曹健,董欽鵬,曾煉,李恒平,劉君瑞,孫曉東,王青松,胡鵬超

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地,襄陽 441000;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉科,武漢 430030;3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院普通外科,襄陽 441000;4.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,襄陽 441000)

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,5年生存率約為10%。胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌中最常見和最具侵襲性的亞型,約占胰腺癌總數(shù)的90%,其預(yù)后不良可能與早期轉(zhuǎn)移和高侵襲性有關(guān)[1-3]。臨床上,以化學(xué)治療(化療)為主的綜合治療是治療胰腺導(dǎo)管腺癌的主要方法。吉西他濱是一種胞嘧啶核苷衍生物,是治療胰腺導(dǎo)管腺癌的一線化療藥物,可作為競爭性底物摻入DNA鏈并終止其復(fù)制,最終導(dǎo)致細胞死亡,但很多患者在治療過程中出現(xiàn)化療敏感性下降,需提高其藥物濃度才能產(chǎn)生效應(yīng),導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限[4-6]。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)一種更有效的化療組合,為化療增敏和改善胰腺導(dǎo)管腺癌總體預(yù)后提供新的策略。

褪黑素是一種吲哚類化合物,主要由松果體在夜間正常的明暗條件下合成和分泌。它是一種多效性分子,具有多種生理功能,包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抑制腫瘤等[7-9]。越來越多的證據(jù)表明褪黑素可以抑制多種癌癥的進展并增強其化療敏感性,也包括胰腺癌。JU等[10]的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過抑制NF-κB的激活增加胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。除此,褪黑素也可通過調(diào)節(jié)細胞自噬進而抑制腫瘤的增殖及侵襲。GILLSON等[11]的研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌的生長依賴于自噬,使用自噬抑制劑可逆轉(zhuǎn)胰腺癌的進展以及增加其化療敏感性。除自噬外,有研究發(fā)現(xiàn)靶向誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡可逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物的耐藥性[12]。而目前尚不確定褪黑素增敏胰腺癌對化療藥物敏感性與細胞自噬和鐵死亡的關(guān)系。因此,本研究旨在探討褪黑素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1化療敏感性的作用及其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1藥物與試劑 高糖細胞培養(yǎng)基H-DMEM(批號:11965092)、胰蛋白酶(批號:25200072)購自賽默飛世爾科技公司;褪黑素(批號:S1204)、吉西他濱(批號:S1714)購于Sellecks生物科技有限公司;細胞活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8,批號:BS350B)購自白鯊生物科技有限公司;活性氧檢測熒光探針-DHE分析試劑盒(批號:KGAF019)和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(批號:KGA603)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;細胞亞鐵離子檢測熒光探針(批號:F374)購自東仁化學(xué)科技有限公司(Dojindo);凝膠快速制備試劑盒(批號:WLA013)購自沈陽萬類生物科技有限公司;抗GPX4(批號:67763-1-Ig)、抗SLC7A11(批號:26864-1-AP)、抗P62(批號:18420-1-AP)、抗LC3(批號:14600-1-AP)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;DyLight 488綠色熒光II抗(批號:ab96899)購自艾博抗生物科技有限公司;蛋白濃度測定試劑盒(批號:P0012)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(批號:A0208)和山羊抗鼠 IgG(批號:A0216)、細胞核染料 Hoechst 33258 (批號:C1011)及線粒體紅色熒光探針 Mito-Tracker Red CMXRos(批號:C1035)購自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2設(shè)備與儀器 蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;SpectraMax i3x酶標儀購自美谷分子儀器有限公司;IX70倒置熒光顯微鏡購自奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號:CL-0184),后由實驗室保存。人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中,置于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞增殖達60%～80%進行細胞傳代,取處于對數(shù)增長期的細胞進行接種。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔細胞約5×103個,設(shè)立空白對照組、吉西他濱組(1、2、4、8、16 μmol·L-1)及聯(lián)合處理組(4 μmol·L-1吉西他濱+0.25、0.5、1、2 mmol·L-1褪黑素),培養(yǎng)48、72 h后,加入CCK-8溶液(每孔10 μL),37 ℃孵育箱培養(yǎng)1～4 h,熒光酶標儀(激發(fā)光波450 nm)測定每孔吸光度,每組設(shè)3個復(fù)孔,以空白孔調(diào)零,計算細胞相對活力。

1.2.3克隆形成實驗 將PANC-1細胞以每孔1×103個細胞的密度接種到6孔板中,待細胞貼壁后加藥,分別設(shè)立空白對照組、褪黑素(1 mmol·L-1)組、吉西他濱(4 μmol·L-1)組以及聯(lián)合處理組,放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)2周,直到通過肉眼能清晰可見的細胞克隆,棄培養(yǎng)基,PBS洗滌,用4%多聚甲醛固定15 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min。晾干后觀察細胞集落并攝像。

