譚文溚,胡博軍,黃貝,張?chǎng)?王淑美,臧林泉,杜冠華

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510006;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;3.河南大學(xué)藥學(xué)院,開(kāi)封 475004)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS),是指腦血管病變、血液成分異?；蚱渌蛞l(fā)的腦血管狹窄或閉塞,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織局部供血、供氧不足,出現(xiàn)腦損傷和神經(jīng)功能障礙。目前缺血性腦卒中已經(jīng)成為全球人口死亡和長(zhǎng)期嚴(yán)重殘疾的主要原因之一[1]?；謴?fù)缺血區(qū)域血氧供應(yīng)是缺血性腦卒中的主要治療目標(biāo)[2]。然而,當(dāng)梗死區(qū)域腦組織長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧后恢復(fù)血氧供應(yīng)時(shí),會(huì)釋放過(guò)量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、激活炎癥反應(yīng)等損傷機(jī)制,破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)功能障礙,這種現(xiàn)象被稱為腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)[3]。CIRI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程,涉及多種損傷機(jī)制,包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡等[4-5]。

紫草科多年生草本植物牛舌草(AnchusaitalicaRetz.或OrageofficinalesL.),分布于我國(guó)大西南以及河北、陜西、甘肅、臺(tái)灣等地,是維吾爾族治療心腦血管疾病的經(jīng)典藥材之一,常用于異常黑膽質(zhì)成熟劑、異常黑膽質(zhì)清除劑和艾菲提蒙湯,具有生濕補(bǔ)腦、祛寒補(bǔ)心、爽心悅智、潤(rùn)燥消炎、止咳平喘等功效[6]。研究表明,牛舌草可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路和核因子-κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)信號(hào)通路,激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(recombinant heme oxygenase 1,HO-1)信號(hào)通路,減少白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)等炎癥因子的表達(dá)[6]。并且牛舌草總黃酮可以調(diào)節(jié)心肌缺血-再灌注損傷中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),有效抑制心肌細(xì)胞凋亡[7]。目前尚缺乏牛舌草治療CIRI損傷相關(guān)研究。因此,筆者在本實(shí)驗(yàn)首先采用線栓法制備CIRI大鼠模型,確證牛舌草的治療效果,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、分子生物學(xué),探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只,雄性,7～8周齡,體質(zhì)量240～260 g,SPF級(jí),購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)2019-0023,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):110322231101042886。分籠飼養(yǎng),保持相對(duì)濕度40%～50%,室溫20～25 ℃,自由進(jìn)食、進(jìn)水,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)號(hào):00005264。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 牛舌草(購(gòu)自新疆藥都藥業(yè)有限公司,經(jīng)新疆藥都藥業(yè)有限公司鑒定為正品,批號(hào):20190110)、異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司,批號(hào):20221004)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride,TTC,美國(guó)sigma公司,批號(hào):BCBP3272V)、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):2305001)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1牛舌草醇提取物制備 牛舌草粉碎至粉末后,稱取20 g,加60%乙醇20 mL浸泡6 h,再加75%乙醇120 mL,回流提取2 h,提取2次,合并提取液。提取液50℃減壓旋蒸回收乙醇,得濃縮液。過(guò)濾,用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化,收集洗脫液,50 ℃減壓去除乙醇后,真空冷凍干燥,得固體粉末,每克固體粉末含原藥材 20 g。

1.3.2動(dòng)物造模與分組 CIRI模型制備:異氟烷吸入麻醉,仰臥位固定大鼠,沿頸正中線開(kāi)口2～3 cm,鈍性分離右側(cè)組織和肌肉,直至右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)暴露,在CCA近心端、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)遠(yuǎn)心端、近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)近心端備線,插入線栓前,阻斷CCA、ECA和ICA,在ECA中部略開(kāi)小口,將線栓由ECA插入后導(dǎo)入ICA,同時(shí)松開(kāi)ICA近心端的止血夾,繼續(xù)將線栓插入至其顱內(nèi)段,自CCA分叉處插入的線栓長(zhǎng)約20 mm,阻斷大腦中動(dòng)脈,1.5 h后取出線栓,結(jié)扎ECA近心端,松開(kāi)CCA,實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組的大鼠手術(shù)是僅在暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈,頸內(nèi)動(dòng)脈,阻斷血液,剪斷頸外動(dòng)脈,并結(jié)扎血管,即可完成。造模成功的SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組及牛舌草給藥10、30、100 mg·kg-1組,給藥劑量按牛舌草醇提取物固體粉末計(jì)算。牛舌草給藥組在再灌注后立刻尾緣靜脈給藥,假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予相應(yīng)體積的0.9% 氯化鈉溶液。

