方文生，田文鳳，2，李 園，顏冬冬，王秋霞*，曹坳程*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害綜合治理全國重點實驗室，北京 100193；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長沙 410128）

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中分解有機物質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)和生物質(zhì)的分解，從而影響土壤的肥力和結(jié)構(gòu)[1]；并抑制土壤病原菌的生長，幫助植物吸收養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長，提高土壤的抗旱能力和抗病能力[2-3]。因此，土壤微生物對于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和健康起著至關(guān)重要的作用。

土壤熏蒸能夠有效抑制土傳病害的發(fā)生，降低農(nóng)藥使用量，促進(jìn)作物生長并顯著提高其產(chǎn)量，表現(xiàn)出一定的肥料效應(yīng)，但同時對土壤微生物群落也產(chǎn)生了一定的影響[4-11]。Zeng等[4-5,8-9]研究表明，溴甲烷、氯化苦、威百畝、棉隆等顯著抑制了微生物的多樣性和群落組成。如氯化苦熏蒸顯著降低了土壤細(xì)菌和真菌群落的多樣性，至試驗結(jié)束（90 d）土壤細(xì)菌和真菌群落α多樣性依舊未能恢復(fù)至對照水平[7]。Fang等[12-13]研究也顯示，氯化苦顯著降低了細(xì)菌群落的多樣性，熏蒸后細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)Shannon、Chao1和ACE顯著降低，Simpson顯著升高。但也有試驗顯示，棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫、異硫氰酸烯丙酯熏蒸對土壤微生物群落α和β多樣性影響較小，熏蒸后第24天，4種熏蒸劑處理的土壤細(xì)菌ACE、Chao1和Shannon多樣性指數(shù)顯著增加，在第38天，4種熏蒸劑處理的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)與對照沒有顯著差異，表明微生物群落多樣性恢復(fù)到了未消毒水平[12]。上述結(jié)果表明，棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫、異硫氰酸烯丙酯熏蒸均促進(jìn)了土壤微生物群落α多樣性的增加，但刺激作用是短暫的。根據(jù)Zhu等[14]的研究，異硫氰酸烯丙酯熏蒸降低了細(xì)菌群落的多樣性，但增加了真菌群落的多樣性。由于土壤本身的特異性差異巨大，同一種熏蒸劑對微生物群落的影響可能存在不同的結(jié)果。

以往大多數(shù)研究均基于特定試驗進(jìn)行分析，因而其結(jié)果只適用于特定的生物地理環(huán)境與熏蒸劑，導(dǎo)致土壤熏蒸對微生物的影響研究存在一定的不確定性。為了進(jìn)一步明確土壤熏蒸對微生物群落的影響，本文基于數(shù)據(jù)整合分析方法（meta-analysis）原理，鑒于已有的研究成果，定量分析我國常用6種熏蒸劑氯化苦（chloropicrin，CP）、棉?。╠azomet，DZ）、二甲基二硫（dimethyl disulfide，DMDS）、1,3-二氯丙烯（1,3-dichloropropene，1,3-D）、乙蒜素（ethylicin，EH）和異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）對土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的影響，為科學(xué)應(yīng)用土壤消毒技術(shù)提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

數(shù)據(jù)來自于web of science和中國知網(wǎng)2個文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)收集過程中，設(shè)置“土壤消毒”“熏蒸劑”和“微生物群落”3個關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索。篩選條件：同一試驗包含配對的對照組與處理組，對照組為不熏蒸，處理組為熏蒸處理；試驗處理重復(fù)數(shù)大于或等于3。數(shù)據(jù)收集內(nèi)容主要包括細(xì)菌和真菌多樣性及群落組成結(jié)構(gòu)，以及每個試驗對應(yīng)的相關(guān)信息，如熏蒸劑用量、采樣時間、土壤類型、pH等。共獲得符合條件的已發(fā)表文獻(xiàn)37篇，相匹配的有效數(shù)據(jù)117組。

1.2 數(shù)據(jù)分析

采用反應(yīng)比（lnR）作為meta分析效應(yīng)大小的度量標(biāo)準(zhǔn)（效應(yīng)值），該指標(biāo)反映了土壤消毒對微生物群落變化的影響。計算公式和方差分別為：

