張世豪，那葉馨，東嬌嬌，胡建華，薛金浩，高詩雯，楊柳

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）為莧科植物牛膝（AchyranthesbidentataBl.）的干燥根，味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有填精補(bǔ)髓、益陰活血的功效，是傳統(tǒng)滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)健筋骨的中藥。臨床主要用于治療腰膝骨痛、四肢拘攣、筋骨無力以及痿痹等癥［1-2］。研究表明，牛膝具有多種藥理作用，包括免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗生育、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松和對(duì)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)作用等［3-7］。

炮制可以改變藥性，提升療效，降低毒性。根據(jù)古籍記載，牛膝生用可散瘀血、消腫痛、引血下行，鹽炙后能引藥入腎，增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用。牛膝經(jīng)不同炮制工藝炮制后，化學(xué)成分發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致藥理作用改變?，F(xiàn)代牛膝常用的炮制方法為鹽炙、酒炙、炒炭等，如炮制后酒牛膝可增強(qiáng)活血通絡(luò)作用；鹽牛膝能引藥下行入腎，發(fā)揮補(bǔ)腎養(yǎng)精作用；牛膝炭主要發(fā)揮止血之功。2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)于鹽炙藥材的描述均是加入定量食鹽（藥材100 g，鹽2 g），文火加熱，炒干。但牛膝鹽炙工藝的參數(shù)還不完善，加鹽量沒有針對(duì)性，炒制溫度和時(shí)間也不統(tǒng)一，使鹽炙品的內(nèi)在質(zhì)量難以得到有效控制，影響其臨床用藥的準(zhǔn)確性，很難將藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其物質(zhì)含量差異進(jìn)行聯(lián)系，也不能為解讀藥效學(xué)差異提供幫助。

道地藥材質(zhì)量與炮制方法密切相關(guān)，牛膝作為我國(guó)臨床常用的大宗藥材之一，建立統(tǒng)一的、質(zhì)量可控的、數(shù)字化炮制標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。因此，以課題組前期確定的牛膝補(bǔ)腎壯骨的有效成分——β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa為評(píng)價(jià)指標(biāo)［8-9］，選取加鹽量、炒制溫度和炒制時(shí)間為考察因素，用單因素和Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法優(yōu)化牛膝的鹽炙工藝。以期能夠得到最佳的炮制工藝，保證牛膝的臨床療效，并為牛膝的規(guī)范化鹽炙提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號(hào)：5289-74-7、34367-04-9、51415-02-2，天津西瑪科技有限公司）；甘草素（IS）（批號(hào)：578-86-9，中國(guó)成都亞德生物科技有限公司）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮（由本實(shí)驗(yàn)室從牛膝中分離純化，并經(jīng)NMR 和MS 譜等數(shù)據(jù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)準(zhǔn)品純度均 ≥ 98%）；牛膝藥材（河南省，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定）。

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析儀（美國(guó)Thermo 公司）；超聲波清洗器（KQ-5000DB，昆山市超聲儀器有限公司）；送風(fēng)定溫干燥箱（WFO-410W，上海愛朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYEL4 OSB-2100，東京愛朗儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（800AD，永康市艾澤拉電器有限公司）；分析天平（NewClassicMF，Mettler Toledo Switzertand 公司）；電熱恒溫水浴鍋（HSS，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。乙腈（Thermo Fisher Scientific）、乙酸（Dikma）均為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃。流動(dòng)相：乙腈（A%）和0.3%乙酸水（V/V，B%）。梯度洗脫條件見表1，總離子流圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 總離子流圖

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

配備有電噴霧離子源的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，在SRM 模式下進(jìn)行負(fù)離子掃描。噴射電壓：-3 000 V；鞘氣：30 Arb；輔助氣：10 Arb；離子傳輸管溫度：325 ℃；蒸發(fā)器溫度：350 ℃；輔助器：2 L/min；全程通入氮?dú)狻? 種有效成分及內(nèi)標(biāo)化合物的檢測(cè)離子對(duì)及其質(zhì)譜參數(shù)見表2；5 種有效成分的代表質(zhì)譜圖見圖2。

表2 5種有效成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

圖2 有效成分的代表質(zhì)譜圖

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取5種有效成分適量，配置成混合對(duì)照品溶液。各成分的濃度分別為：β-蛻皮甾酮0.989 0 mg/mL、25R-牛膝甾酮0.981 0 mg/mL、25S-牛膝甾酮1.102 0 mg/mL、人參皂苷R00.997 0 mg/mL 以及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.976 0 mg/mL。

2.1.4 供試品溶液的制備牛膝樣品均粉碎并篩分（60目）。取0.5 g樣品于燒瓶中，浸泡于50 mL 50%的甲醇溶劑中，然后在40 ℃水浴中超聲60 min，得供試品溶液，4 ℃保存待測(cè)。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（x），以對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999 3，這表明5 種有效成分均在其線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。5 種有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果見表3。

表3 5種有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.1.6 系統(tǒng)適應(yīng)性