1.3.3神經(jīng)功能評(píng)分 再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,采用mNSS評(píng)分、Longa測(cè)試和抓取力測(cè)試,從運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能和平衡功能3個(gè)方面評(píng)價(jià)大鼠損傷程度,其中mNSS評(píng)分和Longa測(cè)試的評(píng)分越高,抓取力測(cè)試評(píng)分越低,則表示大鼠損傷越嚴(yán)重。mNSS評(píng)分在10～15分則認(rèn)為CIRI模型制備成功,并納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4TTC染色 再灌注后24 h快速分離大腦并速凍,將冷凍的大腦切割成厚度約2 mm的冠狀切片,放置于TTC染色液中,37 ℃避光孵育,4%多聚甲醛固定,然后拍照記錄。使用ImageJ(national institutes of health,bethesda,MD,USA)計(jì)算梗死體積。梗死體積百分比=[總梗死體積-(同側(cè)半球體積-對(duì)側(cè)半球體積)]/對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.3.5牛舌草化學(xué)成分、靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)獲得 在中國(guó)知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.sinomed.ac.cn/)和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索,查詢牛舌草已知且結(jié)構(gòu)明確的化合物成分,通過(guò)PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得相應(yīng)2D SDF結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)[8-18]。將化合物2D SDF數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)(Fit值>2)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)[http://www.swisstargetprediction.ch/,靶點(diǎn)選擇概率(probability)>0]、Similarity Ensemble Approach(SEA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://sea.bkslab.org/)(P-Value<0.5),且通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)去除重復(fù)靶點(diǎn),校正靶點(diǎn)名稱,得到牛舌草化合物作用靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)(sore>7)檢索CIRI相關(guān)靶點(diǎn),將上述疾病靶點(diǎn)與牛舌草化合物作用靶點(diǎn)通過(guò)Venny 2.0取交集,獲得牛舌草治療CIRI潛在靶點(diǎn)[19-24]。

1.3.6蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將牛舌草治療CIRI潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)[25],獲得蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),之后應(yīng)用Cytoscape 3.9.1軟件,建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。采用CytoHubba分析牛舌草治療CIRI關(guān)鍵靶點(diǎn),并進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｍ瑫r(shí)應(yīng)用MODE構(gòu)建功能模塊,進(jìn)行Glue Go功能分析。

1.3.7京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路和基因本體(gene ontology,GO)生物過(guò)程分析 將牛舌草治療CIRI潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)[26],進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析和GO生物過(guò)程富集分析,分析牛舌草治療CIRI作用通路和生物過(guò)程。

1.3.8分子對(duì)接實(shí)驗(yàn) 使用RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)在線平臺(tái)檢索CytoHubba牛舌草治療CIRI關(guān)鍵靶點(diǎn),獲得其3D蛋白結(jié)構(gòu)[27]。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載牛舌草活性化合物3D結(jié)構(gòu)。將靶點(diǎn)與化合物3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio 2019 Client進(jìn)行分子對(duì)接,利用結(jié)合分?jǐn)?shù)(LibDock Score)來(lái)評(píng)估牛舌草中活性化合物與其治療CIRI關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1牛舌草對(duì)CIRI腦梗死體積和神經(jīng)功能的影響 TTC染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的腦損傷,腦梗死體積顯著增加(P<0.01)。牛舌草給藥30、100 mg·kg-1能夠有效抑制缺血-再灌注引起的腦損傷,顯著減少腦梗死體積(P<0.05),如圖1A所示。

