分支,使高甘露糖簇變得容易被PA-MSHA接觸,因此Fas/FasL的升高可能進一步促進PA-MSHA與甘露糖基的結(jié)合,并促進PA-MSHA的腫瘤細(xì)胞毒性作用。該研究的創(chuàng)新點在于PA-MSHA治療組腫瘤組織中Snail和Slug mRNA水平顯著降低,即全身給藥PA-MSHA能抑制體內(nèi)HCC的EMT上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。另一個創(chuàng)新是提出PA-MSHA誘導(dǎo)G1阻滯可能是通過抑制Akt的活性上調(diào)p21和p27的表達,進而抑制CDKs的活性,拓展了PA-MSHA作用于EGFR/Akt/IItβIt/IAk的途徑[12]。

程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分布廣泛。PD-L1在腫瘤浸潤T細(xì)胞(TILs)上與其受體程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)結(jié)合,通過促進T細(xì)胞無能和衰竭,促進活化T細(xì)胞凋亡,抑制T細(xì)胞活性和增殖,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。PD-L1的表達和活性受糖基化修飾的直接影響。首先,通過糖基化使PD-L1蛋白穩(wěn)定,糖基化PD-L1(GPD-L1)的半衰期至少比非糖基化PD-L1長4倍。其次,糖基化的PD-L1和PD-1結(jié)合的能力更強。最新研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA顯著抑制HCC細(xì)胞PD-L1的表達,可能機制:①PA-MSHA抑制β-catenin、c-Myc,抑制PD-L1轉(zhuǎn)錄;②PA-MSHA影響PD-L1的糖基化[13]。

1.2.3乳腺癌 用PA-MSHA處理乳腺癌細(xì)胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231HM,顯微鏡觀察顯示部分細(xì)胞失去粘附,細(xì)胞發(fā)生收縮、脫落、細(xì)胞膜破壞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離,直接影響了癌細(xì)胞的黏附與遷移功能。當(dāng)PA-MSHA濃度增加時凋亡細(xì)胞聚集、脫離底物并死亡的數(shù)量顯著增加,當(dāng)PA-MSHA濃度再增加時核濃縮、細(xì)胞質(zhì)圓變和核碎裂并形成大量分離的染色質(zhì)濃縮片段。PA-MSHA作用MDA-MB-231HM和MDA-MB-468超過24 h才出現(xiàn)procaspase-3,procaspase-8,procaspase-9呈劑量依賴性減少,Fas蛋白呈劑量依賴性增加。不同濃度的PA-MSHA均能誘導(dǎo)乳腺癌G0/G1期阻滯,PA-MSHA濃度較大時甚至出現(xiàn)了G2/M期阻滯。該研究表明PA-MSHA誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的機制可能是通過死亡受體信號通路和其他一些線粒體或EGFR相關(guān)通路觸發(fā)的caspase激活介導(dǎo)的[14]。

EGFR稱為Her-1,是具有高甘露糖基表達的跨膜糖蛋白,研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA對沉默EGFR后的乳腺癌細(xì)胞敏感性降低到與對照組相同的水平,沉默EGFR顯著降低PA-MSHA對細(xì)胞的毒性作用,PA-MSHA治療種植瘤小鼠的腫瘤中pEGFR、pAkt和pERK下降。在腫瘤細(xì)胞表面大量未成熟的高甘露糖基形式的EGFR與PA-MSHA反應(yīng),失去了抑制EGFR的糖苷自發(fā)二聚化的能力,導(dǎo)致受體的自動磷酸化和交叉磷酸化以及進一步傳播信號的能力,最后caspase-9和caspase-8的激活,進而激活caspase-3,最終誘導(dǎo)凋亡[14]。

