陳煒莉，貝 翎，楊 揚，王璧瑩，李家旭，闞緒甜，李文治，杜 冰,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極（中國）有限公司研發(fā)中心，廣東 廣州 510623）

衰老是以細胞、組織、器官功能進行性喪失為特征的自然生命過程，隨著衰老程度的加劇，機體細胞壽命機制的有效性降低，使得衰老成為許多疾病的主要風險因素，包括心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等[1]。當前，科學界提出關(guān)于衰老機制的理論有自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說、遺傳程序?qū)W說等，其中自由基學說是目前研究和接受最廣泛的學說[1-2]。自由基學說是指細胞有氧代謝時，自由基水平升高或抗氧化劑缺乏導致機體抗氧化能力降低，細胞毒性增強，并最終導致細胞膜、氨基酸鏈和DNA的分子結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)地受損，從而使機體老化[3]。因此，隨著世界人口老齡化加快，抗氧化與抗衰老相關(guān)研究已成為當前的研究熱點之一。

研究表明，過量的D-半乳糖會在體內(nèi)積聚，在半乳糖氧化酶的作用下，可產(chǎn)生己醛糖和過氧化氫，促進氧自由基和超氧陰離子的產(chǎn)生，破壞大分子和細胞功能[4]；由于D-半乳糖誘導的小鼠衰老模型具有與正常衰老小鼠相似的癥狀，被廣泛用于衰老機制的研究和抗衰老藥物的篩選[5]。氧化應(yīng)激和炎癥是衰老的主要特征，許多研究表明，核因子-E2-相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最強大的抗氧化應(yīng)激途徑，在正常生理條件下，Nrf2以非活性形式存在于細胞中，而在氧化應(yīng)激條件下，激活的Nrf2從細胞質(zhì)進入細胞核，通過抗氧化元件反應(yīng)（antioxidant response element，ARE）誘導特定基因的表達，從而調(diào)節(jié)II相抗氧化酶，如醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，NQO1）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等基因的表達，減輕氧化應(yīng)激及炎癥引發(fā)的機體損傷[4,6]。

長期以來，人們都用維生素來抵抗自由基的破壞，VE（生育酚）作為一種脂溶性維生素，具有抗氧化功能，可以保護細胞免受氧化損傷[7-8]。劉思彤等[9]的研究表明大豆異黃酮與VE對衰老模型小鼠肝組織病變都有減輕作用，且VE抗氧化能力比大豆異黃酮更強。Rattanawiwatpong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，含VC、VE及樹莓葉細胞培養(yǎng)提取物的血清能改善大部分皮膚老化現(xiàn)象（如皺紋、彈性低等）。VE可以被修飾成酯的形式，生育酚醋酸酯是一種比游離的VE更穩(wěn)定的抗氧化性化合物，便于VE制品的貯存、運輸?shù)龋悄壳吧a(chǎn)中常用的VE酯化衍生物之一[7,11-12]。在生育酚醋酸酯的衍生物中，D-α-生育酚醋酸酯屬于天然形式，DL-α-生育酚醋酸酯屬于合成形式。Yasin等[13]研究表明，在肉雞中投喂適量α-生育酚醋酸酯能顯著增加肌肉氧化穩(wěn)定性和減少脂肪沉積，從而達到增強雞肉氧化穩(wěn)定性的目的。

因此，本研究將探究兩種生育酚醋酸酯的體外抗氧化作用，并基于衰老模型，對比兩者體內(nèi)抗氧化及抗衰老作用，以期為尋找抗衰老物質(zhì)提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SPF級C57BL/6小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2021-0041。

D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯由無極限（中國）有限公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（astaxanthin，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一天平 上海舍巖儀器有限公司；ANKE TDL-5-A型離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Labserv K3酶標儀、PIKOREAL96熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；H1650R臺式冷凍離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；BioPrep-24生物樣品均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司；DYY-6C電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外抗氧化活性測定

1.3.1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

參照楊斯惠等[14]的方法并略作改動，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣液于離心管中，分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，充分搖勻，暗反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比溶液調(diào)零，在517 nm波長處用酶標儀測定吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。DPPH自由基清除能力按公式（1）計算：

式中：A2為樣品的吸光度；A1為用無水乙醇替代DPPH溶液的對照組吸光度；A0用無水乙醇代替生育酚酯衍生物樣品溶液的空白組吸光度。

1.3.1.2 羥自由基清除能力測定

參照王鈺等[15]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在510 nm波長處用酶標儀測其吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.1.3 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

參照蔣海艷等[16]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在734 nm波長處用酶標儀測定其吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.1.4 Fe2＋螯合能力測定