式中：Xe、Xc分別為熏蒸組和對照的平均值；Se、Sc分別為熏蒸組和對照的標(biāo)準(zhǔn)差；Ne、Nc分別為熏蒸組和對照的樣本數(shù)。lnR＞0，表示熏蒸對微生物產(chǎn)生刺激效應(yīng)（正效應(yīng)）；lnR＜0，則表示熏蒸對微生物產(chǎn)生抑制效應(yīng)（負(fù)效應(yīng)）。lnR及V（lnR）利用metafor包在R（4.01）中完成[15]。

1.3 統(tǒng)計分析

考慮到不同試驗地點熏蒸試驗的差異性，采用隨機效應(yīng)模型對連續(xù)變量（熏蒸劑用量、采樣時間等）和分類變量（土壤類型）進(jìn)行檢驗，圖表均采用ggplot2包進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤消毒對微生物群落多樣性的影響

土壤消毒對土壤微生物群落多樣性產(chǎn)生了顯著影響，但不同熏蒸劑的影響程度不同，見圖1。圖中*表示顯著性，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。氯化苦和異硫氰酸烯丙酯對細(xì)菌群落的多樣性具有顯著抑制效應(yīng)，其中，氯化苦對ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)的分別為-0.16（p＜0.001）和-0.12（p＜0.001），異硫氰酸烯丙酯分別為-0.089（p=0.023）和-0.088（p=0.0014），表明氯化苦對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)強于異硫氰酸烯丙酯。相反，乙蒜素、棉隆、二甲基二硫、1,3-二氯丙烯對細(xì)菌群里多樣性無顯著影響。

圖1 不同熏蒸劑對土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性的效應(yīng)值

真菌群落多樣性的結(jié)果表明，5種熏蒸劑中只有氯化苦對其產(chǎn)生了顯著的抑制效應(yīng)，ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為-0.36（p＜0.001）和-0.28（p＜0.001）。而異硫氰酸烯丙酯和1,3-二氯丙烯對真菌群落的多樣性表現(xiàn)出一定的刺激效應(yīng)（lnR＞0），但只有1,3-二氯丙烯對ACE指數(shù)具有顯著性（0.19，p＜0.01）。與細(xì)菌群落一致，乙蒜素和棉隆對真菌群落多樣性無顯著影響。

總體而言，氯化苦熏蒸對細(xì)菌和真菌群落多樣性具有顯著抑制效應(yīng)，異硫氰酸烯丙酯對細(xì)菌群落多樣性有抑制作用，但對真菌群落無顯著影響；相反，1,3-二氯丙烯對細(xì)菌群落多樣性無顯著影響，但對真菌群落多樣性具有刺激效應(yīng)；而乙蒜素、棉隆、二甲基二硫?qū)?xì)菌和真菌群落多樣性均不產(chǎn)生顯著影響。

2.2 土壤消毒對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤中豐度較高的優(yōu)勢細(xì)菌包括Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Planctomycetes，其相加的總豐度占土壤總細(xì)菌的84.12%～92.05%。土壤消毒對優(yōu)勢細(xì)菌的豐度產(chǎn)生顯著影響，既有抑制效應(yīng)也有刺激效應(yīng)，見圖2。

圖2 不同熏蒸劑對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)效應(yīng)值

盡管乙蒜素對Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Planctomycetes等7個門細(xì)菌水平無顯著影響，但棉隆和異硫氰酸烯丙酯對Proteobacteria和Planctomycetes產(chǎn)生顯著負(fù)效應(yīng)，且對Planctomycetes的抑制效應(yīng)大于Proteobacteria（DZ，-0.55與-0.12，p＜0.05；AITC，-0.94與-0.18，p＜0.05），同時對Firmicutes和Actinobacteria（AITC除外）產(chǎn)生顯著正效應(yīng)。棉隆和異硫氰酸烯丙酯具有相似的微生物物種選擇性作用，可能是因為兩者均為異硫氰酸酯類物質(zhì)[16]。二甲基二硫和1,3-二氯丙烯熏蒸對Acidobacteria產(chǎn)生顯著負(fù)效應(yīng)，對Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadetes產(chǎn)生正效應(yīng)但無顯著性。相反，氯化苦熏蒸除了對Proteobacteria無顯著影響外，對其他6種細(xì)菌均產(chǎn)生顯著影響，如對Planctomycetes（-0.86，p＜0.001）、Chloroflexi（-0.89，p＜0.001）、Acidobacteria（-0.59，p＜0.001）具顯著抑制作用，對Firmicutes（0.87，p＜0.001）、Gemmatimonadetes（0.44，p＜0.01）、Actinobacteria（0.36，p＜0.01）具顯著刺激作用?？梢姡然鄬?xì)菌群落組成的影響較其他幾種熏蒸劑更顯著。

