楊楚顥,陳鏡樓,陳濤

(1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科,武漢 430014;2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部,武漢 430056;3.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430014)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia,BPH)是中老年男性的常見疾病,發(fā)病率隨年齡遞增。據(jù)報道,BPH在50歲以上男性群體中的發(fā)病率已經(jīng)超過50%[1]。BPH和其帶來的下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms,LUTS)給患者帶來極大的生活障礙和持續(xù)性的經(jīng)濟(jì)壓力。5α-還原酶抑制劑和α受體阻滯劑是BPH臨床干預(yù)的推薦藥物。然而,α受體阻滯劑并不能減小前列腺體積,而使用5α-還原酶抑制劑后25%～30%的患者LUTS沒有改善,甚至有5%～7%的患者出現(xiàn)進(jìn)一步惡化[2]。隨著外科手術(shù)的改進(jìn),相對于經(jīng)尿道電切除手術(shù),銩激光前列腺切除術(shù)等正得到廣泛的應(yīng)用,但依然存在23%以上概率的術(shù)后LUTS等問題[3]。研究發(fā)現(xiàn)BPH的3個主要病理生物學(xué)過程包括腺體增生、平滑肌收縮和前列腺纖維化,3個過程可以單獨(dú)或聯(lián)合作用,促進(jìn)BPH的臨床進(jìn)展[4]。BPH通常伴隨(盡管并非總是)LUTS,而以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特點(diǎn)的纖維化將損傷前列腺尿道柔韌性,從而引起尿路梗阻癥狀[1,5]。目前針對器官纖維化的防治手段十分有限[6]。芒果苷是一種天然黃酮類化合物,具有抗菌、降低膽固醇、抗過敏、強(qiáng)心、抗糖尿病、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[7]。研究顯示,芒果苷對腎臟、肺、心臟和肝臟等器官纖維化具有改善作用[8]。筆者尚未見有關(guān)芒果苷對前列腺纖維化影響的報道。本文研究芒果苷對前列腺纖維化的影響和其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 特殊化學(xué)修飾的微小RNA(MicroRNA,miRNA)-483-3p 拮抗劑購于上海吉瑪生物有限公司(批號:12953)。丙酸睪酮注射液購于天津金耀藥業(yè)有限公司(批號:150822)。芒果苷購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(純度≥98%,批號:M14062)。非那雄胺片購于杭州默沙東制藥有限公司(批號:U011856,規(guī)格:每片5 mg)。熒光素酶報告試劑盒(批號:E2920)和psiCHECKTM-2 載體(批號:C8021)購于美國Promega公司。實(shí)時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)檢測試劑盒購于美國KAPA Biosystems公司(批號:KM4101)。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20190626)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、絲裂原活化蛋白激酶2(mmitogen activated protein kinase 2,MK2)和絲裂原活化蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 7周齡無特定病原體(SPF)級雄性C57BL/6小鼠(體質(zhì)量22～24 g)購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(動物生產(chǎn)許可證號:SCXK鄂2015-0019)。動物飼養(yǎng)于(23±2) ℃,濕度50±5%及12 h光照/12 h黑暗循環(huán)環(huán)境中。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Stepone plus型實(shí)時定量PCR儀(美國ABI公司)。Luminoskan 5200110型熒光酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動物分組與造模 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)環(huán)境1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=6):正常對照組、BPH模型對照組、非那雄胺組、芒果苷組和芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。小鼠BPH模型通過手術(shù)切除睪丸和每日皮下注射7.5 mg·kg-1丙酸睪酮建立,持續(xù)30 d[9]。其中非那雄胺組和芒果苷組分別每日灌胃給予1 mg·kg-1的非那雄胺(0.5% CMC-Na溶解)[9]或100 mg·kg-1的芒果苷[7]。芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組每日灌胃給予100 mg·kg-1的芒果苷,并參考說明書每隔5 d進(jìn)行1次尾靜脈注射10 mg·kg-1的miRNA-483-3p拮抗劑。正常對照組和BPH模型對照組小鼠每日灌胃給予等體積的0.5% CMC-Na。30 d后通過腹膜內(nèi)注射80 mg·kg-1戊巴比妥鈉來麻醉小鼠,頸椎脫臼處死動物,分離前列腺,取部分組織制備石蠟切片行Masson和天狼猩紅染色,部分新鮮組織行qPCR、Western blotting和生化指標(biāo)檢測。動物實(shí)驗(yàn)操作遵從湖北省實(shí)驗(yàn)動物管理條例,操作人員資格號TY20190784。

