王淑惠,李小兵,沈婷,雷攀,劉澤干,4,杜士明,,4,5

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,十堰442000;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065;4.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院科研處,十堰 442000;5.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·湖北醫(yī)藥學(xué)院,十堰 442000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的發(fā)生與創(chuàng)傷、感染等外因相關(guān),其中細(xì)菌感染是最常見的危險因素[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分,可與特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的Toll樣4受體結(jié)合,激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體表達(dá),產(chǎn)生炎癥反應(yīng),進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體體溫升高,并伴隨肺組織損傷[2]。因此抑制NF-κB/NLRP3信號通路有望成為治療ALI新的途徑[3]。

研究表明,中藥治療肺部疾病療效顯著[4]。十堰市太和醫(yī)院在經(jīng)典名方大承氣湯和茵陳蒿湯的基礎(chǔ)上加減,研制出中藥復(fù)方金茵清熱口服液,獲得了醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文號(鄂藥制字Z20140005)[5]。金茵清熱口服液在前期階段已進(jìn)行了毒性、穩(wěn)定性、藥效學(xué)方面的研究,經(jīng)臨床觀察、驗(yàn)證確定該藥物用于治療內(nèi)毒素血癥、急性肝炎、上呼吸道感染引起的高熱等炎癥性疾病療效顯著。課題組前期研究,金茵清熱口服液能顯著下調(diào)H1N1流感病毒所致炎性因子白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis α,TNF-α)的表達(dá);同時能顯著上調(diào)干擾素-α(IFN-α)的表達(dá),抑制炎癥反應(yīng),但其作用的分子機(jī)制尚待明確[6-7]。本研究探討金茵清熱口服液通過NF-κB/NLRP3信號通路發(fā)揮LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF)級C57BL/6J小鼠,雄性6～8周齡,體質(zhì)量20～25 g,購于湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:NO:42000900001043),飼養(yǎng)條件:溫度23～25℃,相對濕度45%～60%,實(shí)驗(yàn)方案通過湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理審查(批件號:2019-075)。

1.2藥物及試劑 金茵清熱口服液(每毫升含原藥材1 g,十堰市太和醫(yī)院自制,批號:NO.20201015);LPS(批號:L2630)購自美國Sigma-aldrich公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,批號:10010023)購自美國Gibco公司;紅細(xì)胞裂解液(批號:G2015-250)購自武漢塞維爾生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒(批號:P0012)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;ELISA試劑盒(TNF-α、IL-1β和IL-6,批號:ELM)購自Raybiotech公司;NF-κB抗體(批號:8242s)、p-NF-κB抗體(批號:3033S)、IκB抗體(批號:4812S)和p-IκB抗體(批號:9246s)均購自Cell signaling Technology公司;NLRP3抗體(批號:AG-20B-0014)購自Adipogen Life Sciences公司。

1.3儀器 病理切片機(jī)(武漢塞維爾生物科技有限公司,型號:RMR2016);倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司,型號:NIKONECLIPSETI-SR);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Thermo Fisher公司,型號:AMQAF1000);低溫超速離心機(jī)(德國Eppendorf公司,型號:H1750R,離心半徑10 cm)。

1.4動物造模及給藥 采用LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型,完全隨機(jī)法將小鼠分為6組:空白對照組、模型對照組、金茵清熱口服液小劑量組、金茵清熱口服液中劑量組、金茵清熱口服液大劑量組和地塞米松組,每組12只。首先,模型對照組、金茵清熱口服液小、中、大劑量組和地塞米松組分別采用氣管滴注LPS(5 mg·kg-1,1次),構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型,空白對照組給予氣管滴注等體積PBS;氣管滴注4 h后,金茵清熱口服液小、中、大劑量組(4、8、16 g·kg-1,qd)分別連續(xù)灌胃給藥3 d,地塞米松組(5 mg·kg-1,qd)連續(xù)腹腔注射給藥3 d,同時空白對照組和模型對照組分別連續(xù)灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液3 d,次日,6組小鼠分別取肺組織(每組6只)和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)(每組6只)進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.5蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理損傷的變化 每組收集6只小鼠左側(cè)肺組織,分別固定在10%甲醛溶液中,經(jīng)90%、80%、70%濃度乙醇脫水、石蠟包埋和切片(厚度5 μm),進(jìn)行HE染色,切片于光學(xué)顯微鏡下觀察,參照KULKARNI等[8]的方法進(jìn)行肺損傷程度定量評分。

