管夢迪，鄭亞茹，楊柱林，李慧敏，婁華橋，楊玉冰，李佳梅，易倫朝，李斯嶼，胡永丹，任達(dá)兵

（昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500）

茶是中國特色經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物之一，是世界上最古老、消費(fèi)最多的飲料之一。茶葉含有豐富的化學(xué)成分，許多研究已經(jīng)表明這些成分不僅對茶葉的風(fēng)味具有重要作用，而且具有非常明顯的生物活性[1-3]。2022年全國干毛茶總產(chǎn)量為335萬 t，茶葉加工過程中，不可避免地會產(chǎn)生副產(chǎn)物。例如，普洱生茶加工中產(chǎn)生的茶渣，據(jù)統(tǒng)計(jì)每生產(chǎn)1 t成品茶就會產(chǎn)生20～30 kg干茶副產(chǎn)物[4]。

研究表明，茶葉中含有兒茶素、酚酸、黃酮、有機(jī)酸、氨基酸、生物堿、核苷酸等豐富的化學(xué)成分[5-6]。相比之下，茶葉副產(chǎn)物中這些成分的組成和含量尚不完全清晰。對茶葉及其副產(chǎn)物中多類化學(xué)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析有助于全面認(rèn)識茶葉副產(chǎn)物的化學(xué)成分組成，為茶葉副產(chǎn)物的綜合利用提供數(shù)據(jù)。目前，常用的定量分析技術(shù)有光譜法、色譜法、電化學(xué)法、質(zhì)譜法等[7-9]。上述分析技術(shù)中，質(zhì)譜技術(shù)具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，能夠同時(shí)分析多個(gè)化學(xué)成分（＞100），目前已被廣泛應(yīng)用于茶葉的物質(zhì)定量分析檢測[10]。超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS/MS）技術(shù)具有定量準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于多類成分及低含量成分的準(zhǔn)確定量分析[11-13]。Panyatip[14]、Kikkawa[15]、Wang Dan[16]等利用UPLC-QQQ-MS/MS技術(shù)分別對茶葉中酚類、兒茶素、氨基酸、生物堿、核苷酸進(jìn)行了檢測。

選擇恰當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行提取是茶葉化學(xué)成分定量分析的必要步驟。目前，研究人員主要使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿作為提取溶劑[17-20]。然而，茶葉的化學(xué)成分存在結(jié)構(gòu)多樣、極性差異大和濃度范圍廣的特點(diǎn)，上述溶劑在同時(shí)高效提取多類具有不同性質(zhì)的成分方面存在不足[21]。甘油具有低毒、難揮發(fā)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特性，符合理想綠色溶劑的大部分要求，已經(jīng)在化妝品工業(yè)、食品工業(yè)中獲得廣泛應(yīng)用[22]。甘油屬于天然堿性化學(xué)物質(zhì)，具有多羥基結(jié)構(gòu)和較低的介電常數(shù)，可以改變水的介電常數(shù)，它的水溶液對酚類、鞣質(zhì)類物質(zhì)的溶解度較高[23-24]。目前，甘油在提取枸杞[25]、蘆筍[26]、秈米葉[27]中的黃酮、酚類物質(zhì)方面已顯現(xiàn)出比甲醇、乙醇更好的性能。因此，甘油有望替代甲醇等傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，實(shí)現(xiàn)茶葉中多類化學(xué)成分的同時(shí)有效提取。

本研究利用甘油結(jié)合超聲法提取茶葉及其副產(chǎn)物中的化學(xué)物質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件，探究甘油對茶葉中多類化合物的提取效率。優(yōu)化建立色譜-質(zhì)譜檢測方法（如洗脫梯度、流動相組成、色譜柱等），以實(shí)現(xiàn)茶葉中酚類、黃酮類、氨基酸、生物堿、兒茶素等多類化學(xué)成分的準(zhǔn)確定量分析。通過方法學(xué)驗(yàn)證考察所建方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，并將所建方法應(yīng)用于實(shí)際的茶葉及副產(chǎn)物樣本，研究茶葉副產(chǎn)物中化學(xué)成分的組成和含量，為茶葉副產(chǎn)物的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品依托當(dāng)?shù)夭枞~生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行加工和收集，包括普洱生茶、黃片和副產(chǎn)物（茶渣）。茶葉樣本經(jīng)干燥后粉碎，過60 目篩，放在密封袋中，保存在-20 ℃冰箱。

甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇（均為色譜級），甲酸（質(zhì)譜級）上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；乙腈（質(zhì)譜級）德國Merck公司；本實(shí)驗(yàn)共用到130 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，購買于由西力生物有限公司、北京伊諾凱有限公司、廈門慧嘉生物科技有限公司、成都曼斯特生物科技有限公司和上海西寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8040 UPLC-QQQ-MS/MS聯(lián)用儀 日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；KQ800 DE 數(shù)控超聲機(jī)昆山生物科技有限公司；MS105DU電子分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16M高速離心機(jī)湘潭湘儀儀器有限公司；倍達(dá)浦超濾型超純水機(jī) 南京權(quán)坤生物科技有限公司；FSJ-A05B1打粉機(jī) 廣東小熊電器有限公司；移液槍 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 提取條件的優(yōu)化

1.3.1.1 樣品溶液的制備

稱取0.5 g茶粉于10 mL離心管中，加入5 mL 70%甘油溶液，渦旋混勻，超聲提取20 min（40 ℃、400 W），提取結(jié)束后離心取上清液，用70%乙腈溶液稀釋50 倍，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。取一定量的稀釋液過0.22 μm有機(jī)濾膜后用于UPLC-QQQ-MS/MS分析。

1.3.1.2 提取試劑的選擇

以甘油、水、甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇和1,4-丁二醇作為提取溶劑。除水外，其余均為70%水溶液，樣品制備同1.3.1.1節(jié)，對比提取效果，選擇一種最佳提取溶劑。

1.3.1.3 單因素試驗(yàn)

分別考察不同提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）、提取時(shí)間（5、10、20、30、40 min）、固液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、溶劑含水量（30%、50%、70%、90%、100%）對待測物的提取效果，計(jì)算待測物提取量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 UPLC-QQQ-MS/MS方法的建立

1.3.2.1 混標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg于2.5 mL小燒杯中，加入適量70%乙腈溶液溶解。將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用70%乙腈溶液定容，獲得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的混標(biāo)儲備液，置于冰箱中避光保存待用。

1.3.2.2 方法參數(shù)的確定

UPLC-QQQ-MS/MS主要由UPLC分離系統(tǒng)和三重四極桿質(zhì)譜檢測系統(tǒng)串聯(lián)組成。其中，UPLC系統(tǒng)包括二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱等模塊。

本研究采用兩根不同的色譜柱對不同類型的成分進(jìn)行分離分析。一方面，采用Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）對兒茶素、酚酸、黃酮進(jìn)行洗脫分離，具體的色譜條件：柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流動相為0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），流速0.2 mL/min，梯度洗脫：0.01～1 min，92%～87% A、8%～13% B；1～2 min，87%～83% A、13%～17% B；2～3 min，83%～80% A、17%～20% B；3～9 min，80%～75% A、20%～25% B；9～10 min，75%～68% A、25%～32% B；10～11 min，68%～50% A、32%～50% B；11～12 min，50%～40% A、50%～60% B；12～14 min，40%～15% A、60%～85% B；14～18 min，15%～92% A、85%～8% B；另一方面，采用色譜柱Hypercarb C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）對生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、核苷及核苷酸等親水性成分進(jìn)行洗脫分離，具體條件為柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL。流動相為0.2%甲酸＋1 mmol/L甲酸銨溶液（A）和乙腈（B），流速0.3 mL/min，梯度洗脫：0～1 min，95%～85% A、5%～15% B；1～3.5 min，85%～75% A、15%～25% B；3.5～4.5 min，75%～65% A、25%～35% B；4.5～6.5 min，65%～60% A、35%～40% B；6.5～7 min，60%～40% A、40%～60% B；7～7.01 min，40%～10% A、60%～90% B；7.01～8 min，10%～5% A、90%～95% B；8～8.5 min，5%～40% A、95%～60% B；8.5～9 min，40%～60% A、60%～40% B；9～9.5 min，60%～95% A、40%～5% B；9.5～12 min，95% A、5% B。

