馬廣平,渠弼,布仁,蓮花,白文明

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院;2.蒙醫(yī)藥學(xué)院,呼和浩特 010110)

蒙藥復(fù)方“珍寶丸”(又名額爾敦烏日勒丸、桑丕勒諾爾布、如意珍寶丸)是經(jīng)典的蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑,最早記載于13世紀(jì)的《滿阿格·穆迪格坡仍瓦》,其后在《蒙醫(yī)甘露四部》《蒙醫(yī)金匾》《觀者之喜》《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊)等蒙醫(yī)藥典籍和藥品標(biāo)準(zhǔn)中均有收載[1]。經(jīng)長期蒙醫(yī)臨床驗(yàn)證,珍寶丸具有活血化瘀、清熱安神、舒筋活絡(luò)、除“協(xié)日烏素”等功效,結(jié)合蒙醫(yī)“異病同治”理論和法則,廣泛用于治療炎癥和自由基誘導(dǎo)的“薩病”“協(xié)日烏素”等頑固性疾病,特別是在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面療效顯著[2]。蒙醫(yī)理論認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于“協(xié)日烏素”“黃水病”,是由人體三根七素失去相對平衡,巴達(dá)干赫依(似氣)偏盛,赫依與奇蘇(血)相搏,巴達(dá)干黏液(痰濁)滯留在骨關(guān)節(jié)產(chǎn)生損傷,氣血運(yùn)行受阻,導(dǎo)致六條顯性(外)白脈(四肢)受損,擴(kuò)散于機(jī)體表里所致[3]。珍寶丸含有珍珠、牛黃、檀香、紅花、水牛角、地錦草等29味純天然藥材,按照蒙醫(yī)“君、臣、佐、使”原則配制成深紅色芳香水丸劑,方劑以具有鎮(zhèn)靜作用的珍珠為主,配以牛黃清熱安神,麝香清毒熱、開竅,紅花治臟腑病及調(diào)理體質(zhì),丁香以理命脈赫依為輔,再加檀香以清心肺騷熱,另加地錦草、蓽茇、苘麻子、白苣勝等為之佐使,諸藥組方嚴(yán)謹(jǐn),攻補(bǔ)兼施、寒熱并用,共達(dá)清熱、安神、舒筋活絡(luò)之功效[4]。

珍寶丸處方組成多、化學(xué)成分復(fù)雜、起效機(jī)制不清,嚴(yán)重缺乏藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。故本研究以珍寶丸中揮發(fā)油成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為出發(fā)點(diǎn),首先,采用高通量分析技術(shù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographymass spectrometer,GC-MS)結(jié)合相應(yīng)數(shù)據(jù)庫分析鑒定了珍寶丸的揮發(fā)油成分和相對含量。其次,以主要的揮發(fā)油成分為基礎(chǔ),利用生物信息分析技術(shù)對珍寶丸揮發(fā)油治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路進(jìn)行預(yù)測。最后,采用體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)測定珍寶丸揮發(fā)油的抗氧化活性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent GC-MS:Agilent 7890A氣相色譜儀,Agilent 5975C質(zhì)譜儀組成,載氣為高純度氦氣。P9型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司),AL104電子天平(梅特勒托利多集團(tuán),感量:0.1 mg),HYCD-282C實(shí)驗(yàn)室冷藏冷凍箱(海爾集團(tuán)),1 mL移液槍(艾本德股份公司),電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),揮發(fā)油提取器(北京博美玻璃有限公司)。

1.2試劑與藥品 珍寶丸處方中29味藥材均購自內(nèi)蒙古藥材市場,由呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供,經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定,均符合2020年版《中華人民共和國藥典》中藥飲片的規(guī)定,均為正品,各藥材產(chǎn)地及批號信息見表1。該藥品于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實(shí)驗(yàn)室參照處方,見表2自制而得,使用前置于室溫陰涼處保存。純化水(實(shí)驗(yàn)室自制),乙醚(分析純,天津市風(fēng)傳化學(xué)試劑科技有限公司,批號:20190906),甲醇(分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠,批號:20230326)。

