李紅,董瑋,侯杰,賀德

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院普通外科,深圳 518000)

流行病學(xué)結(jié)果顯示,大腸癌(主要包括結(jié)腸癌和直腸癌)的發(fā)病率居消化道惡性腫瘤第二位,嚴(yán)重威脅著我國(guó)居民的生命健康[1-2]。隨著生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,以及個(gè)體化靶向干預(yù)手段在臨床應(yīng)用的推廣,極大地提高了患者的生命質(zhì)量,其中天然藥物尤其源自海洋的海洋藻類植物成為國(guó)內(nèi)外眾多研究學(xué)者的研究熱點(diǎn)[3]。LI 等[4]研究報(bào)道褐藻中多酚類具有明顯的抗氧化、抗炎性以及抗腫瘤增殖等藥理活性。BLESSIE等[5]研究顯示海洋褐藻的提取物能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及母體抗生物皮膚生長(zhǎng)因子同源物2/3(mothers against decapentaplegic homolog 2/3,Smad2/3)信號(hào)是一條內(nèi)源性的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的通路[6]。研究顯示該信號(hào)在胃癌、食管癌等消化道惡性腫瘤中表達(dá)異常,并且異常表達(dá)的TGF-β1直接增強(qiáng)Smad2/3的磷酸化,增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力[7]。PEREZ等[8]研究顯示在結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌小鼠中,抑制TGF-β1信號(hào)能明顯降低模型動(dòng)物中結(jié)腸的成瘤數(shù)目。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞HT29為研究對(duì)象,從TGF-β1/ Smads信號(hào)入手,探討海洋褐藻的主要組分褐藻聚合酚(phlorofucofuroeckol A,PFFE-A)對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外增殖與侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞、動(dòng)物及主要試劑和儀器 腸癌細(xì)胞株HT29購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫。C57BL/6雄性裸鼠,SPF級(jí),4～5周齡,體質(zhì)量18～22 g,32只。購(gòu)自廣州藥康生物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0054;倫理編號(hào)19-08-11HTREW-01。以基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由攝食與飲水,在溫度(23 ℃～25 ℃),濕度(45%～55%),12 h/12 h明暗交替下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)。PFFE-A(純度≥99.9%,批號(hào):CHO-JL92)購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司。5-乙炔基-2'脫氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)染色試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司(批號(hào):AHI-239PD);Transwell小室(批號(hào):CAMF-08ND)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;Trizol試劑(批號(hào):TH03-KGF483)、逆轉(zhuǎn)錄試劑(批號(hào):TH03-DNS327)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;TGF-β1(批號(hào):ROG94-VM649)、p-Smad2/3(批號(hào):ROG37-CH056)抗體購(gòu)自美國(guó)Roche公司;TGF-β1信號(hào)激動(dòng)劑重組人TGF-β1(批號(hào):2021-06-EV004)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。LRH-70F型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)BioTek公司),IX71型Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司),電泳槽(型號(hào):Mini-PRO-2100)、電泳儀(型號(hào):JMR-27020)購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。

1.2細(xì)胞分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分為正常對(duì)照組,PFFE-A小劑量組、中劑量組、大劑量組,培養(yǎng)基中分別添加50,100,150 μmol· L-1的小、中、大劑量的PFFE-A。

1.3顯微鏡觀察各組結(jié)腸癌的細(xì)胞形態(tài) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞接種在24孔板上,并調(diào)整細(xì)胞密度到每孔2×104個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,培養(yǎng)24 h后,通過IX71倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.4EdU染色檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞接種在24孔板上,并調(diào)整細(xì)胞密度到每孔3×105個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,培養(yǎng)24 h后,嚴(yán)格在試劑盒的要求下進(jìn)行染色、固定、封片,拍照,LAS AF Lite圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

1.5Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞接種在6孔板上,并調(diào)整細(xì)胞密度到每孔1×106個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,培養(yǎng)24 h后,PBS重懸,滴加至預(yù)先基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室中,培養(yǎng)24 h后,漂洗、固定、染色[10],顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的侵襲數(shù)量。

