劉芮綺,袁天翊,王冉冉,鄭瑞芳,龔迪菲,王守寶,,邢建國,杜冠華,方蓮花

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;3.新疆藥物研究所新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830004)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種由于肺血管阻力增加,肺動(dòng)脈壓力上升導(dǎo)致的病理生理障礙,其診斷標(biāo)準(zhǔn)為在海平面靜息狀態(tài)(不同的海拔高度可以換算為海平面),通過右心導(dǎo)管測(cè)量的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)≥ 25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)[1]。PH的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,與許多個(gè)體和環(huán)境因素有關(guān),通常導(dǎo)致肺血管收縮、肺血管平滑肌異常增生和肺血管重構(gòu),最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡[2]。

目前根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制可將PH分為5類,其中第三類低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是由缺氧和肺部疾病導(dǎo)致的PH[3],主要包括慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、合并肺纖維化和肺氣腫、結(jié)節(jié)病、阻塞性睡眠呼吸暫停和高海拔導(dǎo)致的低通氣和缺氧相關(guān)的PH等[4]。在眾多刺激因素中,缺氧在HPH的產(chǎn)生與發(fā)展中起重要作用。通常由于高海拔或慢性缺氧肺疾病等導(dǎo)致缺氧,進(jìn)而導(dǎo)致肺血管收縮,激活缺氧敏感的炎癥反應(yīng)和增殖途徑以及肺實(shí)質(zhì)的重塑和破壞[2]。病理特征包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、信號(hào)傳導(dǎo)異常、多細(xì)胞和血管的異常增生等[5]。這一過程導(dǎo)致更持續(xù)的血管阻力,引起右心室壓力升高及右心衰竭[6]。目前臨床治療方案包括靶向血管收縮和增殖的信號(hào)通路,但僅能緩解癥狀,很難逆轉(zhuǎn)右心室重構(gòu),因此尋找新的潛在治療藥物具有重要意義[7]。

祖卡木顆粒(Zukamugranules)作為一種維吾爾族的特色民族藥,具有調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)及清熱、發(fā)汗、通竅等功效,用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等[8]。近年來對(duì)于其治療新型冠狀病毒肺炎等肺損傷疾病的研究提示,祖卡顆粒對(duì)于肺部具有一定的保護(hù)和抗炎治療作用[9],生物信息學(xué)研究亦顯示祖卡木復(fù)方可調(diào)控多條炎癥相關(guān)信號(hào)通路[10-12]。因此本文研究其對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的潛在防治作用,并開展了生物信息學(xué)研究、藥效學(xué)驗(yàn)證以及其作用機(jī)制的探究。

1 材料與方法

1.1祖卡木主要成分篩選及靶點(diǎn)獲取 根據(jù)祖卡木

顆粒配方:山柰、睡蓮花、破布木果、薄荷、大棗、洋甘菊、甘草、蜀葵子、大黃、罌粟殼。通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP,http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和Traditional Chinese Medicines Integrated Database(TCMID,https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索收集全部主要成分[13-14]。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)是評(píng)價(jià)化合物在藥物代謝過程中的重要參數(shù),活性化合物的選擇參數(shù)設(shè)置為OB>30%,DL>0.18。其中,洋甘菊[15-16]、破布木果[17]和蜀葵子[18]的個(gè)別成分通過文獻(xiàn)中獲得,并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫檢索獲得化合物的SMILES號(hào)?；诮Y(jié)構(gòu)相似性原理在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中檢索化合物可能性大于0.1的靶點(diǎn)(http://www.swisstargetprediction.ch/)[19]。

1.2肺動(dòng)脈高壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“低氧性肺動(dòng)脈高壓”為關(guān)鍵詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)中進(jìn)行檢索[20-21],并去除其中的重復(fù)基因,篩選評(píng)分大于10的靶點(diǎn)。將活性成分靶點(diǎn)與HPH相關(guān)靶點(diǎn)的交集作為祖卡木顆粒治療HPH的潛在靶點(diǎn)[22]。

1.3中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.9.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析節(jié)點(diǎn)的度值、中心性、平均最短路徑等拓?fù)鋮?shù),并分析其中的主要節(jié)點(diǎn)信息。

1.4蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)通過蛋白質(zhì)之間的直接的物理相互作用和間接的功能相關(guān)性構(gòu)建祖卡木顆粒潛在靶點(diǎn)之間的交互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[23]。