表1 藥材產(chǎn)地及批號

表2 珍寶丸處方組成

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1珍寶丸揮發(fā)油提取工藝篩選 采用單因素考察法,分別對提取液體積、提取液浸泡時(shí)間、回流提取時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化篩選,最終以揮發(fā)油產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn),確定最佳揮發(fā)油提取工藝。

具體提取工藝流程如下:稱取經(jīng)粉碎、過篩后的珍寶丸粉末200 g,置于3 000 mL圓底燒瓶中,加入指定體積純化水作為提取液,室溫浸泡指定時(shí)長后,加熱回流提取指定時(shí)間,提取結(jié)束后冷卻至室溫,打開出口活塞放水,由揮發(fā)油提取器底端刻度直接讀出揮發(fā)油體積,作為揮發(fā)油提取工藝篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2珍寶丸揮發(fā)油成分的GC-MS分析

(1)供試品溶液制備 粉碎,過篩孔內(nèi)徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,置于圓底燒瓶中,加入10倍體積的純化水室溫浸泡2 h,水蒸氣蒸餾4 h,收集揮發(fā)油于鋁箔紙覆蓋的微量離心管中,-20 ℃儲存,以供進(jìn)一步的GC-MS分析。

(2)測定條件 GC-MS條件:HP-5MS毛細(xì)管柱(0.25 μm×30 m,0.25 μm),高純度氦氣為載氣,流速為0.5 mL·min-1;分流比1：50;進(jìn)樣量0.5 μL;進(jìn)樣溫度240 ℃;程序升溫:初始溫度50 ℃,持續(xù)2 min,50→100 ℃(3 ℃·min-1),100→200 ℃(2 ℃·min-1),200→260 ℃(8 ℃·min-1),保持2 min;電離源為電子轟擊源(electron impact ion source,EI),電離電壓69.9 eV,離子源溫度250 ℃,四極桿溫度150 ℃;質(zhì)譜掃描范圍為35～625m/z,溶劑延遲2 min;全掃描模式。

(3)數(shù)據(jù)解析 按上述測定條件測得揮發(fā)油成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過檢索美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(national institute of standards and technology,NIST)質(zhì)譜庫,對揮發(fā)油成分進(jìn)行定性鑒定,并計(jì)算各成分的相對峰面積百分比,作為各成分的相對百分含量。

2.1.3生物信息學(xué)分析

(1)珍寶丸揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的獲取 根據(jù)GC-MS鑒定結(jié)果,以相對含量前48的成分(97.66%)為基礎(chǔ),利用pubchem數(shù)據(jù)庫獲得各成分的2D結(jié)構(gòu),并將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,整合去重后,獲取成分靶點(diǎn)。以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK數(shù)據(jù)庫中收集與RA相關(guān)疾病靶點(diǎn)信息,整合去重后,獲取RA疾病靶點(diǎn)。通過Venny軟件獲取珍寶丸治療RA的潛在作用靶點(diǎn)。

(2)蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,獲取PPI網(wǎng)絡(luò),之后利用Cytoscape3.9.1版軟件中CytoNCA 插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(coseness centrality,CC),篩選出各參數(shù)值大于中位值的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

(3)GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析,預(yù)測珍寶丸治療RA的生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和相關(guān)信號通路的關(guān)系,并借助微生信在線平臺對結(jié)果進(jìn)行可視化輸出。

(4)“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape軟件構(gòu)建珍寶丸揮發(fā)油“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,并采用Network Analysis插件分析Degree值,根據(jù)Degree值的大小篩選主要活性成分。

(5)分子對接驗(yàn)證 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前5的核心靶點(diǎn)和“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值前7的主要活性成分進(jìn)行分子對接。在Chem 3D軟件中將要對接的成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化并下載其3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB)數(shù)據(jù)庫中下載大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutoDock和PyMOL軟件進(jìn)行分子對接和結(jié)果可視化。