參照王肖行等[17]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在562 nm波長處用酶標儀測定其吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.1.5 總還原能力測定

參考王兵亞等[18]的方法并做改動。將樣品用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和質(zhì)量分數(shù)為5%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，搖勻后于50 ℃下水浴20 min，再加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分搖勻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液2.5 mL，加入等體積的蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的FeCl3溶液，搖勻后靜置10 min，在700 nm波長處用酶標儀測其吸光度，每個樣品重復(fù)3 次?？傔€原能力按公式（2）計算：

式中：R為總還原能力；A1為樣品溶液吸光度；A0為用無水乙醇替代樣品稀釋液作為空白對照測其吸光度。

1.3.2 衰老模型抗氧化及抗衰老作用分析

1.3.2.1 衰老模型建立及干預(yù)

參考Lei Shuwen等[19]的方法，72 只SPF級雄性小鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分成6 組，每組12 只，分別為正常對照組（N C 組）、衰老模型組（S L M組）、DL-α-生育酚醋酸酯組（VEH組）、D-α-生育酚醋酸酯低劑量組（VECL組）、D-α-生育酚醋酸酯中劑量組（VECM組）、D-α-生育酚醋酸酯高劑量組（VECH組）。其中，除了NC組在頸背皮下注射0.9%生理鹽水（0.1 mL/10 gmb）外，其余各組每日皮下注射300 mg/kgmb的D-半乳糖（0.1 mL/10 gmb）進行造模，同時VEH、VECL、VECM、VECH組每日經(jīng)口給予生育酚酯衍生物的灌胃劑量分別為10、10、50、100 mg/kgmb，根據(jù)體質(zhì)量計算給藥體積（0.1 mL/10 gmb），持續(xù)42 d。

1.3.2.2 樣品收集

實驗結(jié)束后，小鼠禁食12 h，摘出眼球，用離心管收集血液，將采集的血于37 ℃孵育1 h后置于4 ℃冰箱過夜，4 000 r/min離心15 min后，取上清液即為血清。采血后，立即將小鼠頸椎脫臼處死，快速取出肝臟，并用預(yù)冷的生理鹽水洗去血液，濾紙吸干表面水分后凍存待用。

1.3.2.3 抗氧化指標測定

按照相應(yīng)試劑盒說明書分別測定血清中GSH-Px活力、T-AOC及MDA生成量。

1.3.2.4 血清炎癥因子測定

按照相應(yīng)試劑盒說明書分別測定IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2.5 肝功能指標測定

根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書分別測定肝功能指標血清AST、ALT水平。

1.3.2.6 Nrf2通路的mRNA表達水平分析

參考周意等[20]的方法，取0.02 g肝臟組織，利用TRIzol法提取肝臟組織總RNA，以肝臟組織總mRNA為模板，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后采用SYRB熒光定量PCR試劑盒檢測Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對表達量，PCR引物由北京擎科有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.2.7 Nrf2通路的蛋白表達水平分析

取0.025 g肝臟組織放入預(yù)冷緩沖液清洗，加入300 μL的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為提取的全蛋白。取120 μL蛋白上清液，加入30 μL 5×loading buffer混勻，沸水浴5 min，放入冰盒中速冷備用；根據(jù)蛋白定量結(jié)果，上樣20 μL蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉。加入稀釋后的Nrf2（1∶1 000）、NQO-1（1∶5 000）、HO-1（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）抗體，室溫放置60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min。加入稀釋后的二抗（1∶5 000），室溫孵育90 min，顯影，在凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 9軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，采用單因素方差分析，P＜0.05，差異顯著，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力常作為評價和尋找新的抗氧化物質(zhì)的指標之一[21]。由圖1A可知，當質(zhì)量濃度大于0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物與VC的DPPH自由基清除能力接近。

圖1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力Fig.1 In vitro antioxidant capacity of two tocopherol ester derivatives

2.1.2 羥自由基清除能力

羥自由基為氧化能力極強的活性氧，羥自由基清除能力越大，表明抗氧化能力越強[22]。如圖1B所示，質(zhì)量濃度在0.1～0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物的羥自由基清除能力大于相同質(zhì)量濃度的VC。當質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，羥自由基清除能力依次為VC＞DL-α-生育酚醋酸酯＞D-α-生育酚醋酸酯。

2.1.3 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS陽離子自由基清除能力可以用于評價極性和非極性樣品的抗氧化性[23]。如圖1C所示，當質(zhì)量濃度為0.1～0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物的ABTS陽離子自由基清除能力高于相同質(zhì)量濃度的VC，但當質(zhì)量濃度為0.4～0.5 mg/mL時，三者清除能力接近。