有研究探討了利用PA-MSHA克服人乳腺癌多柔比星耐藥的可能性及其機制。Sequestosome 1 (SQSTM1,p62)是一種即時早期反應(yīng)基因,在激活抗凋亡基因和促進細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多個存活信號通路方面具有重要作用。p62的積累激活了核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)的表達,然后Nrf2通過直接結(jié)合p62啟動子的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)基序進一步促進p62的上調(diào)。Nrf2是一種有效的轉(zhuǎn)錄激活因子,可以識別和結(jié)合靶基因啟動子的ARE,并通過控制基因轉(zhuǎn)錄來維持氧化還原平衡。在惡性轉(zhuǎn)化過程中Nrf2的激活促進了腫瘤的發(fā)展并有助于化療耐藥,Nrf2的激活被認(rèn)為是獲得性多柔比星耐藥的原因[15]。Nrf2可以上調(diào)ATP結(jié)合和轉(zhuǎn)運蛋白,如MRP3、MRP4或MRP5等可促進抗癌藥物的外排。Nrf2誘導(dǎo)代謝酶和靶基因有助于抗癌藥物的解毒,從而提高化療耐藥性。WEI等[15]發(fā)現(xiàn)Nrf2和p62在乳腺癌細(xì)胞和組織中都過表達,PA-MSHA通過下調(diào)Nrf2/p62抑制多柔比星耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞的生長,但也指出PA-MSHA抑制Nrf2/p62通路的機制尚不清楚,有待進一步研究。此外Nrf2和p62在肝癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤中表達上調(diào),或許在該方向更深入的研究可以找到PA-MSHA抗腫瘤的新通路。

最新研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA可有效抑制三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)細(xì)胞的增殖、遷移,并誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞的凋亡和周期阻滯,凋亡機制可能與BAX、BCL-2有關(guān)。PA-MSHA增強化療藥物紫杉醇對TNBC的抑制作用,其分子機制可能與PA-MSHA下調(diào)了癌基因NF-κB、c-Myc、CIP2A的表達有關(guān)[16]。

1.2.4胃癌 用PA-MSHA干預(yù)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PA-MSHA特異性地結(jié)合在MKN45細(xì)胞表面使細(xì)胞增殖減慢,數(shù)量減少,體積縮小,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,微絨毛明顯減少。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PA-MSHA穿透胞膜進入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)空泡、染色質(zhì)邊聚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴展、線粒體極斷裂等細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)[8]。

1.2.5鼻咽癌 研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA體外干預(yù)人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F及6-10B后細(xì)胞停滯在G1/S期,這與之前PA-MSHA使肝癌細(xì)胞僅停滯在S期不同。該研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6及凋亡促進蛋白Bax表達上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調(diào),進一步證明PA-MSHA通過DNA受損阻止癌細(xì)胞周期的進展[17]。

1.2.6胰腺癌 PA-MSHA通過阻斷細(xì)胞周期進程,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制胰腺癌生長。PA-MSHA抑制EGFR信號通路和激活caspase通路可能在誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在胰腺癌細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn),PA-MSHA也作用于EGFR/Akt/IItβIt/IAk途徑[18]。

1.2.7宮頸癌 2016年YIN等[19]對宮頸癌HeLa細(xì)胞的研究豐富了PA-MSHA抗腫瘤的分子機制。首先PA-MSHA阻滯細(xì)胞周期在G2/M期,減少S期細(xì)胞的比例,Western blotting檢測促凋亡蛋白BAD、BAX表達增加和抗凋亡蛋白BCL-2減少的表達減少,PA-MSHA降低了HeLa細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白Vimentin和β-catenin的表達,增加了E-cadherin的表達。該研究的創(chuàng)新在于發(fā)現(xiàn)PA-MSHA通過增加PTEN的表達來抑制Akt信號通路的激活。PA-MSHA處理后,HeLa細(xì)胞中PTEN的表達增加,Akt及其下游靶糖原合成酶激酶3胞中PTEN的表達增的磷酸化水平降低。siRNA抑制PTEN顯著增加PA-MSHA處理細(xì)胞中p-Akt和p-GSK3β的表達。PA-MSHA對HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡,削弱HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力部分是通過PTEN/Akt信號通路實現(xiàn)的。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/PTEN/Akt通路在細(xì)胞生長和存活的許多方面都至關(guān)重要。PTEN是一種腫瘤抑制因子,通過減少細(xì)胞膜上PI3K的輸出來下調(diào)Akt信號通路[19]。