由于真菌通常以菌絲或孢子的形式存在土壤中，其應(yīng)對外界脅迫比細(xì)菌具有更強的抵抗力。通過比較4種優(yōu)勢真菌Ascomycota、Mortierellomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota的lnR（圖3），發(fā)現(xiàn)1,3-二氯丙烯和異硫氰酸烯丙酯只對Mortierellomycota產(chǎn)生了顯著正效應(yīng)（lnR=2.25，p=0.02；lnR=0.99，p＜0.001），氯化苦只對Basidiomycota產(chǎn)生了顯著負(fù)效應(yīng)（lnR=-1.22，p＜0.05），而乙蒜素和棉隆對4種優(yōu)勢真菌均無顯著影響。相比于細(xì)菌，熏蒸劑對土壤真菌群落物種組成的影響較小，大部分物種在門水平無顯著變化。

圖3 不同熏蒸劑對真菌群落結(jié)構(gòu)效應(yīng)值

總體而言，土壤消毒對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的抑制和刺激作用，且對細(xì)菌群落的影響大于真菌。多數(shù)熏蒸劑對Firmicutes、Gemmatimonadetes、Mortierellomycota具正向刺激效應(yīng)，而對Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 和Basidiomycota具負(fù)向抑制效應(yīng)。其中乙蒜素對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均無顯著影響，棉隆對真菌群落無顯著影響。

2.3 土壤消毒后微生物群落演替的影響因素

以上分析表明，無論是對細(xì)菌還是真菌群落，氯化苦與其他幾種熏蒸劑相比，均產(chǎn)生更顯著的影響，因此，選用氯化苦作為代表藥劑以進(jìn)一步分析影響熏蒸效應(yīng)值的關(guān)鍵變量。收集的117組數(shù)據(jù)中包含紅壤、潮土、黏土3種土壤類型。土壤類型顯著影響熏蒸劑對細(xì)菌群落的效應(yīng)值（異質(zhì)性統(tǒng)計量Qm=34.73，p＜0.001），但對真菌群落多樣性無顯著影響（Qm=5.62，p=0.23）。

氯化苦田間用量通常為30～60 g/m2[17-18]，本文收集的文獻(xiàn)中氯化苦用量范圍為11～123 g/m2，涵蓋了其常規(guī)用量。將效應(yīng)值與熏蒸劑用量進(jìn)行相關(guān)性繪圖，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性效應(yīng)值與氯化苦用量呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.93，p＜0.001），見圖4～圖5。圖中細(xì)菌和真菌群落多樣性均選用Shannon指數(shù)。圖4表明氯化苦對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)隨著劑量增加而顯著增加。相反，由圖5可見，真菌群落多樣性效應(yīng)值與氯化苦用量呈正相關(guān)但無顯著性（p=0.13），表明隨著用量增加，氯化苦對真菌群落的抑制效應(yīng)逐漸減弱。分析其原因，可能是由于高劑量作用下，氯化苦促進(jìn)了某些真菌的生長[19]。

圖4 細(xì)菌多樣性效應(yīng)值與熏蒸劑用量、時間、土壤pH 相關(guān)性

圖5 真菌多樣性效應(yīng)值與熏蒸劑用量、時間、土壤pH 相關(guān)性

田間操作時一般熏蒸30 d后再敞氣30 d才可移栽作物，本文考察了120 d時間跨度土壤微生物群落的演替。由圖4可知，隨著時間的推移，氯化苦熏蒸對細(xì)菌多樣性的效應(yīng)值逐步向0靠攏，表明熏蒸抑制效應(yīng)隨時間顯著減弱。相關(guān)性表明細(xì)菌群落多樣性效應(yīng)值與時間成顯著正相關(guān)（R=0.70，p=0.043），表明氯化苦消毒對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)具顯著的時間性。同樣，由圖5可見，氯化苦對真菌多樣性效應(yīng)也隨時間緩慢減弱，但相關(guān)性較弱且無顯著性。

