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        六堡茶真菌固態(tài)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)單菌的篩選

        2024-04-08 02:41:12吳新惠杜金杰劉曉純廖楷濱2覃玉娜2梁煒杰2張靈枝2龍志榮邱瑞瑾
        食品科學(xué) 2024年6期

        吳新惠,杜金杰,劉曉純,廖楷濱2,,覃玉娜2,,梁煒杰2,,張靈枝2,,龍志榮,邱瑞瑾,*

        (1.梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院梧州分院,廣西 梧州 543003;2.廣西六堡茶生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 梧州 543003;3.韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512000;4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,廣東 廣州 510642;5.梧州市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,廣西 梧州 543000)

        六堡茶屬黑茶類,是國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品,因原產(chǎn)于梧州蒼梧六堡鎮(zhèn)而得名,是廣西特有的歷史名茶[1]。六堡茶飲用歷史悠久,特殊的地理環(huán)境和生產(chǎn)工藝造就其特殊的品質(zhì)風(fēng)味。適度渥堆和陳化是使六堡茶保持良好風(fēng)味的關(guān)鍵工序[2-3]。與其他五大類黑茶不同,六堡茶在渥堆、陳化和貯存過(guò)程中細(xì)菌和真菌持續(xù)的生理活動(dòng),使六堡茶“越陳越好”,因而六堡茶有“耐于久藏,且越陳越香”之說(shuō)[4-5]。真菌在傳統(tǒng)食品發(fā)酵中有著廣泛的應(yīng)用,前人研究表明真菌是影響黑茶發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵因素[6-9]。但傳統(tǒng)渥堆工藝無(wú)法控制發(fā)酵過(guò)程中的菌種類型,容易滋生多種雜菌,復(fù)雜多樣的微生物參與發(fā)酵導(dǎo)致六堡茶品質(zhì)不穩(wěn)定、難以控制。因此,篩選有益菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,探索不同真菌發(fā)酵對(duì)六堡茶品質(zhì)的影響對(duì)六堡茶發(fā)酵菌種工業(yè)化應(yīng)用有積極意義。

        固態(tài)發(fā)酵是指在固態(tài)基質(zhì)中加入微生物進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程,固態(tài)培養(yǎng)基不溶于水,可以為微生物提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)及生存環(huán)境[10]。微生物在茶葉固態(tài)發(fā)酵中可以保持自然的生長(zhǎng)狀態(tài),代謝產(chǎn)物更容易積累,更具豐富性,且固態(tài)發(fā)酵含水量低,生產(chǎn)成本也較低。人工接種真菌固態(tài)發(fā)酵不僅可以解決自然渥堆發(fā)酵品質(zhì)參差不齊、衛(wèi)生安全等問(wèn)題,還能賦予茶葉豐富的滋味品質(zhì)和獨(dú)特的保健功效[6,11]。楊洪元[12]利用從六堡茶中分離到的真菌進(jìn)行組合混菌發(fā)酵毛茶,結(jié)果顯示,接種組合青霉+冠突曲霉+黑曲霉+毛霉+酵母菌發(fā)酵可以取得與傳統(tǒng)渥堆六堡茶品質(zhì)相近的效果,且發(fā)酵時(shí)間縮短了近1/3。胡沛然[13]利用從渥堆樣品中分離鑒定出的產(chǎn)多酚氧化酶的嗜熱菌(灰黃青霉、黑曲霉和煙曲霉)固態(tài)發(fā)酵六堡茶,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),3 種嗜熱真菌發(fā)酵茶的茶多酚含量均呈降低趨勢(shì),其中轉(zhuǎn)化效果最明顯的是煙曲霉發(fā)酵組,各發(fā)酵組的茶黃素含量均下降,茶紅素和茶褐素含量變化不同。劉琨毅等[14]將地衣芽孢桿菌L1接種于滅菌和未滅菌的曬青茶中,發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌與其他微生物可能產(chǎn)生協(xié)同作用,從而改變普洱茶中的特征成分、提升普洱茶的感官品質(zhì)。王琪琪[15]以福鼎大白茶青為原料,接種人工益生菌群(阿姆斯特丹散囊菌、異常威克漢姆酵母、漢遜酵母、釀酒酵母、解淀粉芽孢桿菌)固態(tài)發(fā)酵茶葉,茶湯顏色從紅亮轉(zhuǎn)變?yōu)殓晟?,滋味甜醇,青氣消失,有菌香。近年?lái),許多學(xué)者通過(guò)研究進(jìn)一步證明了真菌發(fā)酵可以顯著提升茶葉品質(zhì),比如冠突散囊菌影響茯磚茶的發(fā)花工藝[16-19]。人工接種固態(tài)發(fā)酵不僅可以提升茶葉渥堆發(fā)酵效率、縮短發(fā)酵時(shí)間,還可以提升茶葉品質(zhì),是一種高效而有益的茶葉發(fā)酵方法。