2.1.41,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine,DPPH)活性試驗(yàn) 在濃度為1 mg·mL-1的甲醇中制備珍寶丸揮發(fā)油和維生素E儲備液。將這些儲備液用甲醇稀釋,制備13份工作溶液,濃度分別為0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、40、50、80、100、200 μg·mL-1。將新鮮制備的DPPH溶液(0.002%,W/V)與甲醇和上述各工作溶液以1：1：1的比例混合。此外,將上述DPPH溶液與甲醇以1：1的比例混合,制備陰性對照溶液。然后,將所有溶液在室溫下的暗處放置40 min。使用甲醇作為空白溶液,使用分光光度計(jì)在517 nm處測量溶液的吸光度。珍寶丸揮發(fā)油和維生素E的抗氧化活性用以下公式計(jì)算:抑制DPPH活性的百分比(%)=(A-B)/A × 100%。A=空白的吸光度,B=樣品的吸光度。使用Graphpad prism 8.3.0版軟件計(jì)算珍寶丸揮發(fā)油和維生素E溶液的抗氧化半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。所有樣品均重復(fù)測定3次。

2.2結(jié)果

2.2.1不同提取條件對揮發(fā)油產(chǎn)量的影響

(1)不同蒸餾時(shí)間對揮發(fā)油產(chǎn)量的影響 粉碎,過篩孔內(nèi)徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,浸泡2 h,分別測得不同水蒸氣蒸餾時(shí)間(h)對應(yīng)的揮發(fā)油產(chǎn)量(mL)。揮發(fā)油的產(chǎn)量隨水蒸氣蒸餾時(shí)間的變化關(guān)系見圖1A。結(jié)果表明,水蒸氣蒸餾時(shí)間超過4 h時(shí),揮發(fā)油的產(chǎn)量不再隨著蒸餾時(shí)間的延長而增加,故確定水蒸氣蒸餾時(shí)間為4 h。

A.不同蒸餾時(shí)間與揮發(fā)油產(chǎn)量相關(guān)關(guān)系;B.不同浸泡時(shí)間與揮發(fā)油產(chǎn)量相關(guān)關(guān)系;C.不同料液比與揮發(fā)油產(chǎn)量相關(guān)關(guān)系;D.40目藥粉顆粒的不同蒸餾時(shí)間與揮發(fā)油產(chǎn)量的相關(guān)關(guān)系。

(2)不同浸泡時(shí)間對揮發(fā)油產(chǎn)量的影響 粉碎,過篩孔內(nèi)徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,水蒸氣蒸餾10 h,分別測得不同浸泡時(shí)間(h)對應(yīng)的揮發(fā)油產(chǎn)量(mL)。揮發(fā)油的產(chǎn)量隨水浸泡時(shí)間的變化關(guān)系見圖1B。結(jié)果表明,浸泡時(shí)間為2 h時(shí),揮發(fā)油的產(chǎn)量最大,故確定浸泡時(shí)間為2 h。

(3)不同提取液體積對揮發(fā)油產(chǎn)量的影響 粉碎,過60目篩,稱取珍寶丸粉末200 g,純化水浸泡2 h,水蒸氣蒸餾10 h,分別測得不同倍率提取液對應(yīng)的揮發(fā)油產(chǎn)量(mL)。揮發(fā)油的產(chǎn)量隨提取液倍率的變化關(guān)系見圖1C。結(jié)果表明,提取液倍率為10倍時(shí)揮發(fā)油的產(chǎn)量最大,故確定提取液倍率為10倍。

(4)不同藥粉粒徑對揮發(fā)油產(chǎn)量的影響 粉碎,過40目篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,浸泡2 h,分別測得不同水蒸氣蒸餾時(shí)間(h)對應(yīng)的揮發(fā)油產(chǎn)量(mL)。揮發(fā)油的產(chǎn)量隨水蒸氣蒸餾時(shí)間的變化關(guān)系見圖1D。結(jié)果表明,相較于粉末顆粒為40目而言,粉末顆粒為60目的樣品(圖1A)可在更短的時(shí)間內(nèi)(4 h)達(dá)到揮發(fā)油產(chǎn)量最大,故選擇藥粉經(jīng)60目過篩。

2.2.2GC-MS分析 采用GC-MS技術(shù)分析鑒定珍寶丸的揮發(fā)油成分,共鑒定出化合物115個(gè),其中相對百分含量排名前48的化學(xué)成分,即反式-異丁香酚(35.5%)、茴香腦(13.6%)、桉樹腦(10.9%)等,占總揮發(fā)油含量的97.66%,具體信息和對應(yīng)化學(xué)文摘社(Chemical Abstracts Service,CAS),見表3。