A.牛舌草對(duì)CIRI腦梗死體積的影響;B.牛舌草對(duì)CIRI神經(jīng)功能障礙的影響。①與假手術(shù)組比較,t=13.17～29.48,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,t=1.889～12.33,P<0.05(神經(jīng)功能評(píng)分實(shí)驗(yàn)n=6,TTC染色實(shí)驗(yàn)n=3)。

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示,與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組大鼠的神經(jīng)行為和運(yùn)動(dòng)功能損傷嚴(yán)重,mNSS評(píng)分和Longa評(píng)分顯著升高(P<0.05),抓取力測(cè)試評(píng)分顯著降低(P<0.05)。與模型組對(duì)照比較,牛舌草各劑量組大鼠mNSS評(píng)分均顯著下降(P<0.05),抓取力測(cè)試評(píng)分顯著上升(P<0.05),100 mg·kg-1牛舌草給藥組Longa評(píng)分顯著下降(P<0.05),如圖1B所示。

2.2牛舌草潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,共獲得牛舌草化學(xué)成分69個(gè),見(jiàn)表1。在化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索藥物作用靶點(diǎn),且與CIRI疾病靶點(diǎn)取交集,獲得共有靶點(diǎn)143個(gè),作為牛舌草治療CIRI潛在靶點(diǎn)。將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),并用Cytoscape 3.9.1版軟件建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果如圖2所示。MCC算法分析網(wǎng)絡(luò)圖,獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為蛋白激酶B(protein kinase b,PKB/AKT1)、促分裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase 3,MAPK3)、白細(xì)胞介素家族、TNF、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、轉(zhuǎn)錄因子Jun(transcription factor jun,JUN)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor a,VEGFA)、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix Metalloproteinase-9,MMP9)等,見(jiàn)表2。

表1 牛舌草中活性成分

續(xù)表1 牛舌草中活性成分

表2 拓?fù)鋵W(xué)篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖2 牛舌草潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3牛舌草治療CIRI靶蛋白模塊分析 應(yīng)用MCODE算法分析牛舌草潛在治療CIRI靶點(diǎn),識(shí)別疾病靶蛋白相互作用的功能模塊,如圖3所示。關(guān)鍵功能模塊A主要涉及TNF信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17(interleukin 17,IL-17)信號(hào)通路等,如圖4所示。關(guān)鍵功能模塊B主要涉及磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt,PI3K-AKT)信號(hào)通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等,見(jiàn)表3。關(guān)鍵功能模塊C主要涉及T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、C型凝集素受體信號(hào)通路等,見(jiàn)表3。

表3 功能模塊KEGG和GO富集分析

A.關(guān)鍵功能模塊A;B.關(guān)鍵功能模塊B;C.關(guān)鍵功能模塊C。

圖4 功能模塊A KEGG和GO富集分析

2.4KEGG信號(hào)通路和富集分析 將牛舌草治療CIRI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行作用通路和生物過(guò)程分析。GO生物過(guò)程富集分析顯示,生物學(xué)過(guò)程主要包括肽基絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)、趨化因子產(chǎn)生調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、一氧化氮生物合成調(diào)控、PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)等,細(xì)胞組分主要包括過(guò)氧物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、溶酶體、神經(jīng)元胞體等,以及分子功能主要包括NADP結(jié)合、一氧化氮合酶活性、趨化活性、蛋白酶結(jié)合等,如圖5A所示。KEGG信號(hào)通路分析顯示,牛舌草治療腦缺血-再灌注損傷作用通路主要涉及HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等,如圖5B所示。

A.GO生物過(guò)程分析;B.KEGG富集分析。

2.5牛舌草成分對(duì)疾病靶點(diǎn)的結(jié)合能力 牛舌草潛在治療CIRI靶點(diǎn)與相關(guān)化合物通過(guò)Discovery Studio 2019 Client進(jìn)行分子對(duì)接,其中Rutin與MMP9、Narcissin與RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、VEGF、IL-6、IL-1β等蛋白的結(jié)合能力高于內(nèi)在配體,如表4、圖6所示。