        本研究利用課題組前期從六堡茶渥堆與蒸壓工藝中分離的20 株真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[20],以廣西梧州蒼梧縣群體種毛茶作原料、無(wú)菌處理組為空白對(duì)照,以六堡茶“紅、濃、陳、醇”的特征品質(zhì)作為參考標(biāo)準(zhǔn),定期抽樣檢測(cè)分析其中感官品質(zhì)和化學(xué)成分變化,探索不同真菌在六堡茶原料中的生長(zhǎng)特性及發(fā)酵品質(zhì)變化規(guī)律,篩選可顯著提升六堡茶品質(zhì)或賦予六堡茶新風(fēng)味的固態(tài)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)真菌,以期為后期人工控菌發(fā)酵六堡茶提供優(yōu)良菌種資源。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 發(fā)酵茶樣

        發(fā)酵毛茶由蒼梧縣群體種六堡茶一芽三葉鮮葉加工制成。

        1.1.2 發(fā)酵真菌來(lái)源

        用于固態(tài)發(fā)酵的20 株真菌從課題組前期實(shí)驗(yàn)中分離篩選得到,大多為六堡茶或其他黑茶中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道過(guò)的真菌,對(duì)黑茶發(fā)酵品質(zhì)的轉(zhuǎn)化有一定貢獻(xiàn)作用[20],如表1所示。

        表1 從渥堆六堡茶中分離鑒定到的20 株真菌Table 1 Twenty fungal strains isolated and identified from pile fermented Liupao tea

        1.1.3 試劑

        兒茶素(catechin,C)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、沒(méi)食子兒茶素(gallocatechin,GC)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(catechin gallate,CG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、咖啡因 上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜級(jí))美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;蒽酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;福林-酚、磷酸氫二鈉、茚三酮、磷酸二氫鉀、硫酸、碳酸鈉、蒽酮、氯化鋁(均為分析純)天津化學(xué)試劑有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TD-5Z型低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司;SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;GXZ-250A恒溫光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;ALANCE E295高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀、C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)美國(guó)Waters公司;血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 固態(tài)發(fā)酵

        1.3.1.1 六堡毛茶準(zhǔn)備

        稱取100 g毛茶于500 mL錐形瓶,封口膜封好,于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min,得到滅菌待接種毛茶,備用。

        1.3.1.2 菌懸液的制備

        菌種活化:取凍存的菌種置于28 ℃恒溫箱,24 h后在超凈工作臺(tái)中吸取0.5 mL解凍后的菌懸液于PDA培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基中用無(wú)菌涂布棒均勻涂布,密封后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~7 d,進(jìn)行活化。

        孢子懸液制備:將活化后的真菌用劃線法接種于PDA培養(yǎng)基、CA培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)4~7 d,得到F1,再劃線培養(yǎng)生長(zhǎng)5~10 d得到F2,用無(wú)菌生理鹽水洗脫F2孢子并轉(zhuǎn)移至錐形瓶(帶滅菌玻璃珠和適量無(wú)菌水),于搖床中振蕩約4~8 h(150~170 r/min),采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度并調(diào)節(jié)孢子濃度約為1×107CFU/mL,保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.1.3 接種菌懸液固態(tài)發(fā)酵

        100 g六堡毛茶于121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。按照1×107CFU/mL濃度接種菌懸液至滅菌毛茶培養(yǎng),同時(shí)調(diào)整發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,于28 ℃、相對(duì)濕度80%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵,每天觀察生長(zhǎng)情況。7 d后,待菌長(zhǎng)勢(shì)正常,1 周內(nèi)梯度升溫至55 ℃(每7 d循環(huán)一次梯度升溫程序),模擬實(shí)際生產(chǎn)的渥堆升溫和翻堆降溫過(guò)程。為避免茶樣結(jié)塊,發(fā)酵前7 d每隔2 d搖一次瓶,后期按照升溫梯度7 d一次,使茶樣發(fā)酵均勻。于14、21、28、35 d定時(shí)取樣(發(fā)酵期間定期審評(píng),21 d時(shí)若審評(píng)滋味仍然較澀或無(wú)特征香氣就停止發(fā)酵)。以不接種只加無(wú)菌純水的滅菌毛茶作為對(duì)照(CK)。每組樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)發(fā)酵。

