崔子璇，高 旭，常 姍，楊曉露，惠 偉

（陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710119）

虎皮病是梨在貯藏中后期極易發(fā)生的一種生理性病害，一般在冷庫中發(fā)病不明顯，出庫后迅速發(fā)病，表現(xiàn)為果皮出現(xiàn)不規(guī)則形的褐色或黑色病斑，但不傷及果肉，一旦發(fā)病則無法補救，可造成嚴重的經(jīng)濟損失。

目前梨虎皮病的發(fā)病機理還沒有完全闡明，普遍認為其虎皮病發(fā)生與α-法尼烯代謝以及活性氧積累密切相關[1-3]。但是，也有研究表明，α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物共軛三烯的含量與虎皮病并不直接相關[4-6]，某些梨品種發(fā)生的虎皮病可能不是由α-法尼烯被氧化引起的[7]。因此，很多研究將重點轉(zhuǎn)向于其下游的氧化產(chǎn)物6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one，MHO）[8-9]。共軛三烯的氧化產(chǎn)物MHO比α-法尼烯和共軛三烯的毒性更強，被認為和虎皮病的發(fā)生密切相關，并且用MHO熏蒸處理梨和蘋果后出現(xiàn)了虎皮病的癥狀[10-11]，但是也有相反結果的報道[12]。有研究發(fā)現(xiàn)果實內(nèi)的H2O2含量高、抗氧化酶活性低導致的抗氧化失衡是虎皮病的誘因[13]。已有的研究認為，在虎皮病果果皮內(nèi)，活性氧清除系統(tǒng)的過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，致使活性氧大量積累，使表皮細胞膜脂過氧化，導致膜結構破壞，進而誘發(fā)虎皮病[14]。果實中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）將酚類物質(zhì)氧化生成醌類物質(zhì)而誘發(fā)褐變，這個過程與虎皮病密切相關[15]。目前，MHO與梨虎皮病發(fā)生和活性氧代謝的關系并不清楚。碭山酥梨是中國栽培面積和產(chǎn)量最大的品種，易感虎皮病，本實驗以碭山酥梨為材料，研究了MHO處理對果皮內(nèi)源MHO含量、抗氧化酶活性、活性氧含量以及虎皮病發(fā)生的影響，以期為虎皮病發(fā)病機制的研究提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碭山酥梨采自陜西省蒲城縣商業(yè)果園，選取成熟度一致、規(guī)格相近、無損傷和病蟲害的果實。果實采收當天運回陜西華圣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團有限公司，貯于（0±0.5）℃冷庫（相對濕度90%～95%）。

MHO標準品 美國Sigma公司；H2O2測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

100 μm厚的PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；6890N氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 MHO處理

內(nèi)源MHO含量伴隨著貯藏期延長不斷增加，虎皮病發(fā)病對外源MHO的敏感性可能不斷增加，因此，冷藏期間每30 d取一次樣，每次取樣后進行MHO處理，參照Ju Zhiguo等[12]的方法稍有改進。每處理組取30 個果實放入30 L的密閉罐中，分別加入盛有7.5、15 mL和30 mL MHO的培養(yǎng)皿，即其處理使用劑量分別為0.25、0.5 mL/L和1.0 mL/L，每處理組重復3 次。20 ℃避光處理48 h后，在25 ℃培養(yǎng)箱里觀察發(fā)病情況，于第7天統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。削取果皮，混勻后測定生理指標。對照組在密封罐中不放置含有MHO試劑的培養(yǎng)皿，其他步驟與MHO處理組操作相同。

1.3.2 虎皮病發(fā)病率測定

發(fā)病率按下式計算：

1.3.3 虎皮病病情指數(shù)測定

參考Zanella[16]的方法，根據(jù)果皮褐變面積所占比例（S）分為4 級，0級：未發(fā)??；1級：0%＜S≤25%；2級：25%＜S≤50%；3級：S＞50%。病情指數(shù)按下式計算：

1.3.4α-法尼烯和共軛三烯含量的測定

參照Anet[17]的方法，并作改進。稱取2 g果皮放入試管，加10 mL正己烷避光浸提2 h。將浸提液過Florisil柱并洗脫定容至5 mL，測232 nm處的OD值，計算α-法尼烯的含量；于281 nm和290 nm處測OD值，計算共軛三烯的含量，單位為nmol/g。