1.5基因本體(gene ontology,GO)和京者基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 使用The Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery (DAVID,https://david.ncifcrf.gov/home.jsp,ver.6.8)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析[24]。將主要成分與疾病相關(guān)的交集基因輸入,選擇物種為“人類”并分別進(jìn)行生物過程、分子功能、細(xì)胞組成和KEGG途徑富集分析。將P值最小的前20項(xiàng)及其參數(shù)上傳到微生信(bioinformatics.com.cn)在線平臺(tái)中進(jìn)行進(jìn)一步的可視化分析。

1.6實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性C57BL16小鼠64只,體質(zhì)量約20～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng),恒溫(24～26 ℃)、恒濕(相對(duì)濕度30%～40%)環(huán)境,自由攝食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2019-0023,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)00004971。針對(duì)動(dòng)物的所有實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作均符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則。

1.6.2藥品與試劑 西地那非(美國Selleck公司,純度:99.5%),以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成10 mg·mL-1混懸液;祖卡木顆粒(新疆銀朵蘭藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):211214),以溫水配制成540 mg· mL-1溶液;Su5416(美國MCE公司,純度:99.96%),使用時(shí)將Su5416用二甲亞砜(DMSO,5%)+PEG300(40%)+聚山梨酯80(Tween80,5%)+超純水(50%)混合溶劑配制成2 mg·mL-1溶液;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.6.3儀器與設(shè)備 BL420S生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);Millar微型壓力導(dǎo)管(美國MILLAR公司,r=82 mm);高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司,Allegra X-22R,r=82 mm);SpectraMaxM5酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices公司);Attendor 140 Pro低氧艙(廣州華粵行公司)。

1.6.4單純低氧兩周預(yù)防給藥實(shí)驗(yàn) 在單純低氧兩周預(yù)防給藥模型中,將32只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、西地那非組及祖卡木組,實(shí)驗(yàn)方案如圖1所示。祖卡木組灌胃給予祖卡木顆?；鞈乙?.4 g· kg-1,西地那非組灌胃給予西地那非溶液0.1 g· kg-1,正常對(duì)照組、模型對(duì)照組均灌胃給予等體積相應(yīng)溶劑。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)后,預(yù)防給藥3 d,每日1次。此后除正常對(duì)照組飼養(yǎng)在常氧環(huán)境中外,其余3組置低氧艙飼養(yǎng)2周,氧含量10%,期間每日給藥1次。使用模型為低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓經(jīng)典模型[25],給藥劑量由祖卡木顆粒說明書劑量換算得小鼠劑量。

圖1 單純低氧2周預(yù)防給藥實(shí)驗(yàn)方案

1.6.5低氧4周+Su5416治療給藥實(shí)驗(yàn) 分組及給藥劑量同“1.6.4節(jié)”。如圖2所示,動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,除正常組飼養(yǎng)在常氧環(huán)境中,其余3組置低氧艙飼養(yǎng)4周,氧含量10%,前2周每周皮下注射Su5416(20 mg· kg-1)1次。第3周起每日給藥1次。

圖2 低氧4周+Su5416治療給藥實(shí)驗(yàn)方案

1.6.6稱重觀察 實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠狀態(tài)和死亡情況,記錄體質(zhì)量等指標(biāo)。

1.6.7實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)用異氟烷麻醉小鼠,通過米勒導(dǎo)管測(cè)量右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)并通過腹主動(dòng)脈取血。將小鼠由腹部剪開至胸腔,打開胸腔暴露心臟,針頭由右心室心尖進(jìn)入,用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌注至灌洗液無明顯紅色、器官泛白為止。取小鼠心、肝、脾、肺、腎,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,濾紙吸干水分,分析天平稱質(zhì)量,臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。沿心耳下緣將整個(gè)心室從心臟上剪下,沿心室間隔邊緣剪下右心室,稱量右心室(right ventricular,RV)及左心室加室間隔(left ventricular+septum,LV+S)質(zhì)量,計(jì)算RV/(LV+S),確定有無右心室肥厚。

1.6.8Masson染色觀察病理損傷情況 分離小鼠左肺,立即用鹽水沖洗,然后在4%多聚甲醛中固定24 h。在脫水和清除后,將肺包埋在石蠟中。石蠟包埋的組織用Masson染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片的形態(tài)變化,獲得顯微照片。