        1.3.1.4 固樣處理

        參考曾貞等[21]的微波固樣法,微波爐額定輸出功率850 W,額定微波頻率2 450 MHz。100%火力固樣3 min,20%火力微波固樣8 min(分為3 次處理:4、2、2 min),最后用烘箱70~80 ℃烘至足干。烘干后,一部分保存于-18 ℃冰箱冷凍,用于感官審評(píng);另一部分磨成茶粉,保存于(0~4 ℃)冰箱冷藏,用于檢測(cè)理化成分指標(biāo)。

        1.3.2 主要化學(xué)成分的檢測(cè)

        水浸出物總含量測(cè)定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》[22];游離氨基酸總含量測(cè)定參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[23];黃酮類化合物總含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法;可溶性糖總含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法;茶色素總含量測(cè)定采用系統(tǒng)分析法;咖啡堿總含量測(cè)定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》[24];茶多酚含量、兒茶素組分含量測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[25]。

        1.3.3 HPLC樣品制備

        1.3.4 HPLC分析

        流動(dòng)相及色譜條件:流動(dòng)相A:90%甲醇溶液(平衡柱子);流動(dòng)相B:5%甲醇溶液;流動(dòng)相C:0.05%磷酸溶液;流動(dòng)相D:100%乙腈;流速:1 mL/min;波長(zhǎng):280 nm;后運(yùn)行時(shí)間:5 min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。洗脫條件:0~3 min,95%~90% A,5%~10% B;3~6 min,90% A,10% B;6~8 min,90%~80% A,10%~20% B。HPLC洗脫梯度程序見(jiàn)表2。

        表2 HPLC洗脫梯度Table 2 Gradient elution parameters for HPLC

        1.3.5 感官審評(píng)

        按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中黑茶(散茶)的審評(píng)方法,審評(píng)小組由5 位具有專業(yè)茶葉審評(píng)資格的小組成員(2 男3 女)組成,用專業(yè)的茶葉審評(píng)術(shù)語(yǔ)得出審評(píng)結(jié)果。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        測(cè)定結(jié)果取3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 24軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析,多重比較采用最小顯著性差異法(LSD法),數(shù)據(jù)用表示,使用GraphPad Prism 8軟件作圖,Origin 2021軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),采用Photoshop軟件制圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同真菌發(fā)酵對(duì)六堡茶感官品質(zhì)的影響

        CK組及20 株單菌固態(tài)發(fā)酵茶樣如圖1~3所示,審評(píng)結(jié)果如表3、4所示,其中依照發(fā)酵狀態(tài)調(diào)整,10 種真菌發(fā)酵21 d,有2 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)發(fā)酵樣(14、21 d),另外10 種真菌發(fā)酵35 d,有4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)發(fā)酵樣(14、21、28、35 d)。

        圖1 CK組外形、湯色和葉底Fig.1 Tea,infusion and brewed tea leaves in the control group

        表3 單菌發(fā)酵4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)審評(píng)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of Liupao tea at four time points of single-culture fermentation

        從圖1、表3可知,無(wú)菌對(duì)照CK組感官審評(píng)結(jié)果在4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均無(wú)明顯差異,干茶外形烏褐油潤(rùn),開(kāi)湯后香氣純正、生曬味,湯色橙黃,清澈明亮,滋味濃強(qiáng)苦澀,葉底綠褐,與毛茶感官品質(zhì)接近,說(shuō)明在無(wú)菌狀態(tài)下僅有的濕熱作用對(duì)六堡茶感官品質(zhì)影響不大。

        六堡茶品質(zhì)以紅、濃、陳、醇為特征,如圖2、表3所示,這10 種真菌接種固態(tài)發(fā)酵后在4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上均能顯著改善六堡茶湯色、香氣或滋味品質(zhì)。其中,能顯著改善茶葉湯色的有芒果青霉、角膜曲霉、赤曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉、極細(xì)枝孢霉;呈陳香、木香、菌香、藥香、參香等香氣特征的有塔賓曲霉、黑曲霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉,而極細(xì)枝孢霉發(fā)酵21 d和28 d有較為獨(dú)特的玫瑰花香;在滋味方面,10 個(gè)真菌發(fā)酵21、28 d的茶樣滋味均較為醇厚順滑,而發(fā)酵到35 d部分茶樣滋味變苦澀、變酸,推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)條件下這些真菌接種發(fā)酵時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。部分真菌發(fā)酵茶樣香氣到35 d時(shí)下沉,變粗雜,甚至出現(xiàn)酸味,說(shuō)明發(fā)酵過(guò)度,如塔賓曲霉和團(tuán)青霉。對(duì)比在同一時(shí)間的外形、湯色及滋味特征發(fā)現(xiàn),茶樣表面孢子生長(zhǎng)越旺盛,茶湯顏色越深、滋味越醇和;外形越接近毛茶和無(wú)菌對(duì)照發(fā)酵樣,其湯色越淺、滋味越苦澀。綜上,單菌最佳發(fā)酵時(shí)間為21 d。