2.1.4 Fe2＋螯合能力

抗氧化物螯合金屬離子被公認為清除羥自由基的最佳途徑，F(xiàn)e2＋能誘導超氧陰離子生成對人體有害的羥自由基[24]。在0.1～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩種生育酚酯衍生物的Fe2＋螯合能力顯著高于VC；D-α-生育酚醋酸酯在0.2 mg/mL時Fe2＋螯合能力最強，為95.98%；DL-α-生育酚醋酸酯在0.3 mg/mL時Fe2＋螯合能力最強，為88.78%。

2.1.5 總還原能力

抗氧化化合物利用本身還原作用給電子，從而清除自由基，總還原能力越強說明該物質(zhì)抗氧化能力越強[17]。由圖1E可知，質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物還原能力高于相同質(zhì)量濃度下VC的還原能力，且隨著質(zhì)量濃度的提高，三者還原能力增加，呈現(xiàn)出一定的線性增長關(guān)系。

5 種體外抗氧化能力指標分析結(jié)果說明兩種生育酚酯衍生物有相似的抗氧化能力，在0.1～0.3 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者的羥自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、Fe2＋螯合能力和總還原能力均優(yōu)于VC。

2.2 兩種生育酚酯衍生物的對衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化指標的影響

2.2.1 體內(nèi)抗氧化指標

許多研究結(jié)果顯示，D-半乳糖的注射誘導可加快小鼠衰老的速度，導致氧化應(yīng)激并產(chǎn)生MDA，MDA水平可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[25-26]；GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，通過清除體內(nèi)氧代謝生成的產(chǎn)物和維持谷胱甘肽活性從而維持細胞膜結(jié)構(gòu)及其功能[27]；T-AOC是評價動物體內(nèi)抗氧化酶和非酶系統(tǒng)水平的綜合指標，可反映生物體的自由基代謝能力，T-AOC低表明機體抗氧化系統(tǒng)不活躍，導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和自由基豐富[25]。由圖2可知，SLM組小鼠的MDA含量顯著高于NC組（P＜0.000 1），而GSH-Px活力和T-AOC顯著低于NC組（P＜0.000 1，P＜0.001）。添加兩種生育酚酯衍生物都能顯著降低MDA含量，VEH組、VECL組、VECM組、VECH組依次降低63.85%、60.02%、64.16%、71.12%（P＜0.000 1）。添加兩種生育酚酯衍生物顯著提高了GSH-Px活力和T-AOC水平，VEH組、VECL組、VECM組、VECH組的GSH-Px活力分別升高78.33%、80.03%、88.86%、68.11%（P＜0.05，P＜0.000 1），T-AOC水平分別升高63.42%、45.45%、81.82%、118.18%（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。Min等[28]研究發(fā)現(xiàn)補充VE可顯著降低氧化應(yīng)激大鼠血清中MDA含量，增加GSH-Px基因的表達從而提高氧化應(yīng)激公雞的抗氧化能力和免疫性能，這與本研究結(jié)果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物具有良好的抗氧化能力，對小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷具有一定的改善作用。

圖2 兩種生育酚酯衍生物對小鼠體內(nèi)抗氧化指標的影響Fig.2 Effects of two tocopherol ester derivatives on antioxidant indexes of mice

2.2.2 血清炎癥因子

氧化應(yīng)激的發(fā)生一般伴有炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激增強會刺激炎癥因子的表達[29]。血清中促炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α能促進炎癥反應(yīng)進行，其含量越低說明機體免疫功能越強[30]。如圖3所示，SLM組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量比NC組顯著提高（P＜0.000 1）。隨著D-α-生育酚醋酸酯劑量的增加，小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低，VECL組和VECH組小鼠的IL-6含量分別降低3.28%和9.88%，IL-1β含量分別降低1.71%和7.18%，TNF-α含量分別降低了13.88%和20.22%。VEH組的IL-1β和TNF-α含量比SLM組顯著降低（P＜0.05），表現(xiàn)出比VECL組更好的抗炎效果。Barros等[31]研究發(fā)現(xiàn)含有維生素E醋酸酯的活性制劑對白色念球菌具有抗炎活性，與本研究結(jié)果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物能夠降低由D-半乳糖誘導的衰老模型的炎癥因子增加，從而達到抗衰老的目的，且相同劑量下DL-α-生育酚醋酸酯效果比D-α-生育酚醋酸酯好。

圖3 兩種生育酚酯衍生物對小鼠血清炎癥因子的影響Fig.3 Effects of two tocopherol ester derivatives on serum levels of inflammatory cytokines in mice