1.4.2前列腺纖維化評價 通過天狼猩紅和masson染色觀察前列腺膠原沉積情況,以及定量檢測前列腺組織Hyp含量綜合評價腺體纖維化程度。每張切片隨機(jī)選取3個視野,采用Image-Pro Plus 6.0版軟件計算染色陽性面積占比。前列腺Hyp含量按照試劑盒說明書步驟檢測。

1.4.3MK2信號通路評估 MK2信號通路的活躍程度一方面通過qPCR檢測前列腺M(fèi)K2、TGF-β1和MKK6的mRNA水平評價。MK2(264 bp)前引物為5′-GGAAGTGCCTGCTGAT-3′,后引物為5′-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3′。TGF-β1(153 bp)前引物為5′- AGGAGACGGAATACAGGG-3′,后引物為5′-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3′。MKK6(146 bp)前引物為5′-CCTCAGACCAGTTCCAC-3′,后引物為5′-CGCATCTTCTCCACCA-3′。根據(jù)試劑盒說明書行qPCR檢測。另一方面通過western blot檢測前列腺TGF-β1、MK2、p-MK2、MKK6和p-MKK6的蛋白水平評價。具體步驟參考前期研究基礎(chǔ)[10]。

1.4.4miRNA-483-3p水平檢測 miRNA-483-3p的前引物為5′- GGGTCACTCCTCCCCT-3′,后引物為5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′,逆轉(zhuǎn)錄RT引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAA-GACGGG-3′。參考說明書行qPCR檢測。

1.4.5熒光素酶報告測試 克隆MK2-3′UTR,并將其導(dǎo)入psiCHECKTM-2載體。分別構(gòu)建MK2野生型(WT)和MK2突變型(MUT)的熒光素酶報告質(zhì)粒。采用Lipofectamine3000將miRNA-483-3p共轉(zhuǎn)染入工具細(xì)胞HEK-293T,空白對照組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。24 h后根據(jù)熒光素酶報告試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1芒果苷減輕前列腺纖維化 天狼猩紅和masson染色結(jié)果表明,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺膠原沉積明顯(如箭頭所示,天狼猩紅染為紅色,Masson染為藍(lán)色),且膠原蛋白的主要成分Hyp的含量顯著性升高(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠有效抑制小鼠前列腺的膠原沉積,降低組織Hyp的含量(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑和芒果苷同時干預(yù)顯著加劇了前列腺膠原沉積,升高Hyp的含量(P<0.01)。結(jié)果表明,芒果苷具有減輕前列腺纖維化的潛力,且與調(diào)節(jié)前列腺miRNA-483-3p水平有關(guān)。見圖1。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗組。①與BPH模型對照組比較,t(天狼猩紅)=0.262～12.09,t(masson)=1.753～16.229,t(Hyp)=3.045～13.593, P<0.01;②與芒果苷組比較,t(天狼猩紅)=-6.946,t(masson)=-5.762,t(Hyp)=-2.766,P<0.01。

2.2芒果苷抑制前列腺TGF-β1、MK2和MKK6水平 qPCR檢測結(jié)果(圖2)顯示,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平顯著性升高(P<0.01),而miRNA-483-3p的水平顯著性下降(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠顯著性升高前列腺miRNA-483-3p的水平,并降低TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑組顯著升高了前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.05),降低了miRNA-483-3p的水平(P<0.01)。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。①與BPH模型對照組比較,t(miRNA-483-3p)=-4.377～12.321,t(MKK6)=1.609～15.75,t(MK2)=1.456～15.69,t(TGF-β1)=1.058～15.244,P<0.01;②與芒果苷組比較,t(miRNA-483-3p)=6.056,t(MK2)=-3.189,t(TGF-β1)=-3.854,P<0.01;③與芒果苷組比較,t(MKK6)=-2.284,P<0.05。