        從表4可以看出,29家醫(yī)養(yǎng)結(jié)合型養(yǎng)老機(jī)構(gòu)中的20家綜合效率值為1,視為DEA有效,另外9家處于弱DEA有效,即在規(guī)模效率或純技術(shù)效率值上沒(méi)有達(dá)到最優(yōu),其中,最低的是機(jī)構(gòu)10,其綜合效率僅為0.675,相對(duì)于其他養(yǎng)老機(jī)構(gòu)而言,其投入的資源沒(méi)有得到充分利用。在規(guī)模報(bào)酬可變的情況下,純技術(shù)效率值為1的有23家,占比79.31%;而從規(guī)模效率角度分析,20家規(guī)模效率有效,9家處于規(guī)模效率無(wú)效的狀態(tài),還存在通過(guò)改變規(guī)模提高效率的空間。

        圖2 不同真菌固態(tài)發(fā)酵樣4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)湯色(A)、外形(B)和葉底(C)Fig.2 Tea infusion (A),tea (B),and brewed tea leaves (C) at four time points of solid-state fermented with different fungi

        由圖3、表4可知,單菌接種固態(tài)發(fā)酵14 d后所有菌株在茶葉表面長(zhǎng)勢(shì)各異,曲霉屬真菌和青霉屬真菌在茶葉表面長(zhǎng)勢(shì)相較于其他屬真菌更旺盛,部分樣品發(fā)酵14 d和21 d的外形無(wú)差異,滋味變化不大,苦澀味仍在。其中也有香氣較為突出的發(fā)酵菌種,如鮮紅青霉、聚多曲霉、產(chǎn)黑色素短梗霉,發(fā)酵后只能對(duì)六堡茶某一感官品質(zhì)產(chǎn)生有益的影響,未來(lái)可以考慮混菌發(fā)酵,突出其發(fā)酵特征。

        圖3 不同真菌固態(tài)發(fā)酵樣2 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)外形、湯色和葉底Fig.3 Tea,infusion and brewed tea leaves at two time points of solidstate fermentation with different fungi

        表4 單菌發(fā)酵2 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)審評(píng)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of tea samples at two time points of single fungal fermentation

        綜合感官審評(píng)的湯色、香氣和滋味,從60 種發(fā)酵茶樣中篩選出9 種(21 d)發(fā)酵茶樣用于理化成分分析,分別為L(zhǎng)B-5、LB-10、LB-22、LB-24、LB-32、LB-35、LB-43、LB-55、LB-81,探究9 種真菌發(fā)酵21 d對(duì)六堡茶滋味品質(zhì)成分的影響。

        2.2 不同真菌發(fā)酵對(duì)六堡茶生化成分的影響

        2.2.1 PCA

        如圖4所示,基于18 種生化成分,PCA和HCA結(jié)果表明9 種不同真菌發(fā)酵六堡茶和CK組差異顯著。PCA將各處理組劃分為3 組。組1包括CK、團(tuán)青霉和赤酵母組,組2包括塔賓曲霉、黑曲霉、角膜曲霉、赤曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉組,組3為芒果青霉組。PC1和PC2分別解釋總方差的44.93%和21.57%。CK、團(tuán)青霉、赤酵母與其他發(fā)酵茶樣的成分差異顯著(P<0.05);芒果青霉與其他發(fā)酵茶樣相比,在PC2的權(quán)重上被區(qū)分開(kāi)??們翰杷?、GCG、EGCG、ECG和茶紅素分別是PC1的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì),游離氨基酸、黃酮、茶黃素、EC和GC是PC2的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì)(表5)。此外,HCA將生化成分聚為兩簇,EGC、咖啡堿、茶褐素和水浸出物聚為一簇,其他14 種成分聚為另一簇。