1.6.9蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB)檢測(cè)蛋白表達(dá) 將小鼠肺組織剪碎并在冰上研磨,收集組織在1.5 mL離心管內(nèi),加入適量RIPA裂解液,經(jīng)組織勻漿和超聲處理后置于冰上繼續(xù)裂解直至裂解完全,經(jīng)4℃12 000 r·min-1離心20 min取上清。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)法進(jìn)行總蛋白定量。取總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。PVDF膜浸泡于5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫下封閉2 h。以Bcl-2-相關(guān)X蛋白質(zhì)(Bcl-Associated X,Bax)(1：1 000)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma,Bcl-2)(1：1000)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidase synthase,eNOS)(1：1 000)、低氧誘導(dǎo)因子-1α亞基(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)(1：1 000)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)(1：1 000)、兔抗p-PI3K(1：1 000)、鼠抗β-actin(1：1 000)抗體進(jìn)行孵育,4 ℃過夜。洗膜后,二抗與PVDF膜于室溫下作用2 h,再次洗膜。將發(fā)光液A和B等量混勻,在PVDF膜上滴加適量的ECL發(fā)光試劑,室溫下作用1 min,并使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism9.5版軟件作圖,one-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1祖卡木顆?；钚猿煞趾桶悬c(diǎn)的篩選 根據(jù)OB和DL等化合物的性質(zhì),從10種草藥中篩選出主要成分167個(gè)。其中山奈酚、柚皮苷、蘆薈大黃素、木犀草苷、光千金藤堿、藍(lán)堇堿、兒茶素、槲皮素、4-羥基苯甲酸、丁香酸同時(shí)存在于多種草本植物中。基于結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)可能性>0.1的靶點(diǎn)897個(gè),低氧性肺動(dòng)脈高壓疾病靶點(diǎn)去重后篩選評(píng)分>10的靶點(diǎn)701個(gè),取交集后共同靶點(diǎn)179個(gè)。見圖3。

圖3 祖卡木顆粒主要活性成分靶點(diǎn)、HPH疾病靶點(diǎn)和共同靶點(diǎn)

2.2祖卡木顆粒中抗HPH相關(guān)成分與靶點(diǎn)的相互作用分析 利用Cytoscape軟件構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4所示,網(wǎng)絡(luò)由356個(gè)節(jié)點(diǎn)(主要成分10個(gè)、化合物167個(gè)和HPH相關(guān)靶點(diǎn)179個(gè))和3 365個(gè)相互作用組成。外圈代表祖卡木處方中的各藥物及其主要成分,中間藍(lán)色矩形表示通過文獻(xiàn)及預(yù)測(cè)的祖卡木與HPH的共同靶點(diǎn),連線表示其相互作用,節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深表示該節(jié)點(diǎn)度值越大。結(jié)果表明,網(wǎng)絡(luò)中度參數(shù)較高的化合物包括山奈酚、木犀草苷、槲皮素、蘆薈大黃素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等,這些化合物可能在祖卡木的抗HPH作用中發(fā)揮更重要的作用。

圖4 祖卡木藥物-主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3構(gòu)建PPI與分析網(wǎng)絡(luò) 度值是指連接的鏈接數(shù)與相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù),是反應(yīng)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的拓?fù)鋮?shù)。使用STRING工具構(gòu)建了祖卡木顆粒治療HPH的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),邊表示PPI的相互作用,節(jié)點(diǎn)的顏色強(qiáng)度與網(wǎng)絡(luò)中的度值成正比。如圖5所示,PI3KCA等關(guān)鍵靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的相互聯(lián)系更強(qiáng),也參與多種信號(hào)通路,可能在祖卡木的抗HPH作用中發(fā)揮更關(guān)鍵的作用。

圖5 祖卡木對(duì)HPH潛在靶點(diǎn)構(gòu)建PPI的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)分析