2.2.3 肝功能指標AST、ALT

AST、ALT活性是目前臨床上常用的反映肝功能受損程度的生化指標，在肝細胞受損時，可引起細胞膜的通透性改變，血清ALT水平增加，當線粒體進一步受到影響時，AST含量升高[32]。從圖4可知，SLM組小鼠的AST和ALT活力較NC組顯著增加，分別增加18.95%、40.32%（P＜0.000 1），而經(jīng)過兩種生育酚酯衍生物干預(yù)，小鼠的AST、ALT活力有所降低。VEH組小鼠血清中AST活力顯著低于VECL組（P＜0.05），VEH組小鼠血清中AST和ALT含量比SLM組分別降低了7.20%、27.50%，VECL組則分別降低了5.81%、21.74%；經(jīng)過D-α-生育酚醋酸酯干預(yù)小鼠的AST、ALT活力隨著服用劑量增加而降低。Shah等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性鵪鶉日糧中添加松葉和維生素E醋酸酯能夠降低鵪鶉血清中AST含量，與本研究結(jié)果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物能減輕肝功能受損程度。

圖4 兩種生育酚酯衍生物對小鼠AST、ALT的影響Fig.4 Effects of two tocopherol ester derivatives on liver AST and ALT activities in mice

2.2.4 Nrf2通路相關(guān)蛋白及其mRNA相對表達量

II相抗氧化酶NQO1和HO-1是Nrf2調(diào)控的下游靶蛋白，其中NQO1能催化醌類物質(zhì)及其衍生物還原，從而降低其氧化毒性，HO-1能夠與膽紅素、一氧化碳等一起發(fā)揮抗氧化作用，當Nrf2作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子移位到細胞核中與ARE區(qū)域結(jié)合時，導致II相抗氧化酶表達增強[34-36]。Nrf2通路中相關(guān)蛋白及其mRNA相對表達量的結(jié)果如圖5所示，圖6為相關(guān)蛋白的Western blot圖。與NC組相比，SLM組的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量顯著下降，mRNA相對表達量分別降低了88.74%、87.76%和89.53%（P＜0.000 1），蛋白相對表達量分別下降了92.42%、94.19%和95.77%（P＜0.001，P＜0.000 1）。與SLM組相比，各組干預(yù)下相關(guān)蛋白及其mRNA相對表達量不同程度上升。對于Nrf2、NQO1、HO-1mRNA而言，相比SLM組，VEH組Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對表達量分別增加了514.08%、461.78%、515.32%（P＜0.000 1），VECH組則分別增加288.82%、282.39%、311.44%（P＜0.000 1）。對于Nrf2、NQO1、HO-1蛋白而言，相比SLM組，VEH組的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白相對表達量分別增加了620.00%、988.89%、1 200.00%，而VECH組分別增加346.67%、533.33%、887.5%。給藥劑量為10 mg/kgmb的DL-α-生育酚醋酸酯組Nrf2通路相關(guān)蛋白及其mRNA相對表達量都高于給藥劑量為100 mg/kgmb的D-α-生育酚醋酸酯組。綜上，兩種生育酚酯衍生物可通過上調(diào)衰老小鼠Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量，提高其體內(nèi)抗氧化能力，抵抗氧化應(yīng)激，從而具有抗衰老作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果優(yōu)于D-α-生育酚醋酸酯。

圖5 Nrf2通路中mRNA和蛋白相對表達量Fig.5 Relative mRNA and protein expression in the Nrf2 signaling pathway

圖6 Nrf2、NQO1、HO-1的Western blot組圖Fig.6 Western blot patterns of Nrf2,NQO1 and HO-1

3 結(jié)論

本研究通過測定兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力，并采用D-半乳糖致小鼠衰老后，用兩種生育酚酯衍生物進行干預(yù)。結(jié)果表明，兩種生育酚酯衍生物具有較好的體外、體內(nèi)抗氧化效果，能調(diào)節(jié)衰老小鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的升高，能使衰老小鼠的AST、ALT活力有所降低，有利于肝功能的修復(fù)；與衰老模型組相比，兩種生育酚酯衍生物干預(yù)后，小鼠NQO1、HO-1與Nrf2的mRNA和蛋白相對表達量增強，說明生育酚酯衍生物通過上調(diào)NQO1、HO-1、Nrf2的表達水平發(fā)揮其抗氧化作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果優(yōu)于D-α-生育酚醋酸酯。綜上所述，兩種生育酚酯衍生物具有較強的抗氧化能力，并能通過提升Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量緩解衰老。