1.2.4劃痕實驗 將PANC-1細胞在6孔板中培養(yǎng),在細胞密度為90%的情況下,使用200 μL塑料槍頭沿直線在孔底劃線,PBS洗滌2次,培養(yǎng)于含有2% FBS的DMEM中,設(shè)立分組同“1.2.3節(jié)”,在0和48 h攝像,計算劃痕閉合率。

1.2.5細胞遷移實驗 加藥處理過的細胞經(jīng)胰酶消化(設(shè)立分組同“1.2.3節(jié)”),用無血清培養(yǎng)基配成細胞密度為5×104個·mL-1的細胞懸液,在transwell上室加入細胞懸液200 μL,下室加入含有10%FBS的DMEM 500 μL。培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h后,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定15 min,0.1%結(jié)晶紫染色,洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細胞,在倒置顯微鏡下觀察3個視野(×100),用ImageJ計算遷移細胞的數(shù)量,通過每組transwell的遷移細胞數(shù)比較細胞的遷移能力。

1.2.6細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測 將PANC-1細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至24孔板,隨機分組,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗,各組處理如上述,培養(yǎng)48 h后,使用ROS紅色熒光探針二氫乙啶(DHE)標記細胞中的ROS 20 min,然后用PBS洗滌2次,置于熒光顯微鏡下觀察并攝像,并用 Image J 軟件分析熒光強度。

1.2.7線粒體膜電位JC-1檢測 將PANC-1細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至24孔板,隨機分組,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗,各組處理如上述,培養(yǎng)48 h后,棄掉孔中培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,加入線粒體膜電位檢測試劑盒中的JC-1工作液覆蓋細胞,置于培養(yǎng)箱孵育15 min后,用1×緩沖液洗滌2次后,加入4%多聚甲醛室溫固定30 min,用PBS洗滌2次,加入Hoechst 33258標記細胞核,室溫染色15 min,置于熒光顯微鏡下進行觀察并攝像,并用 Image J 軟件分析熒光強度。

1.2.8亞鐵離子(Fe2+)檢測 將PANC-1細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至24孔板,隨機分組,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗,各組處理如上述,培養(yǎng)48 h后,棄掉孔中培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,每孔加入終濃度為1 μmol·L-1的亞鐵離子染色工作液200 μL,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,在熒光顯微鏡下觀察細胞并攝像,用 Image J 軟件分析熒光強度。

1.2.9蛋白印跡實驗 按上述分組處理細胞48 h后,在低溫環(huán)境下加入RIPA裂解蛋白15 min,超聲破碎細胞,細胞懸液收集至3 mL離心管中,4 ℃,12 000 r·min-1(r=6 cm)離心10 min后棄上清液。使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,每個樣本取20 μL進行SDS-PAGE,半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,緩沖鹽溶液洗膜后加入特異性I抗,I抗稀釋比例為GPX4(1：1 000)、SLC7A11(1：1 000)、LC3(1：2 000)、P62(1：1 000)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(1：2 000),4 ℃孵育過夜,緩沖鹽溶液洗膜5 min×3次,Ⅱ抗(1：2 000)室溫孵育1.5 h,緩沖鹽溶液洗膜3次后加入顯影液進行顯影,采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對灰度值進行相對定量。

1.2.10免疫熒光染色 將PANC-1細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至載玻片上,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗,各組處理如上述,48 h后棄去培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次,加入4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min,PBS洗滌后使用0.2% Triton X-100透膜10 min,加入含1%馬血清的磷酸緩沖液溶液室溫封閉2 h,使用抗LC3抗體(1：400)4 ℃孵育過夜,磷酸緩沖液洗滌3次,每次5 min,DyLight 488綠色熒光Ⅱ抗(1：1 000)避光室溫孵育2 h,磷酸緩沖液洗滌后,用Hoechst 33258復(fù)染核,置于熒光顯微鏡下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1褪黑素增強吉西他濱對PANC-1細胞增殖能力的抑制作用 與空白對照組比較,胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1細胞在高濃度的吉西他濱(>4 μmol·L-1)處理48、72 h后,細胞活力明顯下降(圖1A),呈時間劑量依賴性,低濃度吉西他濱處理48 h后細胞活力下降較少,其中4 μmol·L-1吉西他濱單獨作用48 h細胞活力下降18.5%;而聯(lián)合褪黑素處理后,隨褪黑素濃度增加,細胞活力明顯受限,其中4 μmol·L-1吉西他濱聯(lián)合1 mmol·L-1褪黑素作用48 h后,細胞活力下降52.4%(圖1B)。為進一步明確褪黑素聯(lián)合吉西他濱對PANC-1細胞增殖的抑制效應(yīng),采用平板克隆實驗,結(jié)果如圖1C所示:與空白對照組比較,4 μmol·L-1吉西他濱處理后細胞克隆形成輕度受限,而聯(lián)合褪黑素處理后,克隆形成明顯減少。見圖1。