1.6異種種植結(jié)腸癌裸鼠模型 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞至每孔2×106個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到1×107個(gè)·mL-1時(shí),消化,制成單細(xì)胞懸液,將裸小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、PFFE-A(小、中、大)劑量組,每組8只,將已備好的各組細(xì)胞懸液分別皮下注射到小鼠的后肢腹股溝處,在28 d后,將150 mg· kg-1的熒光素Promega腹腔注射到小鼠體內(nèi),10 min后連接IVIS Spectrum成像系統(tǒng)[11],數(shù)碼相機(jī)對(duì)小鼠原位腫瘤拍照,IVIS Spectrum成像系統(tǒng)記錄結(jié)腸癌病灶轉(zhuǎn)移灶的情況,處死小鼠并無菌剝離小鼠的瘤體組織,稱體質(zhì)量。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)各組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)相關(guān)基因的表達(dá) 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞至每孔2×105個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,漂洗,Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,PCR儀擴(kuò)增,采用2-△△Ct來表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量[12],以GAPDH作為參照,基因序列:GAPDH正義鏈:5′-AAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3′,反義鏈:5′-GGTCCAGGGTTTCTTACTCCT -3′;E-鈣黏蛋白(E-cadherin)正義鏈:5′-AACGGGGACGAAGTGCTAAG-3′,反義鏈:5′-CCTCTGCAGGACCTTGATCTC-3′;神經(jīng)型鈣粘附蛋白(N-cadherin)正義鏈:5′-TGGAGGCCACTATCCGAGAA-3′,反義鏈:5′-GAAGCGCTCAGGCATAAACC-3′。

1.8Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白和TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)水平 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞至每孔2×106個(gè),細(xì)胞分組同“1.2節(jié)”,收集細(xì)胞,裂解,離心,定量,取樣品40 μg進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜后,封閉液中孵育,加入一抗(1：500),4 ℃孵育過夜,加入二抗(1：1 000),顯色[13],以GAPDH作為內(nèi)參。

1.9功能挽救實(shí)驗(yàn) 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞至每孔2×106個(gè),分別以150 μmol·L-1的PFFE-A(PFFE-A組)、150 μmol·L-1的PFFE-A+20 ng· mL-1的TGF-β1信號(hào)激動(dòng)劑(重組人TGF-β1激動(dòng)劑組)干預(yù),另設(shè)立正常對(duì)照組HT29細(xì)胞,不進(jìn)行任何干預(yù),分別進(jìn)行Edu以及Transwell小室實(shí)驗(yàn),評(píng)估細(xì)胞的增殖與侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1各組HT29細(xì)胞的形態(tài)改變 顯微鏡下正常對(duì)照組HT-29細(xì)胞形狀規(guī)整,多為圓形或橢圓形,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,胞間連接緊密,活性細(xì)胞呈片狀聚集生長(zhǎng);PFFE-A 小、中、大劑量組細(xì)胞的生長(zhǎng)受限明顯,活性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞間的連接松散,成片生長(zhǎng)的細(xì)胞體積明顯減小,并且隨藥物劑量的升高,可見的漂浮細(xì)胞或壞死細(xì)胞數(shù)量明顯增多,見圖1。

2.2EdU染色檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力 EdU染色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞中的EdU陽性比例顯著下降(t=-4.536～-1.257,P<0.05),并且具有明顯的劑量依賴性(P<0.05),見圖2。

2.3Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 Transwell小室侵襲結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯下降(t=-78.426～-24.927,P<0.05),具有明顯的劑量依賴性(P<0.05),見圖3。

2.4各組結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的能力 異種種植結(jié)腸癌裸鼠模型結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞皮下成瘤瘤組織質(zhì)量顯著下降(t=-10.549～-2.157,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖4。IVIS Spectrum成像系統(tǒng)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞病灶轉(zhuǎn)移比例顯著下降(t=-47.916～-8.073,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖5。

A.正常對(duì)照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對(duì)照組比較,t=-10.549～-2.157,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-8.447～-1.943,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.571,P<0.05。

A.正常對(duì)照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對(duì)照組比較,t=-47.916～-8.073,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-33.745～-6.877,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-7.359,P<0.05。

A.正常對(duì)照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對(duì)照組比較,t=-11.258～-3.018,-10.982～-2.847,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-9.673～-2.542,-8.961～-1.846,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.746,-1.445,P<0.05。