本文收集的文獻(xiàn)中土壤pH從5.4～7.6，包括了酸性、中性和弱堿性土壤。相關(guān)性結(jié)果表明（圖4～圖5），氯化苦對細(xì)菌群落多樣性抑制效應(yīng)隨著pH升高而增加，真菌群落多樣性抑制效應(yīng)隨著pH升高而降低，表明弱堿性條件下增加了氯化苦對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)，減少了對真菌群落的抑制效應(yīng)。

2.4 討論

本文中熏蒸劑的用量分別為氯化苦11～123 g/m2、乙蒜素10～105 g/m2、棉隆40～90 g/m2、二甲基二硫60～80 g/m2、異硫氰酸烯丙酯10～80 g/m2、1、3-二氯丙烯20～44 g/m2，各藥劑用量均涵蓋了其田間常規(guī)和高低劑量[20-23]。Meta分析結(jié)果表明：

（1）氯化苦熏蒸對土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性均產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)，細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，這與前期的研究結(jié)果一致。Li等[24-25]采用宏基因組測序手段，發(fā)現(xiàn)氯化苦熏蒸之后，細(xì)菌群落多樣性顯著下降，群落組成在屬水平和OTU水平發(fā)生顯著改變；Ibekwe等[26]發(fā)現(xiàn)氯化苦對土壤微生物群落的影響作用能持續(xù)到第8周，其作用強度弱于溴甲烷，但強于1,3-二氯丙烯，同時，氯化苦熏蒸后土壤某些物種的豐度也顯著增加，如熏蒸10 d后土壤中好氧性革蘭氏陰性菌數(shù)量增加10倍，假單胞菌Pseudomonas生物量增加70%以上，而Pseudomonas正是降解氯化苦的主要微生物[19]。

（2）異硫氰酸烯丙酯對細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)，對真菌具有刺激效應(yīng)。Zhu等[14]研究認(rèn)為，異硫氰酸烯丙酯熏蒸暫時降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性，但長期刺激了真菌群落的多樣性，顯著改變了真菌群落結(jié)構(gòu)；同時，異硫氰酸烯丙酯熏蒸后顯著促進(jìn)了植物益生菌如Sphingomonas、Streptomyces、Hypocreales、Acremonium、Aspergillus、Pseudallescheria等的相對豐度[14,27]。熏蒸后微生物群落的重建為植物及其有益菌群之間的潛在相互作用提供了重要信息，通過調(diào)控真菌群落種間關(guān)系可以強化優(yōu)勢菌對潛在病原真菌的拮抗作用，進(jìn)而提高對土傳病害的抑制效果。

（3）棉隆對細(xì)菌和真菌群落多樣性無顯著影響，但顯著改變了細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，刺激了Firmicutes 和Actinobacteria 門水平的生長而抑制Proteobacteria和Planctomycetes豐度，對真菌群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。Chen等[28-31]研究表明，棉隆熏蒸后土壤優(yōu)勢菌門發(fā)生變化，細(xì)菌多樣性明顯下降。不同物種對棉隆耐受性不同，如部分細(xì)菌經(jīng)2 000 mg/kg棉隆處理后仍可存活；而經(jīng)100 mg/kg棉隆處理后的土壤真菌只有木霉菌存活，但該劑量下病原菌均被殺滅；線蟲對棉隆具較高的抗性[32]。土壤生物對棉隆的敏感性因物種而異，有耐受性的生物可能會進(jìn)行再定殖。Yakabe等[33]認(rèn)為，棉隆熏蒸后可以顯著減少根癌農(nóng)桿菌和疫霉菌種群數(shù)量，且熏蒸后的土壤更利于病原菌或有益菌的定植。