質(zhì)譜條件：干燥氣流速15 L/min，吹掃氣流速3 L/min，接口電壓4.5 kV，CID氣壓230 kPa，離子傳輸管溫度300 ℃，加熱板溫度400 ℃，檢測電壓2.08 kV。此外，采用儀器自帶的軟件對多反應(yīng)監(jiān)測離子對、碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化和選擇。

1.3.2.3 方法學(xué)考察

方法學(xué)考察的內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限、精密度、加標(biāo)回收率以及基質(zhì)效應(yīng)，基于這些指標(biāo)評價(jià)方法的精密度和準(zhǔn)確度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用70%乙腈溶液將標(biāo)準(zhǔn)品的儲備液梯度稀釋，獲得一系列不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液（100～0.01 μg/mL），用定量出的峰面積與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度通過回歸擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測限以及定量限分別以信噪比的3 倍和10 倍進(jìn)行計(jì)算。精密度包括日內(nèi)和日間精密度，選擇高（100 μg/mL）、中（10 μg/mL）、低（0.5 μg/mL）混標(biāo)溶液進(jìn)行測定，分別在1 d內(nèi)完成6 次重復(fù)進(jìn)樣和3 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6 次。測定之后，計(jì)算各成分含量的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），用以表征日內(nèi)和日間精密度。茶葉基質(zhì)較為復(fù)雜，含有茶多酚、生物堿、色素、糖類等多種物質(zhì)，加標(biāo)回收可以表征樣品中的其他成分對目標(biāo)分析物離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響。采用樣品加標(biāo)回收法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，將高（100 μg/mL）、中（10 μg/mL）、低（0.5 μg/mL）3 個(gè)質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液加入茶葉樣品中進(jìn)行檢測。測定加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，然后通過比較實(shí)際質(zhì)量濃度和測定質(zhì)量濃度計(jì)算回收率。溶劑基質(zhì)常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在甘油和乙腈溶液中加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品母液，稀釋相同的倍數(shù)，純?nèi)軇┲蟹治鑫镯憫?yīng)值與樣品基質(zhì)中添加相同含量分析物響應(yīng)值的比值為基質(zhì)效應(yīng)的數(shù)值，評價(jià)甘油溶液對于各類目標(biāo)成分的基質(zhì)效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

UPLC-QQQ-MS/MS 原始數(shù)據(jù)由儀器自帶的Labsolution軟件處理，獲得各個(gè)物質(zhì)的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，獲得各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（mg/mL）。根據(jù)樣品量、稀釋倍數(shù)等一系列數(shù)據(jù)，將質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為茶樣中目標(biāo)物的含量（mg/kg）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取效果比較

選取咖啡因、茶氨酸、沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG）等21 種成分作為代表性物質(zhì)，用于評價(jià)各提取溶劑的性能，這些代表性成分在茶葉中含量較高，包括酚酸類、氨基酸、茶堿、兒茶素等類別。如圖1所示，甲醇、乙醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇以及甘油的提取效果較好，它們對各物質(zhì)提取峰面積總和均高于1.1×108。相比之下，純水的提取效果最差，峰面積總和低于0.6×108，這可能是因?yàn)樗臉O性最大，對中極性物質(zhì)（酚類）的提取效果不好。上述溶劑中，甘油對氨基酸的提取效果最佳，峰面積高達(dá)0.7×108。甘油由于介電常數(shù)較低，對酚類的提取效果也較好。由于甘油的綜合提取性能以及本身的綠色性質(zhì)，最終作為本研究的提取溶劑，實(shí)現(xiàn)一次提取并對多類成分定量分析的目的。

圖1 不同溶劑的茶葉化學(xué)物質(zhì)提取效果比較Fig.1 Comparison of the extraction efficiency of different solvents for the extraction of compounds from tea