精密度測(cè)試，精密吸取上述供試品溶液適量，24 h內(nèi)連續(xù)測(cè)6 次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果表明各有效成分的精密度RSD ＜ 1.32%，表明該方法精密度良好。

重復(fù)性測(cè)試，精密稱取同一批樣品，記錄5 種有效成分的色譜峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD 值，考察方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明各有效成分的重復(fù)性RSD ＜2.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性測(cè)試，取同一批次的供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、32、48 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，考察供試品溶液在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明各有效成分的穩(wěn)定性RSD ＜ 2.56%，表明該樣品48 h內(nèi)在4 ℃下穩(wěn)定。

利用加樣回收率試驗(yàn)對(duì)該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，樣品中加入了已知的低、中、高3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度測(cè)定3 份。日內(nèi)、日間精度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性的結(jié)果見表4。該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 5種有效成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率（%）=（測(cè)定平均值-樣品值）/加入量×100%

2.2 鹽炙工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 炒制時(shí)間的單因素考察

牛膝原藥材切制成7～8 mm 小段，精密稱取6 份，每份100 g，放于保鮮盒中，加入2 g 食鹽配成的鹽水燜潤(rùn)，炒制溫度為100 ℃，炒制時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比是1∶8（g/mL），提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)2 次的條件下分別進(jìn)樣分析。在炒制溫度和加鹽量一定的條件下，隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過長(zhǎng)的加熱時(shí)間會(huì)導(dǎo)致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當(dāng)炒制時(shí)間為20 min時(shí)，有效成分的含量最高，因此確定最佳炒制時(shí)間為20 min。見圖3。

圖3 不同因素對(duì)鹽炙效果的影響

2.2.2 炒制溫度的單因素考察

2 g 食鹽配成的鹽水燜潤(rùn)，炒制時(shí)間為20 min，炒制溫度分別為80、90、100、110、120 ℃，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2 次的條件下分別進(jìn)樣分析。其中炒制溫度為100 ℃結(jié)果最佳。炒制時(shí)間和加鹽量一定的條件下，隨著炒制溫度的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過高的溫度會(huì)導(dǎo)致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當(dāng)炒制溫度為100 ℃時(shí)，有效成分含量最高，因此確定最佳炒制溫度為100 ℃。見圖3。

2.2.3 加鹽量的單因素考察

加入1%、2%、3%、4%、5%的10 mL 鹽水燜潤(rùn)，炒制時(shí)間為20 min，炒制溫度100 ℃，甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2 次。在炒制時(shí)間和炒制溫度一定的條件下，隨著加鹽量的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，加鹽量為2%時(shí)，有效成分的含量最高，因此確定最佳加鹽量為2%。見圖3。

2.3 鹽炙工藝的響應(yīng)面法

2.3.1 回歸方程的建立及結(jié)果

采用基于Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化牛膝鹽炙工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，鹽炙考察因素設(shè)定為炒制溫度，炒制時(shí)間，加鹽量。根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，每個(gè)因素設(shè)3水平，分別以-1.00，0.00，1.00進(jìn)行編碼。代碼值所代表的實(shí)際操作物理量見表5，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素與水平

表6 鹽炙工藝BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.2 牛膝最佳鹽炙工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.3.2.1 β-蛻皮甾酮

采用Design-Expert 軟件對(duì)牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到β-蛻皮甾酮含量對(duì)加鹽量、炒制時(shí)間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 59.73 +7.74A - 3.21B + 0.54C - 1.26AB + 0.94AC - 0.12BC -19.49A2- 8.31B2- 0.38C2。方差分析結(jié)果見表7，模型決定系數(shù)R2= 0.957 6，表明該模型對(duì)實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是17.57和0.000 5，表明β-蛻皮甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對(duì)β-蛻皮甾酮含量影響較大。

表7 β-蛻皮甾酮方差分析

2.3.2.2 25R-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對(duì)牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到25R-牛膝甾酮含量對(duì)加鹽量、炒制時(shí)間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 2.09 +0.2A - 0.16B + 0.001 6C + 0.17AB - 0.038AC -0.006 3BC - 0.31A2- 0.12B2+ 0.096C2。方差分析結(jié)果見表8，模型決定系數(shù)R2= 0.916 8，表明該模型對(duì)實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是8.57和0.004 9，表明25R-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB值最大，說明加鹽量和炒制溫度對(duì)25R-牛膝甾酮含量影響較大。

2.3.2.3 25S-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對(duì)牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到25S-牛膝甾酮含量對(duì)加鹽量、炒制時(shí)間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 3.06 +0.36A - 0.16B + 0.059C + 0.091AB - 0.16AC -0.33BC - 0.49A2- 0.74B2- 0.29C2。方差分析結(jié)果見表9，模型決定系數(shù)R2= 0.944 9，表明該模型對(duì)實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是13.34 和0.001 3，表明25S-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，BC 值最大，說明炒制溫度和炒制時(shí)間對(duì)25S-牛膝甾酮含量影響較大。