1.3.5 MHO含量的測定

使用固相微萃取-氣相色譜法[18]。將1 g混勻果皮加入15 mL樣品瓶中，加2 mL NaCl溶液（200 g/L）密閉3 h。用老化后的萃取頭萃取20 min后進行氣相色譜分析。進樣口解吸2 min，設置為不分流進樣；柱初溫40 ℃保持2 min后，以50 ℃/min的速率升至250 ℃，運行2 min；用氫離子火焰檢測器，溫度為250 ℃。用外標法定性，單位μL/kg。

1.3.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定

參考Mao Linchun等[19]的方法測定，單位為mmol/g。稱取1 g果皮加入液氮充分研磨后，加入裝有4 mL 10%三氯乙酸溶液的試管中后，充分混勻，于12000 r/min條件下離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液后沸水浴15 min，水浴后冷卻至室溫離心10 min，取上清液，測450、532 nm和600 nm處的吸光度，結果以nmol/g表示。

1.3.7 H2O2含量的測定

參考許婷婷等[20]的方法，稱取2 g果皮，加入適量丙酮作為提取液研磨，于12000 r/min條件下離心20 min，取上清液，加入0.1 mL 10%四氯化碳-鹽酸溶液和0.2 mL濃氨水，向反應所得的沉淀物中加入3 mL 2 mol/L硫酸溶液進行比色測定，單位為mmol/g。

1.3.8 超氧陰離子自由基釋放速率的測定

參考Duan Xuewu等[21]的方法稍作改進測定，取2 g果皮，加15 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液，研勻后4 ℃離心15 min（5000×g）。取0.5 mL上清液，加入1 mL磷酸緩沖液和0.5 mL 10 mmol/L鹽酸羥胺溶液，25 ℃溫育20 min后加入1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸溶液和1 mL 7 mmol/Lα-萘胺溶液，溫育20 min后測530 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算結果，單位為μmol/（min·g）。

1.3.9 CAT活力的測定

使用測試盒測定，根據(jù)說明書稍作修改，取0.1 g果皮，液氮研磨后加入0.9 mL生理鹽水，振蕩渦旋后2500 r/min離心10 min，取上清液0.05 mL，加入1 mL試劑一和0.1 mL試劑二作為測定管，對照管不加上清液，其他操作同測定管。將測定管和對照管在37 ℃水浴1 min后加入試劑三和試劑四終止反應，對照管最后加入0.05 mL上清液。在405 nm處測定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.10 POD活力的測定

參考高俊鳳[22]的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測定，在470 nm處測定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.11 SOD活力的測定參考高俊鳳[22]的方法，采用氮藍四唑法進行測定，在560 nm處測定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.12 總酚含量的測定

參考高俊鳳[22]的方法，取1 g果皮于50 mL錐形瓶中，加25 mL 60%甲醇溶液，55 ℃密封水浴3 h后過濾，以75%甲醇溶液，定容至50 mL。取0.3 mL提取液加1 mL福林-酚試劑、3 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL，室溫靜置2 h后測765 nm處吸光度，單位為mg/g。

1.3.13 PPO活力的測定

使用測試盒測定，根據(jù)說明書稍作修改，取0.1 g果皮加入0.9 mL提取液，4 ℃離心10 min（8000 r/min），取上清液待測。測定管加入150 μL上清液、600 μL試劑二、150 μL試劑三，對照管中將上清液換為同等體積煮沸處理的上清液。37 ℃密封水浴10 min后沸水浴5 min，10000 r/min離心10 min。測定420 nm處吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有測定指標重復3 次，用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.001為差異高度顯著。用Graphpad Prism 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MHO處理誘發(fā)梨果虎皮病的效果

本實驗室前期研究認為，內(nèi)源MHO含量與梨虎皮病關系密切，可能是比共軛三烯更直接的致病因子。圖1為冷藏150 d時從冷庫取出健康果實，分別用0.25、0.5、1.0 mL/L的MHO處理并模擬7 d貨架期的發(fā)病情況。結果表明，果實出庫時（第0天）并未發(fā)病，未處理果實（CK）7 d后發(fā)生了虎皮病，MHO處理果實的發(fā)病情況隨處理濃度的升高而愈發(fā)嚴重。說明外源MHO可以誘發(fā)梨的虎皮病。

圖1 MHO處理對碭山酥梨（150 d）虎皮病的影響Fig.1 Effect of MHO treatment on superficial scald of ‘Dangshansuli’pear fruit (stored for 150 days)