（4）1,3-二氯丙烯對細(xì)菌群落多樣性無顯著影響，但增加了真菌群落的多樣性，改變了細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。Liu等[34]研究表明，1,3-二氯丙烯對土壤細(xì)菌群落有短暫的抑制效應(yīng)，但該抑制效應(yīng)很快消失，細(xì)菌豐度在后期逐漸恢復(fù)。對30 cm和60 cm土層研究發(fā)現(xiàn)，1,3-二氯丙烯熏蒸對不同深度土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的總體影響很小[4]，可能是因為試驗所用熏蒸劑用量較低（14 g/m2）。1,3-二氯丙烯熏蒸短期內(nèi)引起了直接參與氮循環(huán)的微生物種類組成和數(shù)量發(fā)生顯著變化，如降低了酸性紅壤和堿性潮土中涉及固氮、硝化和反硝化的11個功能基因的豐度，且含有nifH、nxrB、napA和qnorB基因的微生物對1,3-二氯丙烯熏蒸較為敏感，但所有功能微生物在24～59 d孵育階段均恢復(fù)到未熏蒸水平[35]。

（5）二甲基二硫和乙蒜素對細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)均無顯著影響。二甲基二硫和乙蒜素均為植物源熏蒸劑，具有優(yōu)異的殺線蟲活性[36-37]，相比其他熏蒸劑，對土壤微生物的影響較少。Li等[38]發(fā)現(xiàn)，乙蒜素雖然輕微降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性，但增加了真菌群落的分類多樣性，同時促進(jìn)了部分有益菌如Firmicutes、Steroidobacter和Chytridiomycota的生長。對于功能微生物而言，二甲基二硫?qū)Υ蟛糠值h(huán)基因nifH、AOA、narG、qnorB等無顯著影響[39]。二甲基二硫是目前公認(rèn)的溴甲烷最有潛力的替代品，但目前尚無其對土壤真菌群落的報道。

熏蒸劑對土壤微生物群落的影響程度高度依賴熏蒸劑類別、用量和時間尺度。氯化苦對土壤細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)隨著用量增加而增加，但隨著時間推移顯著減弱。Zhu等[14，39]研究表明，異硫氰酸烯丙酯對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)只持續(xù)24～42 d，之后抑制效應(yīng)消失。棉隆熏蒸短期增加了固氮微生物Rhizobium、反硝化微生物Alcanivorax、Bacillus、Streptomyces等的豐度，但59 d后恢復(fù)至對照水平[40]。熏蒸劑的抑制效應(yīng)或刺激效應(yīng)在熏蒸后期逐步減弱，微生物也逐步恢復(fù)，而且細(xì)菌群落恢復(fù)力快于真菌群落[41]。

3 結(jié)論

氯化苦和異硫氰酸烯丙酯對細(xì)菌群落多樣性產(chǎn)生了顯著的抑制效應(yīng)，乙蒜素、棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫?qū)?xì)菌群落多樣性無顯著影響；對于真菌群落多樣性，只有氯化苦對其有顯著的抑制效應(yīng)。在物種組成方面，除乙蒜素外，其他5種熏蒸劑對細(xì)菌群落同時產(chǎn)生正向刺激和負(fù)向抑制作用，其中氯化苦的影響較其他幾種熏蒸劑影響更顯著。相比于細(xì)菌，熏蒸劑對土壤真菌群落物種組成影響較小，大部分物種在門水平無顯著變化。熏蒸劑用量和采樣時間是影響土壤熏蒸對微生物群落正負(fù)效應(yīng)的最主要因素，抑制效應(yīng)隨著熏蒸劑用量的增加而增加，隨著時間延長而顯著減弱。

土壤消毒技術(shù)是一項涵蓋了多種熏蒸劑的土傳病害防控措施，其對土壤微生物的影響需要具體到特定的熏蒸劑種類，否則容易以偏概全；同時，熏蒸劑用量的大小、取樣時間的長短、土壤特性如酸堿性的差異等因素均顯著影響了熏蒸劑對土壤微生物的作用強度。綜合考慮上述兩點，才能全面而準(zhǔn)確地了解熏蒸劑的土壤微生態(tài)效應(yīng)。