表4 分子對(duì)接結(jié)果

A.Rutin與MMP9;B.Narcissin與AKT1;C.Ternatumoside II與MAPK3;D.Narcissin與VEGF。

3 討論

近年來(lái),研究者對(duì)治療CIRI做出了許多探索,發(fā)現(xiàn)各種不同治療機(jī)制的藥物,以期滿足臨床治療的需求,但是CIRI涉及多種病理機(jī)制,包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞和線粒體功能障礙等,現(xiàn)有藥物難以達(dá)到臨床治療目標(biāo)[28-30]。民族醫(yī)藥作為中醫(yī)藥重要組成部分,經(jīng)過(guò)各民族不斷發(fā)展和應(yīng)用,自身的價(jià)值在不斷被挖掘。牛舌草作為維吾爾族民族醫(yī)藥之一,長(zhǎng)期應(yīng)用于心腦血管疾病治療,但其藥效成分和具體治療機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確證牛舌草對(duì)CIRI的治療作用,并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討牛舌草藥效成分與作用機(jī)制。

采用線栓法制備CIRI大鼠模型,缺血1.5 h再灌注24 h。CIRI模型對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)失調(diào)且腦組織出現(xiàn)顯著梗死。牛舌草給藥治療能夠顯著改善腦缺血-再灌注引起的神經(jīng)行為和運(yùn)動(dòng)功能障礙,減小腦梗死體積。

依據(jù)本研究的成分檢索策略和靶點(diǎn)篩選方法,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析牛舌草活性成分靶點(diǎn)與CIRI靶點(diǎn)之間的關(guān)系,共獲得共有靶點(diǎn)143個(gè),作為牛舌草治療CIRI的潛在靶點(diǎn),如AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9等,主要涉及炎癥因子、絲裂原活化蛋白激酶家族、基質(zhì)金屬蛋白酶家族、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族、氧化還原酶家族等。KEGG分析顯示,牛舌草治療腦缺血-再灌注損傷作用通路主要包括TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等。

MMP9是一類Zn+依賴性蛋白水解酶,屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族,由IV型膠原酶、層粘連蛋白和纖維連接蛋白組成[31]。在CIRI發(fā)生和發(fā)展中,腦組織損傷會(huì)釋放促炎癥因子,誘導(dǎo)MMP9表達(dá)增加,通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞腦微血管和血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整性,導(dǎo)致繼發(fā)性腦水腫和腦損傷[31-32]。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族,是PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的樞紐[33]。CIRI會(huì)抑制PI3K激活,減少Akt磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子、細(xì)胞色素C、NF-κB等釋放和激活,導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[34-36]。MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族,可以將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核,廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)傳遞過(guò)程[37]。在CIRI發(fā)展過(guò)程中MAPK3被激活,促進(jìn)MAPK3磷酸化并激活MAPK2,誘導(dǎo)MAPK蘇氨酸/酪氨酸殘基磷酸化,與c-jun和c-Fos等轉(zhuǎn)錄因子相互作用,參與腦缺血-再灌注損傷的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[38-39]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,牛舌草中活性成分與其治療CIRI的潛在靶點(diǎn)MMP9、AKT1、MAPK3、VEGF等結(jié)合能力高于內(nèi)在配體。由此可見(jiàn),牛舌草可能通過(guò)調(diào)節(jié)上述靶點(diǎn),發(fā)揮治療CIRI的作用。

綜上所述,本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)MCIRI,確證了牛舌草對(duì)大鼠CIRI的治療作用,且采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、KEGG信號(hào)通路和富集分析等探索牛舌草分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。研究表明,牛舌草可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP9、AKT1、MAPK3等多個(gè)疾病靶點(diǎn),影響HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等,調(diào)控炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,減輕CIRI。該研究結(jié)果為后續(xù)牛舌草研究及臨床推廣提供了參考依據(jù),但是對(duì)牛舌草化學(xué)成分研究有限,網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果多,具有一定的局限性和不足。