A.正常對(duì)照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對(duì)照組比較,t=-4.687～-2.156,-5.743～-2.259,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-3.872～-1.761,-4.975～-2.093,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.147,-2.004,P<0.05。

2.5各組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá) RT-PCR結(jié)果和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞中E-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高(t=-11.258～-3.018,P<0.05),N-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低(t=-10.982～-2.847,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖6。

2.6Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組對(duì)照比較,PFFE-A小、中、大劑量組細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)顯著下降(t=-4.687～-2.156,-5.743～-2.259,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖7。

2.7功能挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果 EdU以及Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組細(xì)胞比較,PFFE-A組細(xì)胞、重組人TGF-β1激動(dòng)劑組細(xì)胞EdU陽性比例以及細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯下降,與PFFE-A組細(xì)胞比較,重組人TGF-β1激動(dòng)劑組細(xì)胞EdU陽性比例以及細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯回升,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-62.958～-13.256,P<0.05),見圖8。

①與正常對(duì)照組比較,t=-62.958～-13.256,P<0.05;②與PFFE-A組比較,t=-44.571～-21.989,P<0.05。

3 討論

目前,大腸癌的發(fā)病率逐年升高,并且患者的5年生存率仍比較低[14]。已有的研究顯示[15]大腸癌患者在確診后的再次局部復(fù)發(fā)及發(fā)生靶器官的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散,直接危及患者的生命安全。因此從疾病的分子機(jī)制出發(fā),積極探索腫瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,開發(fā)新型的抗腫瘤藥物在臨床上有助于提高患者的生命質(zhì)量。

海洋褐藻(昆布)作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源性的中藥組分,具有抗炎、抗病毒以及抗腫瘤效用,其中,海洋褐藻的抗腫瘤效應(yīng)仍處于實(shí)驗(yàn)探索階段[16]。MANANDHAR等[17]研究顯示PFFE-A作為海洋褐藻的重要的生物活性組分,展示了多種靶向效應(yīng),能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示,PFFE-A的應(yīng)用能明顯抑制HT29細(xì)胞的體外的增殖與侵襲、體內(nèi)的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移,并且這些效應(yīng)顯示出良好的劑量依賴性。這些結(jié)果表明了藥物對(duì)疾病的良好的干預(yù)作用。

細(xì)胞的EMT是完成腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[18]。MOSA等[19]研究顯示EMT后,促使癌細(xì)胞在原發(fā)位點(diǎn)進(jìn)行增殖,并直接推動(dòng)其與原發(fā)腫瘤的分離,并浸潤(rùn)到其他靶器官中。CORBET等[20]研究顯示抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。E-cadherin表達(dá)的缺失以及N-cadherin表達(dá)的增強(qiáng)是發(fā)生EMT的標(biāo)志性事件。本研究的PCR與Western blotting結(jié)果均顯示PFFE-A能明顯抑制N-cadherin的表達(dá),而增加E-cadherin的表達(dá),從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程。

已有的研究數(shù)據(jù)顯示[21]腫瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)在多種信號(hào)(包括TGF-β1/Smads信號(hào)在內(nèi))共同作用的病理過程。研究顯示[22]TGF-β1被外界因子激活后,促使下游轉(zhuǎn)錄因子Smad2、Smad3發(fā)生磷酸化而生成p-Smad2/3,促使腫瘤信號(hào)入核,促進(jìn)相關(guān)癌基因的轉(zhuǎn)錄以及翻譯,增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖與侵襲。KIM等[23]研究顯示,阻斷TGF-β1/Smads的傳導(dǎo)能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示PFFE-A能顯著抑制TGF-β1的表達(dá),抑制Smads(Smad2、Smad3)的磷酸化,并且具有明顯的劑量依賴性,挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β1信號(hào)激動(dòng)劑逆轉(zhuǎn)PFFE-A對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖與侵襲的抑制。

綜合上述,PFFE-A能抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過程,抑制大腸癌細(xì)胞HT29的體外增殖與侵襲能力,下調(diào)其體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的能力,這可能是通過下調(diào)TGF-β1/Smads信號(hào)實(shí)現(xiàn)的,但是PFFE-A在大腸癌中是否還存在其他作用靶點(diǎn)仍需更為深入的研究。