A.吉西他濱處理PANC-1細胞48 h和72 h后的細胞活力;B.吉西他濱聯(lián)合不同濃度褪黑素處理PANC-1細胞48 h后的細胞活力;C.克隆形成實驗。①與空白對照組比較,t=3.29～54.2,P<0.05;②與吉巴他濱(4 μmol·L-1)組比較,t=6.74～17.9,P<0.05。

A.劃痕實驗;B.細胞遷移實驗;C.PANC-1細胞的遷移率;D.PANC-1細胞遷移的數(shù)量。①與空白對照組比較,t=1.67～7.74,P<0.05;②與吉西他濱組比較,t=10.44～18.90,P<0.01。

A.檢測不同處理過后細胞內(nèi)ROS的水平;B.熒光強度的定量。①與空白對照組比較,t=-4.63,-5.61,P<0.01;②與吉西他濱組比較,t=-9.01,P<0.01。

A.標記細胞中的線粒體;B.細胞線粒體膜電位的檢測;C.A圖中熒光強度的定量;D.B圖中紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值定量分析。①與空白對照組比較,t=3.97～6.32,P<0.01;②與吉西他濱組比較,t=7.90,16.97,P<0.01。

2.2褪黑素增強吉西他濱對PANC-1細胞遷移的抑制作用 空白對照組的PANC-1細胞遷移能力較強,劃痕48 h后,細胞遷移率為73.4%,吉西他濱單獨處理組細胞遷移率為57.3%,而吉西他濱聯(lián)合褪黑素處理組細胞遷移明顯受限,遷移率降低至18.6%;細胞Transwell結(jié)果再次證實褪黑素聯(lián)合吉西他濱較吉西他濱單獨處理明顯抑制PANC-1細胞遷移,與空白對照組比較,吉西他濱組單獨處理組細胞遷移數(shù)目減少不明顯;而聯(lián)合褪黑素處理后,遷移細胞數(shù)明顯下降(P<0.01)。見圖2。

2.3褪黑素聯(lián)合吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1細胞ROS的增加 與空白對照組比較,吉西他濱與褪黑素單獨處理48 h后,代表ROS的紅色熒光強度輕度增加;比較吉西他濱聯(lián)合褪黑素與吉西他濱單獨處理組ROS的合成,聯(lián)合處理組中紅色熒光強度顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

2.4褪黑素促進吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1細胞線粒體功能障礙 與空白對照組比較,吉西他濱單獨處理組Mito-tracker標記的線粒體(紅色熒光)的平均吸光度輕度下降,而聯(lián)合褪黑素處理后,紅色熒光顯著降低(P<0.01);JC-1線粒體膜點位檢測證實褪黑素促進吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1細胞線粒體膜點位的下降,結(jié)果如圖4C所示:空白對照組細胞線粒體功能正常,呈現(xiàn)高紅高綠的熒光信號,吉西他濱單獨處理后,紅色熒光強度輕度下降,而褪黑素聯(lián)合吉西他濱處理組紅色熒光明顯下降,細胞呈現(xiàn)出高綠低紅的熒光信號,代表細胞線粒體膜點位的降低,進一步比較紅色熒光與綠色熒光的比值,與單獨吉西他濱處理比較,聯(lián)合處理組紅綠熒光比值下降顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

2.5褪黑素聯(lián)合吉西他濱抑制PANC-1細胞自噬 免疫熒光結(jié)果如圖5A,5C所示:空白對照組與吉西他濱單獨處理組LC3(綠色)熒光強度類似,褪黑素組的熒光強度輕度下降,而吉西他濱聯(lián)合褪黑素組熒光強度明顯下降(P<0.01)。Western blotting結(jié)果見圖5B、5D:與空白對照組比較,褪黑素組LC3B-II/LC3B-I比值降低,自噬底物p62表達增加,吉西他濱組LC3B-II/LC3B-I比值未見明顯改變;而吉西他濱聯(lián)合褪黑素組LC3B-II/LC3B-I比值明顯降低,p62的表達顯著增加,代表褪黑素聯(lián)合吉西他濱抑制了PANC-1細胞自噬,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A.免疫熒光法檢測LC3蛋白的表達水平;B.Western blotting法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的表達水平;C、D.B圖中蛋白表達水平的定量分析。①與空白對照組比較,t=4.07,-4.22,-10.87,P<0.01;②與吉西他濱組比較,t=16.08,-6.13,P<0.01。