從圖3可以看出,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平顯著性升高(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠顯著性降低前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑組顯著升高了前列腺前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。①與BPH模型對照組比較,t(p-MKK6)=0.81～8.37,t(p-MK2)=0.444～7.376,t(TGF-β1)=0.738～10.833,P<0.01;②與芒果苷組比較,t(p-MKK6)=-6.029,t(p-MK2)=-5.399,t(TGF-β1)=-6.827,P<0.01。

2.3miRNA-483-3p靶向抑制MK2 通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miRNA-483-3p與MK2存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報告檢測結(jié)果顯示,相對于空白對照組,miRNA-483-3p模擬物共孵育能夠顯著抑制野生型MK2的熒光素酶活力(P<0.01),但對結(jié)合位點(diǎn)突變后的MK2無此效應(yīng),提示miRNA-483-3p具有靶向抑制MK2的能力。見圖4。

①與野生型(WT)空白對照比較,t=-15.202,P<0.01。

3 討論

器官纖維化是一種漸進(jìn)性的病理過程,通常表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM))的異常積聚。其中,膠原沉積是重要特征之一,終點(diǎn)將是器官的進(jìn)行性結(jié)構(gòu)重塑[11-12]。最近研究報道和我們的前期研究發(fā)現(xiàn)均表明,阻斷纖維化是防治BPH和改善LUTS的可行方向[1,4,10]?，F(xiàn)已知有多種信號通路參與器官纖維化的過程[11]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族在細(xì)胞增殖分化、血管生成、氧化應(yīng)激等多種生理活動中發(fā)揮重要作用[13]。MK2是MAPK活化蛋白激酶,在多種病理條件下均已觀察到MK2的異?；钴S現(xiàn)象[14]。此外,MAPK通路的另一重要組成成分MKK6在前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等疾病中均呈過表達(dá)狀態(tài)[15]。不僅如此,MKK6是MK2的上游調(diào)控者,它們的異常表達(dá)將影響肌成纖維細(xì)胞的生物行為[16]。

TGF-β1是MK2的另一上游節(jié)點(diǎn)[17]。迄今為止,TGF-β1是已知的最強(qiáng)力的促纖維化因子之一,能夠直接介導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的增殖和分化,以及ECM的合成和分泌,從而加速器官纖維化的進(jìn)程[18]。阻斷MK2能夠在一定程度上抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化和ECM蛋白分泌[17]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),特異性阻斷MK2能夠明顯抑制人前列腺細(xì)胞的細(xì)胞增殖和膠原沉積[10]。本研究進(jìn)一步證實(shí),芒果苷改善前列腺膠原沉積和抑制腺體纖維化的能力與降低MK2信號通路活躍程度有關(guān)。

MiRNAs是一種內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,通過5'端與靶基因mRNA的3'端中非翻譯區(qū)特異性結(jié)合而抑制靶基因的功能[19]。近年來,miRNA-483家族基因參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展從而引起越來越多的關(guān)注。然而有關(guān)其確切的生物效應(yīng)和作用機(jī)制仍有待闡明。報道顯示[20],一方面miRNA-483在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象;另一方面,miR-483-3p具有抑制肝臟腫瘤和纖維化的潛力。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察到良性前列腺增生組織中miR-483-3p的水平明顯下降。通過芒果苷干預(yù)升高小鼠前列腺miR-483-3p的水平能夠顯著性抑制前列腺的膠原沉積情況。并且,miR-483-3p特異性拮抗劑能夠很大程度抵消芒果苷的上述作用。進(jìn)一步的生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告驗(yàn)證結(jié)果顯示,miR-483-3p能夠阻斷MK2表達(dá)。

綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)良性前列腺增生組織miRNA-483-3p的表達(dá)水平下降,芒果苷能夠通過調(diào)節(jié)miRNA-483-3p,抑制MK2表達(dá)來減輕前列腺纖維化。我國老年人群占比不斷上升,因此受前列腺纖維化相關(guān)的LUTS困擾的人群也逐年增加[21],本研究豐富了治療藥物的潛在來源。