2.4GO分析 利用DAVID平臺(tái)對(duì)祖卡木治療HPH中的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,包括這些靶點(diǎn)參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組成KEGG途徑富集分析。點(diǎn)的大小表示富集目標(biāo)的數(shù)量,點(diǎn)的顏色代表基于P值的顯著性程度。如圖6-A所示,潛在的治療靶點(diǎn)參與多個(gè)生物過程,包括“低氧反應(yīng)”“藥物反應(yīng)”“激素反應(yīng)”;包括“血漿組成”“膜筏”在內(nèi)的細(xì)胞組成(圖6-B)以及“酶結(jié)合”“激酶活性”在內(nèi)的分子功能(圖6-C),提示低氧過程可能是疾病進(jìn)展的重要因素。

A.生物過程;B.細(xì)胞成分;C.分子功能;D.KEGG分析圖。

2.5KEGG分析 為了進(jìn)一步闡述靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系,使用KEGG數(shù)據(jù)庫和KEGG Mapper在線工具進(jìn)行通路富集分析。顏色深淺表示不同的P值(P<0.05),而圓圈的大小表示數(shù)目。結(jié)果顯示,這些靶點(diǎn)主要參與增殖相關(guān)通路等(圖6-D)。

2.6實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.6.1單純低氧兩周預(yù)防給藥模型藥效學(xué)評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)中觀察到模型對(duì)照組小鼠與正常對(duì)照組比較欠活潑,精神萎靡。如圖7-A所示,預(yù)防給藥階段3組小鼠的體質(zhì)量均呈逐漸增加,其中祖卡木組的上升趨勢(shì)最為明顯。進(jìn)入低氧環(huán)境后,3組小鼠體質(zhì)量均明顯降低。與模型對(duì)照組比較,西地那非與祖卡木對(duì)體質(zhì)量無明顯改善。

①與正常對(duì)照組比較,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,P<0.05。

RVSP是檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓的金指標(biāo)[26]。如圖7-B及7-C所示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠RVSP顯著升高(35.79 mmHgvs.25.43 mmHg,P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,西地那非組(27.90 mmHgvs.35.79 mmHg,P<0.01)與祖卡木組(29.78 mmHgvs.35.79 mmHg,P<0.05)RVSP均顯著下降。小鼠的右心室指數(shù)和心臟指數(shù)是評(píng)價(jià)心室重構(gòu)的重要指標(biāo)。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組右心室指數(shù)顯著增加(P<0.01),模型對(duì)照組西地那非組與祖卡木組比模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組和西地那非組的心臟指數(shù)(圖7-F)和心室指數(shù)(圖7-E)有輕微增加,而祖卡木組輕微下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同臟器指數(shù)可以作為評(píng)價(jià)藥物調(diào)節(jié)作用的重要指標(biāo)。肺指數(shù)通?？纱矸涡圆∽兊膰?yán)重程度,由于炎性滲出等原因使肺重量增大,肺指數(shù)越大提示肺病變?cè)絿?yán)重。如圖7-G至7-J顯示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組的肺指數(shù)顯著升高(P<0.02)。與模型對(duì)照組比較,西地那非組與祖卡木組的肺指數(shù)僅輕微降低,無明顯變化。脾臟是體內(nèi)免疫的中樞,西地那非組與正常對(duì)照組比較脾指數(shù)明顯降低,而祖卡木組比西地那非組明顯升高。肝指數(shù)與腎指數(shù)均無明顯影響。

2.6.2低氧4周+Su5416治療給藥模型藥效學(xué)評(píng)價(jià) 如圖8-A所示,當(dāng)對(duì)模型對(duì)照組、西地那非組和祖卡木組進(jìn)行低氧加皮下注射Su5416后,3組小鼠體質(zhì)量明顯下降。給藥后祖卡木組體質(zhì)量水平與其他兩組比較上升趨勢(shì)最為明顯。

①與正常對(duì)照組比較,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,P<0.05。

將小鼠肺組織固定、包埋、切片,Masson染色法觀察肺組織尤其是肺動(dòng)脈血管病理變化(圖8-C)。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠肺血管明顯增厚(P<0.01),西地那非組和祖卡木組肺部病理狀態(tài)有所改善(P<0.01)。