果實冷藏至90、120、150 d和180 d后分別用MHO處理后模擬7 d貨架期，結果如圖2所示，MHO處理組在90 d貨架期時開始發(fā)病，對照組在120 d貨架期才開始發(fā)病，果實發(fā)病率和病情指數(shù)隨著貯藏時間的延長而逐漸升高，MHO處理果實的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著高于對照（P＜0.05），且MHO濃度越高，發(fā)病越嚴重。根據(jù)以上結果初步推測MHO處理加深了碭山酥梨的虎皮病。

圖2 MHO處理對碭山酥梨虎皮病發(fā)病率（A）和病情指數(shù)（B）的影響Fig.2 Effect of MHO treatment on the incidence (A) and disease index (B) of superficial scald in ‘Dangshansuli’ pear fruit

2.2 MHO對梨果皮α-法尼烯代謝的影響

α-法尼烯代謝途徑產(chǎn)物是虎皮病的誘發(fā)因子，共軛三烯是α-法尼烯的自氧化產(chǎn)物，而MHO是共軛三烯的氧化產(chǎn)物，內(nèi)源共軛三烯和MHO都與虎皮病有顯著相關性。由圖3A可知，α-法尼烯含量呈先升后降的趨勢，在冷藏120 d后的貨架期時達到峰值，在貯藏30～180 d時，MHO處理與對照之間差異顯著（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。且在120 d時，1.0 mL/L MHO處理組的α-法尼烯含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖3 MHO處理對碭山酥梨α-法尼烯（A）、共軛三烯（B）和MHO（C）的影響Fig.3 Effect of MHO treatment on contents of α-farnesene (A),conjugated trienes (B) and MHO (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

從圖3B可知，共軛三烯的含量均隨貯藏時間的延長而上升，且以1.0 mL/L MHO處理果內(nèi)源共軛三烯濃度最大，在貯藏期間，1.0 mL/L MHO處理組的共軛三烯含量顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01）。

圖3C表明貯藏期間果皮中的內(nèi)源MHO釋放量依次隨外源濃度的升高而升高，且不同濃度MHO處理后果皮內(nèi)的MHO含量均顯著高于對照組（P＜0.01、P＜0.001），1.0 mL/L MHO處理組具有最大值。

以上結果表明，MHO處理可能通過提高碭山酥梨果皮內(nèi)部的α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量，使果皮的虎皮病加劇。

2.3 MHO對梨果皮MDA、H2O2和超氧陰離子自由基水平的影響

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA含量越高，膜脂過氧化程度越高。由圖4A可知，果皮MDA含量在冷藏前期的貨架期上升較為緩慢，后期迅速升高。對MHO處理果實，貯藏期越長，果皮中積累的MDA越多，并且MHO處理濃度越高，果皮中MDA含量越高。貯藏至180 d時模擬貨架期，對照組的MDA含量達到0.74 mmol/g，而0.25、0.5 mL/L和1.0 mL/L MHO處理的MDA含量分別為0.98、1.05 mmol/g和1.25 mmol/g，且顯著高于對照組（P＜0.01、P＜0.001）。

圖4 MHO處理對碭山酥梨MDA（A）、H2O2（B）和超氧陰離子自由基（C）的影響Fig.4 Effect of MHO treatment on levels of MDA (A),H2O2 (B) and (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

活性氧是植物病害的誘發(fā)因子，其中H2O2和超氧陰離子自由基是果實內(nèi)的主要活性氧形式。如圖4B所示，在整個貯藏過程中，3 個處理組和對照組貨架期果皮中的H2O2含量逐漸升高，與虎皮病發(fā)病趨勢相同。MHO處理顯著提高了果皮內(nèi)的H2O2含量（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），且處理的濃度越高，果皮內(nèi)H2O2含量越高。

如圖4C所示，果皮中超氧陰離子自由基釋放速率也隨著貯藏時間的延長而逐漸升高，碭山酥梨對照組由剛入庫時的0.28 μmol/（min·g），在貯藏180 d時升至0.97 μmol/（min·g）。同時，使用MHO處理后，超氧陰離子自由基釋放速率顯著增加，在貯藏前期顯著高于對照組，且MHO處理的濃度越高，增加越明顯。

綜合膜脂過氧化程度和活性氧指標來看，外源MHO提高了果皮的活性氧水平，加劇了膜脂過氧化，進而誘發(fā)虎皮病。

2.4 MHO對梨果皮抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)主要的活性氧清除系統(tǒng)，CAT、POD、SOD是其重要組分，在活性氧清除過程中發(fā)揮重要作用。