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

目前茶葉化合物的提取方法主要有：超聲輔助提取法、熱水浸提法、有機(jī)溶劑萃取法和微波輔助提取法。由于超聲波具有空化作用，有助于植物的細(xì)胞壁破裂，使有效成分高效溶出，超聲輔助提取已被證明可以提高目標(biāo)成分的提取率[28]。影響超聲輔助提取效率的因素包括提取時(shí)間、固液比、溶劑含水量、提取溫度等，本研究通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行考察并優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 單因素對茶葉化學(xué)物質(zhì)提取效果的影響Fig.2 Effect of operating parameters on the extraction efficiency of tea components investigated by single factor experiments

由圖2A可知，隨著超聲時(shí)間的延長，待測物提取率增加，在10～40 min內(nèi)整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。其中，在10 min和40 min時(shí)提取效果最好，總體峰面積超過1×108，且不存在顯著差異。超聲的空化作用以及機(jī)械作用可以加速目標(biāo)物從茶葉中向提取試劑中轉(zhuǎn)移，同時(shí)有可能對目標(biāo)物存在破壞作用[29-30]，所以在20 min時(shí)提取效果僅好于5 min?？紤]到時(shí)間成本，最終確定10 min為最佳提取時(shí)間。

由圖2B可知，固液比的改變對提取效果影響較大。隨著固液比的增大提取效果降低，固液比1∶10時(shí)，提取效果最好，總體峰面積超過1.4×108。茶葉中的化合物在固液比1∶10時(shí)已經(jīng)全部溶出，最終采用固液比1∶10。

由圖2C可知，茶葉目標(biāo)物的提取效果隨著甘油含水量的增加呈先增后降的趨勢。當(dāng)甘油含水量達(dá)到50%時(shí)提取效果最好，總體峰面積超過1.6×108，約是含水量70%（0.976×108）和30%（0.979×108）時(shí)提取峰面積的1.6 倍。甘油與水可以任意比例互溶，加入水后黏度降低，活性物從茶葉轉(zhuǎn)移到提取試劑的阻力變小。當(dāng)含水量高于50%時(shí)，提取試劑極性與目標(biāo)物極性相差較大，提取效果降低。在甘油的存在下水溶液的極性和黏度需要達(dá)到平衡，因此，最終選擇甘油的含水量為50%。

由圖2D可知，超聲提取溫度從30 ℃升高到40 ℃時(shí)，提取效果明顯提高，從40 ℃升高到70 ℃，提取效果先降低后增高。提取溫度為40、60、70 ℃時(shí)，總體峰面積均超過1.4×108，且在40 ℃與60 ℃條件下提取效果沒有明顯差異。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是溫度升高使分子運(yùn)動加速，目標(biāo)物提取率增大，但隨著溫度繼續(xù)升高目標(biāo)物成分受到破壞，使得提取率降低。繼續(xù)升溫，特征物質(zhì)在溶劑中的溶解度增加。從經(jīng)濟(jì)成本看，提取溫度40 ℃效果最佳。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

色譜條件的優(yōu)化主要包括流動相組成、洗脫梯度以及色譜柱的選擇。色譜條件優(yōu)化后可以使目標(biāo)物獲得良好分離，提高定量的準(zhǔn)確性。梯度洗脫可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分實(shí)現(xiàn)良好的分離，確保在較短的時(shí)間內(nèi)樣品中不同極性的組分均能被洗脫出來。

參考課題組前期的研究，本實(shí)驗(yàn)采用Hypersil GOLD C18色譜柱對茶葉中的兒茶素、黃酮和酚酸等酚類物質(zhì)進(jìn)行分離[11]，流動相為0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），對洗脫梯度進(jìn)行微調(diào)，具體見1.3.2.2節(jié)。前期工作中，課題組采用親水作用的Syncronis HILIC色譜柱檢測茶葉中的生物堿、核苷、核苷酸、氨基酸4 類親水性物質(zhì)[16]。親水色譜柱的柱效通常隨流速增大而降低，不利于快速色譜分離，此外該類型色譜柱需要較長的柱平衡時(shí)間。Hypercarb色譜柱是一類采用多孔石墨碳作為填料的C18色譜柱，對極性化合物有較強(qiáng)的保留能力，對結(jié)構(gòu)相近物質(zhì)能很好分離，有較寬的pH值范圍并且高溫條件下仍能保持穩(wěn)定性。因此，本研究選擇Hypercarb C18色譜柱用于有機(jī)酸、生物堿、核苷、核苷酸、氨基酸5 類親水性成分的分離分析，通過條件優(yōu)化，最終確定流動相為0.2%甲酸＋1 mmol/L甲酸銨（A）和乙腈（B），具體的洗脫梯度見1.3.2.2節(jié)。應(yīng)用優(yōu)化的UPLC-QQQ-MS/MS條件，對7 類共130 個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行分離分析，結(jié)果如圖3所示，可以看出這些成分均獲得了良好分離且具有較好的峰形，為準(zhǔn)確定量分析奠定了基礎(chǔ)。