1.2.8肺癌 用不同濃度的PA -MSHA處理3種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系pc9、A549和NCI H1975,發(fā)現(xiàn)PA-MSHA對pc9、A549和NCI H1975細(xì)胞具有時間和濃度依賴性的細(xì)胞毒性作用,不同濃度的PA-MSHA均可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯,但沒有更深入的PA-MSHA作用機制的結(jié)果[20]。PA-MSHA可能還具有減輕吉非替尼治療EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)EGFR-TKI耐藥的潛力。吉非替尼和厄洛替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs),通過可逆結(jié)合EGFR阻斷EGFR信號通路,然而幾乎所有的患者EGFR基因突變并對這些藥物產(chǎn)生了耐藥性[21]。研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的EGFR-TKI耐藥,PA-MSHA通過抑制EGFR信號通路增強吉非替尼的抗增殖和凋亡作用,恢復(fù)吉非替尼對EGFR-TKI耐藥細(xì)胞的敏感性。吉非替尼聯(lián)合PA-MSHA處理后,3種細(xì)胞系中RB、P21和E2F-1均明顯增加,這解釋了為什么細(xì)胞阻滯在sub-G1期。相反在G0/G1向S期轉(zhuǎn)換中起主要正向作用的Cyclin E則下降得更明顯。因此吉非替尼聯(lián)合PA-MSHA的療效可能部分來自于介導(dǎo)G0/G1阻滯的分子調(diào)節(jié)劑的作用[21]。吉非替尼和PA-MSHA能夠抑制包括A549在內(nèi)的3種肺癌細(xì)胞株中EGFR介導(dǎo)的p-Akt和p-ERK通路。但由于A549細(xì)胞中EGFR的表達明顯低于其他肺癌細(xì)胞,因此PA-MSHA可能通過其他途徑抑制A549細(xì)胞中Akt或ERK的活性。該研究提到PA-MSHA通過IRE1信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))應(yīng)激,表明PA-MSHA聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑也可能通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路促進癌細(xì)胞凋亡。最后分析表明吉非替尼和PA-MSHA的下游信號通路存在串?dāng)_,EGFR通路與其他信號通路的串?dāng)_效應(yīng)需要通過詳細(xì)的實驗來驗證[21]。

2 PA-MSHA臨床抗腫瘤應(yīng)用

2.1膀胱癌 膀胱癌是較為常見的泌尿系腫瘤,非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer,NMIBC)占所有膀胱癌的70%～80%,首選的手術(shù)方式為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(trasnurethral resection of bladder tumor,TUR-BT),術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)率。有研究評估了68 例NMIBC患者在行TUR-BT術(shù)后膀胱灌注PA-MSHA和74例膀胱內(nèi)灌注吡柔比星(pirarubicin,THP)的安全性差異和復(fù)發(fā)率的區(qū)別,PA-MSHA比THP有更好的安全性,即不良反應(yīng)(急性膀胱炎,血尿,發(fā)熱,胃腸道反應(yīng)等)發(fā)生率更低,復(fù)發(fā)率無明顯差異,且PA-MSHA 能改善患者的細(xì)胞免疫功能[22]。

2.2肝癌 PA-MSHA制劑目前作為肝癌術(shù)后的輔助治療。在肝動脈化療栓塞術(shù)術(shù)后皮下注射PA-MSHA,與對照組比較肝癌病灶緩解更快,療效更好[22]。

2.3乳腺癌 PA-MSHA制劑目前作為乳腺癌術(shù)后的輔助治療,皮下注射提高腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α及干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)在體內(nèi)的水平,使得腫瘤細(xì)胞對于化療的敏感性增加,從而達到治療乳腺癌、延長生存期的作用。對于乳腺癌癌性潰瘍的患者,PA-MSHA 聯(lián)合常規(guī)化療的治療方式比單純的常規(guī)化療具有更好的療效[22]。

2.4胃癌 PA-MSHA多用于胃癌術(shù)后腹膜轉(zhuǎn)移的預(yù)防,使用途徑為術(shù)中腹腔注射。有研究評估了PA-MSHA腹腔噴灑和經(jīng)腸系膜組織注射對胃癌患者術(shù)后免疫狀態(tài)的影響及安全性,發(fā)現(xiàn)PA-MSHA腸系膜組織注射給藥能夠通過調(diào)節(jié)胃癌患者術(shù)后特異性免疫與非特異性免疫改善患者術(shù)后抗腫瘤免疫能力。PA-MSHA 腸系膜組織注射給藥與腹腔噴灑給藥方式比較,前者對胃癌術(shù)后外周血淋巴細(xì)胞、血清IL-10濃度、血清IL-12濃度的抗腫瘤正向調(diào)節(jié)作用更顯著。PA-MSHA 腸系膜組織注射給藥具有臨床安全性,但需要注意免疫炎癥反應(yīng)引起的連續(xù)高熱,積極降溫處理[3]。