如圖8-B及8-E所示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠RVSP顯著升高(29.07 mmHgvs.22.18 mmHg,P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,西地那非組與祖卡木組RVSP均顯著下降(25.84 mmHgvs.29.07 mmHg,22.93 mmHgvs.29.07 mmHg,P<0.01),提示兩者對(duì)肺動(dòng)脈高壓均有一定治療效果,且祖卡木效果優(yōu)于陽性藥西地那非。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組右心室指數(shù)顯著上升(P<0.01),右心室指數(shù)祖卡木組與模型對(duì)照組比較,顯著下降(P<0.05),提示祖卡木對(duì)于減緩肺高壓引起的右心室重構(gòu)有一定作用。與模型對(duì)照組比較,西地那非組右心室指數(shù)也有一定降低(圖8-F)。對(duì)于心重指數(shù)和心室指數(shù),4組均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8-G及8-H)。

圖8-I至8-L顯示,與正常對(duì)照組比較,其余3組的肺指數(shù)顯著升高;與模型對(duì)照組比較,祖卡木組的肺指數(shù)有所降低。而對(duì)于脾指數(shù),與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組脾指數(shù)明顯降低,西地那非組與祖卡木組均有所回升。

2.6.3祖卡木下調(diào)肺組織中Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)Bax的表達(dá) 為了探討祖卡木對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血管重構(gòu)保護(hù)作用的可能機(jī)制,本研究檢測(cè)了肺組織中Bcl-2以及Bax的蛋白水平。結(jié)果表明,缺氧可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)并下調(diào)Bax的表達(dá)(P<0.01),而西地那非和祖卡木可以有效逆轉(zhuǎn)這一情況(P<0.05),見圖9。

①與正常對(duì)照組比較,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,P<0.05;③與模型對(duì)照組比較,P<0.01;④與正常對(duì)照組比較,P<0.01。

2.6.4祖卡木上調(diào)肺組織中PI3K及eNOS的表達(dá)并降低HIF-1α的表達(dá) PI3K是具有磷脂酰肌醇激酶活性的二聚體,由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成[27]。NOS分為三類:內(nèi)皮型NOS (endothelial NOS,eNOS )、誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS,iNOS)、神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS,nNOS)。實(shí)驗(yàn)使用Western blotting方法檢測(cè)了小鼠肺組織中PI3K亞基p85、磷酸化p85、eNOS及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平。圖10所示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組p85、p-p85及eNOS的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),HIF-1α的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。西地那非和祖卡木均可以顯著上調(diào)p85、p-p85及eNOS的表達(dá)水平并下調(diào)HIF-1α的表達(dá)(P<0.01)。

①與正常對(duì)照組比較,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,P<0.05。

3 討論

祖卡木顆粒作為我國民族藥的重要瑰寶,在治療上呼吸道疾病以及急性肺損傷等疾病中發(fā)揮了重要作用。既往研究主要集中在其對(duì)于呼吸道感染及肺部疾病的抗炎和免疫治療作用,而缺乏對(duì)于HPH的防治研究及其可能機(jī)制的探討[28-29]。本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析手段對(duì)祖卡木顆粒中的主要生物活性化合物、潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)其可能的分子作用機(jī)制,并在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行預(yù)防及治療實(shí)驗(yàn)藥效的初步驗(yàn)證,最后通過分子生物學(xué)分析驗(yàn)證其發(fā)揮作用的潛在信號(hào)通路,首次發(fā)現(xiàn)了祖卡木顆粒對(duì)于HPH的防治作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了多組分和多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,更好地闡明了疾病和藥物相關(guān)的基因靶點(diǎn)相互關(guān)系。通過PPI富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PIK3CA、HIF-1等基因可能是祖卡木顆粒作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PIK3CA的激活突變?cè)谠S多疾病中常見,導(dǎo)致PI3K活性增加、下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)、細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[30]。此外,GO和KEGG分析預(yù)測(cè)祖卡木顆粒的潛在作用機(jī)制可能與低氧及增殖相關(guān)信號(hào)通路有關(guān),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及信號(hào)通路的選擇提供了理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn),PI3K可以調(diào)控HIF-1α的表達(dá),缺氧誘導(dǎo)因子作為肺缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,與HPH的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[31]。HIF-1α可進(jìn)一步調(diào)節(jié)參與糖代謝和血管生成的下游蛋白的表達(dá),如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。缺氧條件啟動(dòng)HIF-α亞基與HIF-β亞基的核轉(zhuǎn)位和結(jié)合,而激活的HIF通過誘導(dǎo)或抑制廣泛的基因參與調(diào)節(jié)血管張力、血管生成、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞代謝、增殖、存活和自噬反應(yīng),從而啟動(dòng)對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng),因此在PH病理狀態(tài)下HIF-α表達(dá)量增高[32]。