圖3 130 種物質(zhì)總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of 130 substances

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

檢測限、定量限、精密度、加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度以及基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表1、2，7 類化合物均在0.018～96.150 μg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（0.4～12 000 mg/kg，R2≥0.990）。檢測限和定量限分別為0.000 1～4.332 1 mg/kg與0.000 2～12.996 3 mg/kg，表明該方法具有很高的靈敏度。在高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度下，日內(nèi)、日間精密度分別為0.04%～14.94%和0.35%～14.90%，表示儀器穩(wěn)定性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較可靠。目標(biāo)物的加標(biāo)回收率以及RSD分別在80.10%～121.12%和0.26%～25.68%之間，證明該方法準(zhǔn)確度較高?；|(zhì)效應(yīng)在72.00%～118.27%之間，結(jié)果可被接受。以上結(jié)果表明本研究建立的甘油提取結(jié)合UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表1 酚類物質(zhì)UPLC-QQQ-MS/MS方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Analytical figures of merit of UPLC-QQQ-MS/MS for phenolics

2.5 方法的應(yīng)用

將建立的方法應(yīng)用于實(shí)際茶葉樣本及其副產(chǎn)物的化學(xué)成分定量分析，首先采用甘油結(jié)合超聲處理提取多類化學(xué)成分，然后利用驗(yàn)證后的UPLC-QQQ-MS/MS進(jìn)行定量分析。定量結(jié)果如表3所示，共檢測出酚類成分41 種、有機(jī)酸6 種、氨基酸16 種、生物堿1 種、核苷2 種，未檢出的成分可能是未提取到或是其含量低于檢測限。

將各檢測到的化學(xué)成分含量相加，加合總含量如圖4所示?？梢钥闯?，不同樣本的總含量相差較大，在86 622.93～219 652.94 mg/kg范圍內(nèi)。其中，加合總含量最高的樣本分別為普洱生茶6號（219 652.94 mg/kg）、普洱生茶4 號（169741.61 mg/kg）和黃片（151 354.49 mg/kg）。所有樣本中，普洱生茶5號（112 235.94 mg/kg）和茶渣（86 622.93 mg/kg）的加合總含量較低。

圖4 不同茶葉被測物質(zhì)加合總含量比較Fig.4 Comparison of the total contents of all detected compounds in tea samples