2.6PA-MSHA的其他臨床應(yīng)用 PA-MSHA治療腫瘤患者的應(yīng)用除了對腫瘤細(xì)胞直接作用和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的間接作用,PA-MSHA還被用于注射治療惡性胸腔積液、心包積液和腋窩淋巴結(jié)切除術(shù)后血腫,對腫瘤患者淋巴結(jié)清掃后乳糜瘺的治療也有很好的效果。乳糜瘺的定義是淋巴液從胸導(dǎo)管或淋巴管滲漏,典型表現(xiàn)為乳白色或乳白色液體引流增加。改變飲食、局部加壓敷料、負(fù)壓引流、奧曲肽治療是乳糜瘺的主要初始治療方法,然而保守治療對部分患者無效。PA-MSHA治療乳糜瘺的機制與其他硬化劑類似:它啟動組織表面之間的局部強烈炎癥反應(yīng),導(dǎo)致纖維化粘連和自發(fā)性瘺管閉合。有報道,2例甲狀腺術(shù)后頸淋巴結(jié)乳糜瘺,應(yīng)用生長抑素及奧曲肽治療效果均不理想后在實時超聲引導(dǎo)下在左側(cè)鎖骨上區(qū)積液處注射PA-MSHA制劑2 mL,2例患者均在PA-MSHA治療后2～4 d內(nèi)痊愈,無明顯副作用[25]。更大樣本的前瞻性研究驗證局部注射PA-MSHA可有效治療保守治療無效的頸淋巴清掃術(shù)后乳糜瘺[26]。局部皮下噴涂PA-MSHA制劑(PAP)減少乳腺癌患者術(shù)后引流量,縮短引流時間,防止乳腺癌術(shù)后血腫的發(fā)生。由于PA-MSHA是一種滅活細(xì)菌制劑,注射后最常見的不良反應(yīng)是發(fā)熱。該研究中PAP組發(fā)熱(低于39 ℃)持續(xù)6～12 h,術(shù)后24 h內(nèi)自行緩解,其他并發(fā)癥未見增加。PAP可緩解患者局部癥狀,提高患者生活質(zhì)量,為進一步治療節(jié)省寶貴時間[27]。

3 總結(jié)及展望

經(jīng)過眾多臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究,PA-MSHA已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中有重要價值。目前已發(fā)現(xiàn)PA-MSHA治療腫瘤的機制明確有2個方面:首先,PA-MSHA可影響EGFR/Akt/IκBβ/NF-κB或EGFR/MEK/ERK通路,促進細(xì)胞凋亡、抑制侵襲遷移、分化、改變耐藥和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化狀態(tài)。其次,PA-MSHA通過TLR誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟,有效誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化,激活、增強巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞對腫瘤的免疫殺傷和抑制作用。EGFR及TLR樣受體是具有高甘露糖基表達的跨膜糖蛋白,包括PA-MSHA對M1巨噬細(xì)胞的極化也與NF-κB表達的激活有關(guān)。最新研究表明PA-MSHA除了和其靶點即細(xì)胞表面受體蛋白所含的甘露糖基直接作用,PA-MSHA能通過細(xì)胞的內(nèi)在機制降低甘露糖基的表達,并抑制肝癌細(xì)胞PD-L1、sPD-L1的表達[13]。PA-MSHA應(yīng)用基于手術(shù)或化療的輔助用藥,即以免疫調(diào)節(jié)劑的角色發(fā)揮其抗腫瘤功能。PA-MSHA的給藥途徑及其基礎(chǔ)研究的局限限制其臨床應(yīng)用。當(dāng)前PA-MSHA的作用機制未明,急需在既往研究的基礎(chǔ)上探索PA-MSHA的作用機制。筆者較全面地總結(jié)了當(dāng)前PA-MSHA研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用,認(rèn)為以PA-MSHA的特異性受體高甘露糖基膜蛋白為中心研究PA-MSHA的作用機制可能是揭示PA-MSHA的作用機制及拓展PA-MSHA臨床應(yīng)用的希望,闡明PA-MSHA和甘露糖基之間的深層次關(guān)系對PA-MSHA的后續(xù)研究及臨床應(yīng)用有重大意義。