表3 珍寶丸揮發(fā)油的主要化學(xué)成分

2.2.3生物信息學(xué)分析

(1)珍寶丸揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的篩選 通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫共篩選到珍寶丸中48個(gè)主要成分的作用靶點(diǎn)425個(gè)。在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK數(shù)據(jù)庫共篩選到疾病靶點(diǎn)1 317個(gè)RA。通過Venn圖獲得珍寶丸治療RA的潛在作用靶點(diǎn)147個(gè),見圖2。

圖2 珍寶丸揮發(fā)油成分-RA靶點(diǎn)韋恩圖

(2)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,并通過Cytoscape 軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。利用CytoNCA插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的degree、 BC和 CC,以degree≥11,BC≥53.54和CC≥0.35為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出核心靶點(diǎn)24個(gè),選取度值較高的前5個(gè)靶蛋白作為關(guān)鍵核心靶點(diǎn),即STAT3(信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)、HSP90AA1(熱休克蛋白90α家族A類成員1)、SRC(細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白)、Akt1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、ESR1(雌激素受體1)。見表4。

點(diǎn)的大小和顏色深淺表示節(jié)點(diǎn)連接度大小,一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接越多,節(jié)點(diǎn)越大顏色越深。

表4 珍寶丸揮發(fā)油成分治療RA關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)

(3)GO和KEGG通路富集分析 以P<0.05為閾值,在David數(shù)據(jù)庫中共富集到GO條目683個(gè),包括BP488條,MF69條和CC126條。將P值按從小到大進(jìn)行排序,選取BP、MF和CC排名前10的條目繪制條形圖,見圖4。同樣,以P<0.05為閾值,進(jìn)行KEGG通路富集分析,得到相關(guān)通路140條,選取最具顯著性的前20條通路繪制氣泡圖,見圖5。

圖4 珍寶丸揮發(fā)油成分-RA交集靶點(diǎn)GO分析

圖5 珍寶丸揮發(fā)油成分-RA交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

GO富集分析篩選后發(fā)現(xiàn),主要涉及的BP包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和蛋白質(zhì)磷酸化等。MF主要涉及與相同蛋白質(zhì)結(jié)合、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)結(jié)合及酶結(jié)合等。CC主要涉及胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)等。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示,珍寶丸治療RA的靶點(diǎn)主要富集在癌癥、感染、炎癥及免疫等相關(guān)通路上,包括癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、RAS信號通路等。因此,通過以上結(jié)果表明蒙藥珍寶丸通過多種作用多條通路發(fā)揮治療RA的作用。

(4)“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建珍寶丸“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6。圖中含節(jié)點(diǎn)169個(gè)及邊314條。紅色箭頭代表疾病,綠色菱形代表靶點(diǎn),黃色六邊形代表藥物,橙色圓形代表成分,其中圓的形狀越大、顏色越深表示該成分越重要。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示,珍寶丸化學(xué)成分的平均degree為8.35,>8.35的成分共7個(gè),即97-54-1、104-46-1、607-91-0、87-44-5、470-82-6、20126-76-5、301-00-8。則這7個(gè)成分可能是發(fā)揮抗RA作用的主要活性成分,見表5。

圖6 珍寶丸“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表5 珍寶丸揮發(fā)油核心活性成分基本信息

(5)分子對接 將5個(gè)核心靶點(diǎn)(STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1、ESR1)分別與7個(gè)潛在活性成分[trans-isoeugenol,anethole,myristicin,caryophyllene,eucalyptol,(-)-terpinen-4-ol,methyl linolenate]進(jìn)行分子對接,結(jié)果見表6。結(jié)果顯示,所有組合的結(jié)合能均小于-17.70 kJ·moL-1,表明活性成分與靶點(diǎn)均能自發(fā)結(jié)合并發(fā)生相互作用。分子對接部分可視化結(jié)果見圖7。

圖7 活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接模式圖

表6 珍寶丸揮發(fā)油治療RA關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

2.2.4抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 以維生素E為參比,采用DPPH法測定珍寶丸揮發(fā)油成分的自由基清除活性,見表7。結(jié)果表明,揮發(fā)油和維生素E的濃度范圍為0.1～200 μg·mL-1,珍寶丸具有良好的抗氧化活性,其IC50為14.16 μg·mL-1,而維生素E的IC50為6.65 μg·mL-1,故珍寶丸揮發(fā)油成分是維生素E的46.96%。