定量結(jié)果表明，茶葉及其副產(chǎn)物的樣本中含量較高的化學(xué)成分包括表兒茶素（2 399.42～21 207.83 mg/kg）、表沒食子兒茶素（1 369.47～7 934.14 mg/kg）、表兒茶素沒食子酸酯（5 168.42～26 854.46 mg/kg）、E GCG（6 484.68～28 844.07 mg/kg）、3-沒食子?；鼘幩幔? 230.36～15 722.18 mg/kg）、茶氨酸（5901.84～14458.35 mg/kg）、咖啡因（6506.29～12017.14 mg/kg）、奎寧酸（5 649.48～29 529.46 mg/kg）。具體含量對比如圖5所示，黃片和茶渣中的化學(xué)成分比較豐富。例如，茶渣中上述物質(zhì)總含量較低，但是其咖啡因含量（9 969.66 mg/kg）僅次于普洱生茶7號（12 017.14 mg/kg）?？Х纫蚴遣枞~中提供苦澀味的主要物質(zhì)之一，對人體具有一定的促興奮作用，還具有一定的藥理功能。普洱生茶3、6、7、8號以及黃片的茶氨酸含量均大于13 000 mg/kg，說明茶氨酸是普洱生茶及其副產(chǎn)物中含量最高的氨基酸，茶氨酸約占茶葉氨基酸總量50%～60%，具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味物質(zhì)。氨基酸成分中除茶氨酸外，精氨酸（1 114.87～3 679.68 mg/kg）、天冬氨酸（1344.32～3459.21 mg/kg）、谷氨酰胺（796.21～1653.41 mg/kg）、天冬酰胺（401.38～1938.94 mg/kg）和谷氨酸（2 387.83～6 554.72 mg/kg）的含量也較高。兒茶素類化合物是茶葉中的主要功能成分，占茶葉干質(zhì)量的12%～24%，是茶湯苦澀味的呈味物質(zhì)和茶湯的呈色物質(zhì)。普洱生茶2、3、4、6號總兒茶素含量超過60 000 mg/kg，普洱生茶1、5、7、8號和黃片總兒茶素含量介于40 000～60 000 mg/kg之間，茶渣含量為15 830.05 mg/kg。

圖5 不同種類茶葉主要化學(xué)成分的含量Fig.5 Contents of major chemical components detected in different types of tea

黃片是指加工過程中外觀不滿足生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，而被人工剔除用于其他生產(chǎn)的茶箐。本研究的結(jié)果表明，黃片中化學(xué)成分的含量與正常茶葉樣本相當(dāng)，如其EGCG、咖啡因、茶氨酸的含量分別為18 806.25、9 969.66 mg/kg和14 458.35 mg/kg，甚至高于某些正常茶葉樣本的含量。茶渣是茶葉加工中產(chǎn)生的另一類主要副產(chǎn)物，包括挑揀剩下的茶末、茶梗。定量結(jié)果表明茶渣中含量較高的化學(xué)成分包括表兒茶素（2 399.42 mg/kg）、表沒食子兒茶素（1 369.47 mg/kg）、表兒茶素沒食子酸酯（5 168.42 mg/kg）、EGCG（6 484.68 mg/kg）、3-沒食子?；鼘幩幔? 230.36 mg/kg）、木犀草素（44.91 mg/kg）、精氨酸（1 163.86 mg/kg）、天冬氨酸（1 374.07 mg/kg）、茶氨酸（5 901.84 mg/kg）、咖啡因（9 969.66 mg/kg）、奎寧酸（12 322.43 mg/kg）、乳酸（10 107.8 mg/kg）和草酸（7 542.81 mg/kg）。因此，茶渣作為茶葉加工的副產(chǎn)物，同樣含有豐富的生物活性成分，存在進(jìn)一步利用的價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究建立了一種以甘油為溶劑的超聲輔助提取方法，可以同時(shí)高效提取茶葉中的多類化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化建立了茶葉中7 類共130 種化學(xué)成分的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法。方法學(xué)考察結(jié)果表明所建立方法具有良好的線性關(guān)系（0.4～12 000 mg/kg，R2≥0.990）、檢測限（0.000 1～4.332 1 mg/kg）、定量限（0.000 2～12.996 3 mg/kg）、日內(nèi)精密度（0.04%～14.94%）、日間精密度（0.35%～14.90%）、加標(biāo)回收率（80.10%～121.12%）、RSD（0.26%～25.68%）。此外，基質(zhì)效應(yīng)為70.70%～118.27%。以上結(jié)果表明所建方法具有良好的線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度?；谒⒌姆椒?，成功測定了普洱生茶及其加工副產(chǎn)物中各類化學(xué)成分的準(zhǔn)確含量，結(jié)果表明茶葉副產(chǎn)物同樣含有豐富的化學(xué)成分，尤其是兒茶素、咖啡因、茶氨酸等主要成分。雖然甘油適用于茶葉化合物的綠色提取，但是甘油黏性較大，一般使用其水溶液。本研究為茶葉化學(xué)成分提取提供了思路，且進(jìn)一步探索了茶葉副產(chǎn)物中這些成分的組成和含量。