表9 25S-牛膝甾酮方差分析

2.3.2.4 人參皂苷R0

采用Design-Expert軟件對(duì)牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到人參皂苷R0含量對(duì)加鹽量、炒制時(shí)間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 6.55 + 0.21A +0.2B + 0.043C - 0.013AB + 0.23AC + 0.009 5BC -2.08A2- 1.62B2- 1.42C2。方差分析結(jié)果見表10，模型決定系數(shù)R2= 0.978 2，表明該模型對(duì)實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是34.82 和＜ 0.000 1，表明人參皂苷R0擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AC 值最大，說明加鹽量和炒制時(shí)間對(duì)人參皂苷R0含量影響較大。

表10 人參皂苷R0方差分析

2.3.2.5 竹節(jié)參皂苷Ⅳa

采用Design-Expert 軟件對(duì)牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到竹節(jié)參皂苷Ⅳa 含量對(duì)加鹽量、炒制時(shí)間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 12.66 +1.02A - 0.59B + 0.035C - 0.56AB - 0.11AC + 0.29BC -2.92A2- 1.62B2- 0.19C2。方差分析結(jié)果見表11，模型決定系數(shù)R2= 0.970 4，表明該模型對(duì)實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是25.46和0.000 2，表明竹節(jié)參皂苷Ⅳa擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對(duì)竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量影響較大。

表11 竹節(jié)參皂苷Ⅳa方差分析

2.3.3 響應(yīng)面分析因素間的相互作用

加鹽量和炒制時(shí)間的交互作用與五種有效成分含量的關(guān)系的三維曲面圖見圖4。隨著加鹽量和鹽炙時(shí)間逐漸增大，5 種有效成分的含量也逐漸增大；當(dāng)增大到一定水平時(shí)，5 種有效成分的含量卻逐漸下降，說明加鹽量和炒制時(shí)間兩因素的交互作用明顯。當(dāng)加鹽量較大時(shí)，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖5。當(dāng)炒制時(shí)間一定時(shí)，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖6。綜上所述，鹽炙因素對(duì)有效成分的含量的影響由大到小依次為：加鹽量 ＞ 炒制溫度 ＞ 炒制時(shí)間。

圖5 加鹽量和炒制溫度對(duì)有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

圖6 炒制時(shí)間和炒制溫度對(duì)有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

2.4 鹽炙工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合Design-Expert，綜合分析與實(shí)驗(yàn)可操作性等有關(guān)的各因素，分析認(rèn)為最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時(shí)間20 min。采用上述最優(yōu)鹽炙工藝進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)得的主要成分的總含量較高，結(jié)果見表12。說明鹽炙工藝的穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表12 鹽灸工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果/（mg/g）

3 討論

牛膝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效，用于腰膝酸痛、筋骨無力、經(jīng)閉癥瘕、肝陽眩暈等。牛膝中含有皂苷類、甾酮類、多糖類、甜菜堿和多種微量元素等，其中以齊墩果酸型三萜皂苷、蛻皮甾酮和多糖類為其主要活性成分［10］。鹽炙理論雖論述頗多，但仍以“入鹽走腎”的理論為核心，臨床上凡是歸腎經(jīng)的藥物多進(jìn)行鹽炙［11］。歷代中藥鹽炙方法有14 種，分別為鹽水制、鹽水潤(rùn)、鹽水炙、鹽水浸炒、鹽水淹、鹽水炒、鹽水煮、鹽水浸、鹽水拌、鹽水曝干、鹽水煮、鹽水拌炒、鹽水蒸、鹽水拌蒸［12］。現(xiàn)代炮制方法主要以鹽炙、鹽蒸等為主［13］。牛膝經(jīng)鹽炙后能夠增強(qiáng)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效［14］，而藥理研究證實(shí)牛膝中甾酮類物質(zhì)（主要包括β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮等）有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用［15］，牛膝中皂苷類物質(zhì)（主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷R0等）有抑制破骨細(xì)胞以及保護(hù)損傷軟骨細(xì)胞的作用［16-17］，這與鹽牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效相吻合。因此本實(shí)驗(yàn)以課題組前期確定的牛膝補(bǔ)腎壯骨的5 種有效成分——β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮，人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行鹽炙工藝研究。

在炮制工藝設(shè)計(jì)方面，相關(guān)的研究多是采用正交實(shí)驗(yàn)法和Box-Behnken響應(yīng)面法［18-22］。正交實(shí)驗(yàn)同時(shí)考慮幾種相關(guān)因素，尋找最佳因素水平組合，但是不能給出整個(gè)區(qū)域因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確函數(shù)表達(dá)式，從而無法找到最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。而Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)采用多元二次方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題［22］。因此，本研究采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)牛膝的鹽炙工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素及Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法，優(yōu)化牛膝的鹽炙工藝。最終確定牛膝的最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時(shí)間20 min。本文建立的牛膝鹽炙工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有利于提高牛膝鹽炙品的質(zhì)量均一性，保證臨床用藥的有效性，為中藥飲片的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化提供依據(jù)。