由圖5 A 可知，隨著貯藏時間的延長，果皮內(nèi)的CAT活力先升后降，且在貯藏至120 d后達到峰值（23.37 U/（mg·min））。在MHO處理后，CAT活力均顯著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），處理的MHO濃度越高，CAT活力越低。

圖5 MHO處理對碭山酥梨CAT（A）、POD（B）和SOD（C）活力的影響Fig.5 Effect of MHO treatment on activities of CAT (A),POD (B) and SOD (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

由圖5B可知，隨著貯藏時間的延長，果皮內(nèi)的POD活力先升后降，其活力在貯藏150 d后達到峰值（3.27 U/（mg·min）），1.0 mL/L MHO處理后，POD活力均顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），且處理的MHO濃度越高POD活力越低。

由圖5C可知，隨著貯藏時間的延長，果皮內(nèi)的SOD活力也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在貯藏120 d后達到峰值（32.66 U/（mg·min））。處理的MHO濃度越高，SOD活力越低，且在貯藏后期，1.0 mL/L MHO處理組的SOD活力均顯著低于對照組（P＜0.05、P＜0.01）。

虎皮病的發(fā)生和抗氧化酶系統(tǒng)有著密切聯(lián)系。隨著外源MHO濃度增加，抗氧化酶的活性逐漸降低，說明MHO處理可能通過抑制抗氧化酶的活性，誘發(fā)虎皮病。

2.5 MHO對梨果皮總酚含量和PPO活力的影響

酚類物質(zhì)有著雙重作用，可作為酶促褐變的底物，也可以提高對活性氧的抗性。PPO可將酚類物質(zhì)氧化，是引起果皮褐變的主要酶類，因此果皮中的總酚含量和PPO活力的變化與果皮褐變有緊密的聯(lián)系。

由圖6 A 可知，隨著貯藏時間的延長，對照組果皮總酚含量也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，且在150 d達到峰值。在M H O 處理后，總酚含量均顯著降低（P＜0.01、P＜0.001）。

圖6 MHO處理對碭山酥梨總酚含量（A）和PPO活力（B）的影響Fig.6 Effect of MHO treatment on the total phenol content (A) and PPO activity (B) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

由圖6B可知，在冷藏90 d后果皮PPO活力快速升高，120 d出現(xiàn)一個峰值，冷藏0、120、150 d和180 d的果實經(jīng)MHO處理后，PPO活力均升高。

以上結果表明，外源MHO可能通過降低總酚含量，降低果皮的抗氧化能力，同時增強了PPO的活力，加劇了果皮褐變。

2.6 果皮MHO釋放量與活性氧相關指標的相關性

由表1可知，碭山酥梨果皮內(nèi)MHO含量與MDA、H2O2和超氧陰離子自由基極顯著正相關（P＜0.01），與CAT、POD和SOD活力顯著負相關（P＜0.05），與PPO活力顯著正相關（P＜0.05）。表明MHO含量與活性氧代謝密切相關，也可能通過活化PPO誘導虎皮病。

表1 碭山酥梨MHO與活性氧相關指標的相關性Table 1 Pearson correlation between MHO and other ROS related indicators in ‘Dangshansuli’ pear fruit

2.7 果皮MHO、H2O2與虎皮病的相關性

目前普遍認為，內(nèi)源H2O2與虎皮病發(fā)生相關性最高，因此，分析其與發(fā)病率和病情指數(shù)的相關性，與MHO對比見表2，MHO與碭山酥梨發(fā)病率及病情指數(shù)均極顯著正相關（P＜0.01），而H2O2與發(fā)病率及病情指數(shù)均呈顯著正相關（P＜0.05）。因此，MHO與虎皮病的相關性更高。

表2 碭山酥梨MHO、H2O2與虎皮病的相關性Table 2 Pearson correlation between levels of MHO and H2O2 and superficial scald in ‘Dangshansuli’ pear fruit

3 討論

虎皮病是梨在冷藏的中后期極易發(fā)生的生理性病害，盡管黑褐色的病斑不深入果肉，但果肉風味劣變，嚴重影響果品的外觀品質(zhì)，使其失去商品價值，給果農(nóng)、客商及貯藏企業(yè)帶來嚴重的損失。本研究用MHO熏蒸的方式處理碭山酥梨，結果發(fā)現(xiàn)MHO可誘導果皮褐變，并且與自然狀態(tài)下的虎皮病癥狀幾乎完全一致（圖1），即MHO可誘發(fā)梨虎皮病，這與以前在蘋果上的研究結果一致[10-11]。