2.6褪黑素聯(lián)合吉西他濱促進PANC-1細胞鐵死亡 Fe2+檢測結(jié)果見圖6A、6B:空白對照組代表Fe2+的紅色熒光強度較弱,單獨使用吉西他濱和褪黑素組的紅色熒光強度輕度增加;與吉西他濱單獨處理組比較,吉西他濱聯(lián)合褪黑素組的紅色熒光強度顯著增加(P<0.01)。Western blotting結(jié)果見圖6C、6D、6E:與空白對照組比較,單用褪黑素和吉西他濱組的SLC7A11及GPX4的蛋白表達水平輕度降低;吉西他濱聯(lián)合褪黑素組的SLC7A11及GPX4的蛋白表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A.褪黑素和吉西他濱單獨或聯(lián)合處理PANC-1細胞后細胞內(nèi)Fe2+水平;B.A圖中熒光強度的定量分析;C.Western blotting法檢測鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、SLC7A11的表達水平;D、E.圖中蛋白表達水平的定量分析。①與空白對照組比較,t=-4.63,-10.43,9.16,11.52,9.08,8.69,P<0.01;②與吉西他濱組比較,t=-7.78,6.52,7.11,P<0.01。

3 討論

胰腺癌是目前最致命的惡性腫瘤之一,且通常在晚期被發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致總體預(yù)后較差。吉西他濱作為胰腺癌化療中的一線用藥,其化療敏感性的下降限制了其臨床應(yīng)用[13]。因此,提升胰腺癌的化療敏感性一直都是臨床研究的熱點話題。褪黑素具有改善睡眠、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種生理功能,有研究發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合化療藥物使用可以明顯增強化療藥物的敏感性。CHEN等[14]的研究顯示,褪黑素對肝癌細胞具有抑制作用,并通過調(diào)控lncRNA RAD51-AS1增加肝癌細胞的化療敏感性。本研究顯示,低濃度的吉西他濱對胰腺癌細胞的增殖、遷移能力抑制作用較低,而聯(lián)用褪黑素后明顯抑制腫瘤細胞增殖,且褪黑素可通過增加ROS的合成、促進線粒體功能障礙、抑制細胞自噬以及促進腫瘤細胞鐵死亡增強了胰腺癌細胞PANC-1對吉西他濱的化療敏感性。

細胞自噬是細胞降解代謝廢物的過程,包括細胞成分被降解和循環(huán)利用,這對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分重要[15]。研究表明,與正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞比較,胰腺癌細胞具有更高的自噬水平,是腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[16]。這些腫瘤細胞通過促進自噬有效的清除代謝廢物,維持較高的細胞活性,從而有助于抵抗化療藥物對其造成的損傷,同時它還可以利用自噬代謝掉化療藥物產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì),增強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,因此,抑制腫瘤自噬是增強抗腫瘤藥物化療敏感性的重要策略[17-19]。本研究結(jié)果顯示,褪黑素聯(lián)合吉西他濱通過抑制LC3-II/LC3-I,增加p62的表達進而抑制細胞自噬,提示褪黑素可能是通過抑制自噬增強吉西他濱化療作用。

鐵死亡是一種鐵依賴性的區(qū)別于細胞凋亡的死亡方式,其主要是由于細胞膜上過載的脂質(zhì)過氧化所引起的[20-23]。有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與腫瘤細胞耐藥性存在一定的聯(lián)系,可能是通過調(diào)控GPX4和xCT系統(tǒng)從而促進腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它可以將磷脂氫過氧化物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷脂醇,靶向抑制GPX4可以誘導(dǎo)細胞膜脂質(zhì)過氧化的聚積,從而在體內(nèi)和體外環(huán)境下誘導(dǎo)鐵死亡[24]。SLC7A11是xc-系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運蛋白亞基,通過FIN阻斷SLC7A11介導(dǎo)的胱氨酸轉(zhuǎn)運能夠在許多腫瘤細胞中誘導(dǎo)鐵死亡,并增加其化療敏感性[25]。這些相關(guān)基因是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的重要機制。本研究顯示,與吉西他濱組比較,聯(lián)合用藥組的GPX4、SLC7A11的表達均明顯下調(diào)(P<0.01),提示褪黑素提升化療敏感性的機制可能與降低鐵死亡相關(guān)基因(GPX4、SLC7A11)的表達有關(guān)。后續(xù)還需進一步研究來確定其作用的具體靶點及作用機制。

綜上所述,本實驗結(jié)果證實了褪黑素能夠通過抑制細胞自噬及促進鐵死亡進而增強胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。本研究為胰腺導(dǎo)管腺癌的治療提供了一種潛在的化療藥物組合,并提示靶向開發(fā)一種自噬抑制劑及鐵死亡誘導(dǎo)劑可能作為增敏吉西他濱化療敏感性的潛在策略。