表7 珍寶丸揮發(fā)油成分和維生素E抑制DPPH活性的百分比

3 討論

RA作為一種以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,故現(xiàn)有藥物無法達(dá)到臨床治療的目標(biāo)[5]。珍寶丸是蒙醫(yī)臨床除“協(xié)日烏素”的常用蒙成藥,但其藥效成分和具體治療機(jī)制尚不清楚。故本研究借助GC-MS技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)及抗氧化實(shí)驗(yàn),探討珍寶丸揮發(fā)油防治RA的潛在作用機(jī)制及體外抗氧化活性。

GC-MS分析結(jié)果顯示,珍寶丸中共鑒定出揮發(fā)油成分115個(gè),其中相對百分含量前48的成分占總揮發(fā)油含量的97.66%。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),珍寶丸抗RA的主要活性成分包括trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin,Caryophyllene,Eucalyptol,(-)-Terpinen-4-ol,Methyl linolenate。據(jù)報(bào)道[6-13],以上7個(gè)化合物均具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等作用,并可預(yù)防自由基誘導(dǎo)的慢性疾病,如癌癥、炎癥、自身免疫性疾病和其他年齡相關(guān)疾病。此外,有研究發(fā)現(xiàn)[14],trans-Isoeugenol能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥遞質(zhì)釋放,并且可能通過調(diào)控NF-κB、p65等相關(guān)通路抑制促炎因子及其轉(zhuǎn)錄,從而緩解炎癥癥狀。MORADI等[15]發(fā)現(xiàn),Anethole作為一種藥用植物化合物,其抗炎作用主要通過減少促炎因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)。Myristicin可以通過鈣離子通道抑制的NO、IL-6、IL-10和LIF等相關(guān)的因子,緩解炎癥反應(yīng)[16]。

PPI和KEGG結(jié)果顯示,珍寶丸揮發(fā)油成分治療RA主要作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶點(diǎn),通過PI3K-Akt、MAPK和RAS等信號通路發(fā)揮作用。STAT3作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族成員之一,其激活可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫反應(yīng)增加,通過抑制STAT3的表達(dá)可以限制免疫炎癥反應(yīng),從而緩解RA癥狀[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18],作為最重要的熱休克蛋白之一,發(fā)熱會上調(diào)T細(xì)胞中HSP90(包括HSP90AA1和HSP90AB1)的表達(dá),故減輕滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨破壞可通過降低HSP90AA1表達(dá)水平。SRC作為一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶,參與能量代謝、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié),有研究發(fā)現(xiàn)[19],SRC的高表達(dá)也與RA疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Akt1作為Akt激酶的成員之一,是P13K/Akt通路的重要組成部分,在受到體內(nèi)細(xì)胞因子和內(nèi)部環(huán)境中各種物理和化學(xué)因素刺激后Akt蛋白被位于Akt上游的PI3K磷酸化激活,磷酸化的Akt蛋白參與NF-κB、mTOR和JNK等炎癥信號通路的激活[20],從而抑制RA炎性反應(yīng)。 PI3K/Akt信號通路可參與多種細(xì)胞的增殖和凋亡,在RA炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。

分子對接結(jié)果顯示,珍寶丸7個(gè)主要活性成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)均能穩(wěn)定地結(jié)合,并顯示出較好的結(jié)合活性(結(jié)合能<-17.70 kJ·mL-1)。

綜上所述,珍寶丸揮發(fā)油成分治療RA具有多靶點(diǎn)、多成分、多通路的特點(diǎn),其可能通過trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin等主要活性成分作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶點(diǎn),參與PI3K-Akt、MAPK等信號通路調(diào)節(jié)免疫,減輕炎癥反應(yīng),緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛。此外,基于DPPH法的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,珍寶丸揮發(fā)油成分呈現(xiàn)出顯著的抗氧化活性,能有效地去除自由基,對炎癥和自由基誘導(dǎo)的RA產(chǎn)生療效。