1.6BALF總細(xì)胞數(shù)、總蛋白含量和TNF-α、IL-6、IL-1β和IgM的表達(dá) 每組取6只小鼠BALF,在4 ℃下3 000 r·min-1(r=32 mm)離心15 min,分別收集沉淀細(xì)胞和上清液,沉淀細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液6 mL反應(yīng)15 min,重復(fù)數(shù)次直至紅細(xì)胞完全除去,重懸沉淀細(xì)胞,采用細(xì)胞自動計(jì)數(shù)儀進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù);上清液分別按照BCA和ELISA試劑盒檢測各組BALF中總蛋白含量和TNF-α、IL-6、IL-1β和IgM的含量。

1.7Western blotting法檢測 小鼠肺組織p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/IκB和NLRP3/β-actin蛋白表達(dá) 每組收集3只小鼠右側(cè)肺組織,分別稱取15.00 mg,加入300 μL蛋白裂解液,充分研磨,在4 ℃下離心12 000 r·min-1(r=32 mm)15 min后,收集上清液,加入蛋白上樣緩沖液,在100 ℃變性5 min,BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品(上樣量30 μg)通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(80 V)分離2 h,半干轉(zhuǎn)(恒壓18 V,60～70 min)至PVDF膜上,5 %牛奶封閉2 h,隨后在4 ℃下NF-κB(1：1 000)、p-NF-κB(1：1 000)、IκB(1：1 000)、p-IκB(1：1 000)和NLRP3(1：1 000)過夜,TBST洗膜30 min,室溫孵育二抗1 h,TBST洗膜30 min,最后采用ECL法顯影,Image J定量分析目的蛋白條帶。

1.8免疫組化檢測小鼠肺組織NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá) 每組取6只肺組織石蠟切片,加入抗原修復(fù)、血清封閉20 min,4 ℃下孵育NF-κB(1：1 000)、NLRP3(1：2 000)抗體過夜,洗滌3次,并于37 ℃下孵育二抗1 h,DAB溶液顯色,最后蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、脫水、透明、封片,Image J分析肺組織NF-κB、NLRP3蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺組織病理學(xué)的比較 與空白對照組比較,模型對照組小鼠的肺組織表現(xiàn)出明顯的病理損傷,肺泡間隔增厚,炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01);與模型對照組比較,給予金茵清熱口服液(4、8、16 g·kg-1)治療后,肺病理學(xué)損傷逐漸減輕(P<0.01),肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù),炎性細(xì)胞浸潤情況減輕,肺組織損傷減輕,其作用效果接近地塞米松組,見圖1。

①空白對照組比較,t=27.69,P<0.01;②與模型對照組比較,t=3.571～9.522,P<0.01。

2.2各組小鼠BALF炎性滲出的比較 與空白對照組比較,模型對照組小鼠肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和IgM含量顯著升高,炎性蛋白滲出(P<0.01);與模型對照組比較,給予金茵清熱口服液(4、8、16 g·kg-1)治療后,BALF中總細(xì)胞數(shù)量、總蛋白和IgM含量逐漸減低,炎性蛋白滲出減少(P<0.01),其作用效果接近于地塞米松組,見表1。

表1 各組小鼠BALF炎性滲出的比較

2.3各組小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的比較 與空白對照組比較,模型對照組小鼠肺泡灌洗液炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高(P<0.01);與模型對照組比較,給予金茵清熱口服液(4、8、16 g·kg-1)治療后,BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量逐漸降低(P<0.05),其作用效果接近于地塞米松組,見表2。