此外,PI3K屬于脂質(zhì)激酶家族,其特點(diǎn)是能夠磷酸化質(zhì)膜中肌醇磷脂中的肌醇環(huán)3'-OH基團(tuán)[33]。eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO所必需,PI3K-eNOS信號(hào)通路在各種細(xì)胞遷移增殖、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)中起著重要作用,且eNOS受PI3K的調(diào)控。HIF-1α被認(rèn)為與氧水平密切相關(guān)并激活PI3K通路,而NO在無氧情況下有助于HIF-1α的穩(wěn)定[34]。在包括木樨草素、桔梗湯、丹參酮IIA等多種復(fù)方藥物及天然產(chǎn)物對(duì)于PH及其他肺部疾病的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt-eNOS及HIF-Arg-NO途徑是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路[35-37]。

肺動(dòng)脈重塑與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和凋亡抑制有關(guān),eNOS也被證明通過抑制促凋亡蛋白在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[34]。細(xì)胞凋亡是在生理或病理?xiàng)l件下細(xì)胞自發(fā)死亡的過程,在細(xì)胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用[38]。其中Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白,而Bax是一種促凋亡蛋白,增強(qiáng)線粒體凋亡通路,抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖可以改善PH[39],也是許多針對(duì)PH中血管增殖重構(gòu)的藥物研究的經(jīng)典通路[40]。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果,預(yù)測(cè)祖卡木治療肺高壓的潛在靶點(diǎn)可能與缺氧及增殖相關(guān)通路最為密切,且PI3K可能作為一個(gè)核心靶點(diǎn)。因此我們選擇PI3K作為核心靶點(diǎn),探究其下游兩個(gè)通路(HIF-1α及eNOS)以及增殖相關(guān)通路Bax/Bcl進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究選擇單純低氧2周與低氧4周+Su5416 2個(gè)動(dòng)物模型進(jìn)行藥效學(xué)探究。單純低氧2周小鼠模型可模擬突發(fā)性低氧所致機(jī)體障礙,是快速評(píng)價(jià)治療HPH藥物效果的首選模型,因此選擇其作為藥效初篩模型。Su5416是一種血管新生抑制劑,能抑制低氧所致肺血管新生,低氧合并Su5416模型可加重小鼠肺血管損傷,與臨床患者病理表現(xiàn)相近,可作為長(zhǎng)期藥效評(píng)價(jià)模型[25]。在2個(gè)模型中均驗(yàn)證了祖卡木顆粒對(duì)于HPH的預(yù)防及治療作用,其可以顯著降低RVSP,明顯減輕小鼠右心室肥厚,效果優(yōu)于陽性藥西地那非。

為了探究祖卡木顆粒對(duì)HPH治療作用的分子機(jī)制,本研究檢測(cè)了肺組織中相關(guān)信號(hào)通路的變化。研究結(jié)果顯示,祖卡木可下調(diào)肺組織中Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)Bax的表達(dá),提示祖卡木可能通過抑制細(xì)胞的增殖發(fā)揮治療作用,此外可上調(diào)肺組織中PI3K及eNOS的表達(dá)并降低HIF-1α的表達(dá),提示激活PI3K-eNOS及抑制HIF-1α信號(hào)通路可能是祖卡木發(fā)揮治療作用的潛在機(jī)制。本研究可以為祖卡木顆粒的基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用提供思路和拓展,也為HPH的臨床治療提供潛在的治療藥物。但目前這些結(jié)果只是祖卡木顆粒作用機(jī)制的線索,后續(xù)還應(yīng)采用Bax/Bcl及PI3K/Akt抑制劑等對(duì)該通路進(jìn)行干預(yù)以確證祖卡木顆粒的作用機(jī)制。

綜上所述,論文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段分析預(yù)測(cè)了民族藥祖卡木顆粒治療HPH的作用靶點(diǎn),并通過兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行了藥效學(xué)驗(yàn)證及分子生物學(xué)分析。首次揭示了祖卡木顆?？赡芡ㄟ^Bax/Bcl及PI3K-eNOS/HIF-1α通路對(duì)HPH起到治療作用,為后續(xù)開發(fā)新的治療藥物及拓展祖卡木顆粒適應(yīng)證提供了新的選擇。