虎皮病的發(fā)生與α-法尼烯代謝關系緊密，有研究發(fā)現(xiàn)其下游的氧化產(chǎn)物MHO也與虎皮病的發(fā)生有一定聯(lián)系[8]。在本研究中，MHO處理后果皮內(nèi)的MHO含量升高，且有濃度效應（圖3C），虎皮病癥狀也加重，且發(fā)病率與MHO呈極顯著正相關（r＝0.998，P＜0.01）（表2）。MHO處理后，果皮α-法尼烯和共軛三烯的含量與對照相比增加（圖3A、B）；而MHO處理能顯著提高虎皮病的發(fā)病率和病情指數(shù)（圖2），這說明與α-法尼烯和共軛三烯相比，MHO與梨虎皮病發(fā)生的關系更為密切。

已有研究表明，虎皮病的發(fā)生與果皮細胞內(nèi)活性氧的積累密切相關[23]。果皮發(fā)生虎皮病時，病果內(nèi)部的抗氧化系統(tǒng)遭到損傷，活性氧大量積累，導致細胞膜受損，進而使原來被分隔開的PPO和酚類物質(zhì)發(fā)生接觸，最終酚類物質(zhì)被氧化成了黑褐色的醌類物質(zhì)，導致果皮褐變或變黑[15,24-26]。研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT和POD與虎皮病的發(fā)生密切相關[27-29]。在本研究中，MHO處理均顯著降低了CAT、POD和SOD活力（圖5）。表1的相關性分析也顯示，梨果皮的MHO含量與這3 種酶活力呈負相關，這說明MHO誘發(fā)虎皮病可能通過損傷細胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)。

本實驗結果也顯示，H2O2與虎皮病的發(fā)生有顯著性關性，但MHO含量與虎皮病發(fā)生的相關性高于H2O2（表2）?？梢娫诶婊⑵げ〉陌l(fā)病過程中，MHO含量更具有預測發(fā)病的作用，也暗示MHO可能是虎皮病發(fā)病的關聯(lián)性更強的信號。已有的研究認為，活性氧積累與虎皮病的發(fā)生密切相關[13]。因為H2O2是許多植物生理過程中的信號分子，也是誘發(fā)細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的信號[25]，張元湖團隊研究表明，蘋果的虎皮病發(fā)病過程屬于PCD[30]，梨虎皮病部分還鮮見相關報道，也可能涉及PCD。MHO是否通過誘發(fā)H2O2積累或爆發(fā)引發(fā)PCD是值得進一步研究的問題。

目前認為，共軛三烯自氧化形成了MHO[24]，但并不清楚MHO如何引發(fā)虎皮病的。本實驗結果表明，MHO處理顯著增加了果皮H2O2和超氧陰離子自由基的含量（圖4B、C）。而且果皮的MHO含量與H2O2及超氧陰離子自由基的含量呈極顯著正相關（表1），說明MHO可能引起活性氧的積累。

MDA含量代表膜脂過氧化的程度，也是和虎皮病發(fā)病密切相關的指標[27]。Lin Yixiong等[31]認為H2O2導致細胞膜脂過氧化，進而積累MDA。MDA含量也是和虎皮病發(fā)病密切相關性的指標。MHO處理的梨果皮中MDA顯著升高（P＜0.05），說明MHO加速了膜脂過氧化的過程。而且，實驗結果表明MHO處理也顯著增加了PPO活力（圖6B），PPO活力也與果皮MHO含量呈顯著相關（表1），和MDA積累一樣，這些可能都是活性氧積累的伴隨反應。

綜上所述，推斷碭山酥梨虎皮病發(fā)病過程如下：在冷藏過程中，果皮細胞積累了大量的MHO，MHO打破了果皮細胞內(nèi)正常的氧化還原平衡，破壞了細胞自身的抗氧化系統(tǒng)，從而導致細胞內(nèi)活性氧大量積累，活性氧造成了果皮細胞膜脂過氧化，破壞了細胞膜結構，進而使原來被分隔開的PPO和酚類物質(zhì)接觸，并使PPO活性升高，最終酚類物質(zhì)被氧化成了黑褐色的醌類物質(zhì)，導致果皮褐變，也可能MHO誘導的活性氧爆發(fā)引發(fā)的PCD，從而誘發(fā)了虎皮病，其中的分子機制還需要進一步深入研究。本研究結果顯示，MHO可以作為預測虎皮病發(fā)病的信號分子，可為梨虎皮病的研究提供參考。