表2 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的比較

2.4各組小鼠肺組織NF-κB/NLRP3信號通路蛋白表達(dá) 與空白對照組比較,模型對照組小鼠肺組織中p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/IκB和NLRP3/β-actin蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01);與模型對照組比較,給予金茵清熱口服液(16 g·kg-1)治療后,肺組織中p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/Iκ和NLRP3/β-actin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2。

①與空白對照組比較,t=7.339～10.75,P<0.01;②與模型對照組比較,t=3.532～6.461,P<0.05。

2.5各組小鼠肺組織NF-κB、NLRP3免疫組化結(jié)果 與空白對照組比較,模型對照組小鼠肺組織NF-κB、NLRP3蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)升高(P<0.01);與模型對照組比較,給予金茵清熱口服液(16 g·kg-1)治療后,肺組織中NLRP3蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。見圖3。

①與空白對照組比較,t=16.16～17.17,P<0.01;②與模型對照組比較,t=6.082～13.47,P<0.01。

3 討論

ALI是一種常見呼吸系統(tǒng)臨床綜合征,臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫[9]。流行病學(xué)調(diào)查,在全球范圍內(nèi),ALI在重癥監(jiān)護(hù)患者的發(fā)病率達(dá)10%,死亡率達(dá)50%[10]。藥物治療(如糖皮質(zhì)激素、沙丁胺醇)在臨床實(shí)驗(yàn)中無法得到有效支持,且存在耐藥、骨質(zhì)疏松等副作用[11]。研究表明,中藥治療肺部疾病效果顯著,且歷史悠久。ZHANG等[12]研究清瘟止咳治療LPS誘導(dǎo)ALI的作用機(jī)制可能是通過抑制TLR4/NF-kB信號通路與NLRP3炎癥小體激活。王瑞哲等[13]研究大承氣湯降低大鼠肺泡巨噬細(xì)胞、人支氣管上皮細(xì)胞中炎癥相關(guān)蛋白NF-κB的表達(dá),減輕肺部炎癥損傷,改善肺損傷。

金茵清熱口服液由金銀花、茵陳、大黃、梔子、連翹、黃芪、丹參、甘草8味中藥組成[6]。茵陳、黃芪是金茵清熱口服液的君藥,治療炎癥相關(guān)疾病如膽囊炎[14]、動脈粥樣硬化[15]等。丹酚酸B、綠原酸、黃芩苷和大黃素等是金茵清熱口服液主要藥效成分,丹酚酸B通過抑制NF-κB的激活減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI[16];綠原酸通過抑制NLRP3炎性小體的激活改善肺炎克雷伯菌所致的小鼠肺炎[17];黃芩苷、大黃素聯(lián)合治療DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎通過TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮協(xié)同作用[18]等,這提示金茵清熱口服液具有抗炎作用。本研究構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型,給予金茵清熱口服液小、中、大劑量治療后減輕了小鼠肺組織病理損傷,降低了肺泡灌洗液中炎性滲出和細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá),說明金茵清熱口服液對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI具有保護(hù)作用,可減輕小鼠ALI的炎癥反應(yīng)。

研究表明,NF-κB/NLRP3信號通路在ALI等炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。生理?xiàng)l件下,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),NF-κB的異二聚體和IκB以非活性形式相結(jié)合;當(dāng)外界刺激信號出現(xiàn)時,IκB迅速降解,使NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核,促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝,進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)[20]。YANG等[21]研究,東凌草素通過抑制NF-κB/NLRP3信號通路的激活,發(fā)揮抗炎作用,對小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。因此,通過NF-κB/NLRP3信號通路有望成為治療ALI新的途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果金茵清熱口服液能抑制肺組織p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/IκB和NLRP3/β-actin蛋白的表達(dá),說明金茵清熱口服液的肺保護(hù)作用與NF-κB/NLRP3信號通路密切相關(guān)。

綜上所述,金茵清熱口服能降低LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI中炎癥因子的水平,改善肺部病理損傷和炎性滲出,其作用機(jī)制可能通過調(diào)控NF-κB/NLRP3信號通路,但是本實(shí)驗(yàn)未探究金茵清熱口服液有效成分的協(xié)同作用,后期將進(jìn)行深入研究,為其臨床用于治療ALI提供理論依據(jù)。