        圖4 不同茶樣中18 種特定化學(xué)成分的PCA(A)和HCA(B)Fig.4 PCA (A) and HCA (B) plots of 18 chemical components in different tea samples

        表5 單菌發(fā)酵六堡茶中18 種主要化學(xué)成分對(duì)PC1與PC2的貢獻(xiàn)度Table 5 Contribution rates of 18 major chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains to PC1 and PC2

        2.2.2 不同茶樣理化成分的變化

        從表6可知,與CK組相比,六堡毛茶經(jīng)9 種不同真菌發(fā)酵21 d后,黑曲霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉發(fā)酵茶樣的水浸出物含量顯著下降(P<0.05),塔賓曲霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵樣含量極顯著增加(P<0.01),明顯高于其他真菌發(fā)酵的六堡茶,結(jié)合感官審評(píng)結(jié)論可知,這兩種真菌發(fā)酵的六堡茶茶湯滋味醇厚。與CK樣相比,9 株真菌發(fā)酵樣茶多酚含量呈極顯著變化(P<0.01),除赤酵母發(fā)酵樣極顯著增加外(P<0.01),其他8 種真菌發(fā)酵茶的茶多酚含量極顯著減少(P<0.01),其中降幅最大的是芒果青霉。

        表6 單菌發(fā)酵六堡茶理化成分Table 6 Chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains %

        9 種真菌固態(tài)發(fā)酵茶樣在21 d時(shí),黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、和赤酵母發(fā)酵茶的茶黃素含量極顯著減少(P<0.01),塔賓曲霉和阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶的茶黃素含量顯著減少(P<0.05),而角膜曲霉無(wú)顯著變化。相比于CK組,所有真菌發(fā)酵茶樣的茶褐素含量均極顯著增加(P<0.01),特別是塔賓曲霉、黑曲霉、阿姆斯特丹曲霉。各組的茶紅素含量也呈極顯著變化;與CK組相比,除了赤酵母極顯著升高外(P<0.01),其他真菌發(fā)酵均呈極顯著降低(P<0.01)。9 種真菌發(fā)酵茶樣可溶性糖含量均呈極顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)。

        2.2.3 兒茶素組分含量的變化

        兒茶素是茶多酚中含量最高的化合物,其含量的多少與茶湯的苦澀味強(qiáng)度呈正相關(guān),主要包括C、EC、GC、EGC、CG、ECG、GCG、EGCG 8 種單體,前4 種為非酯型兒茶素,后4 種為酯型兒茶素。不同標(biāo)準(zhǔn)品HPLC見(jiàn)圖5。

        圖5 不同標(biāo)準(zhǔn)品的HPLCFig.5 HPLC chromatograms of catechin standards

        從表7、8 可知,與對(duì)照組相比,黑曲霉、角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母發(fā)酵茶的非酯型兒茶素含量均極顯著減少(P<0.01)。塔賓曲霉、黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶的酯型兒茶素含量均極顯著減少(P<0.01),赤酵母顯著減少(P<0.05),角膜曲霉無(wú)顯著變化。與CK組相比,9 種真菌發(fā)酵茶中GC、ECG含量均呈極顯著變化(P<0.01),只有芒果青霉和赤曲霉發(fā)酵六堡茶的GC含量極顯著上升(P<0.01),塔賓曲霉、黑曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母發(fā)酵茶樣的GC含量極顯著降低(P<0.01),角膜曲霉發(fā)酵茶顯著降低(P<0.05)。與CK相比,芒果青霉和赤曲霉、間型曲霉發(fā)酵茶中EGC含量均無(wú)顯著差異,而其他6 種真菌發(fā)酵茶EGC含量均極顯著減少(P<0.01)。角膜曲霉、赤曲霉和赤酵母發(fā)酵六堡茶的C含量無(wú)顯著變化,其他5 種真菌發(fā)酵茶均呈極顯著減少(P<0.01)。塔賓曲霉、黑曲霉、團(tuán)青霉接種發(fā)酵21 d后EC含量呈極顯著減少(P<0.01),而赤曲霉發(fā)酵茶呈極顯著增加(P<0.01)。9 種真菌發(fā)酵茶的酯型兒茶素含量除角膜曲霉和赤酵母外,均呈極顯著減少(P<0.01)。EGCG含量除了角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵茶無(wú)顯著變化外,其他真菌發(fā)酵茶均極顯著降低(P<0.01);9 種真菌發(fā)酵茶樣的GCG含量均呈極顯著降低(P<0.01),特別是塔賓曲霉、黑曲霉和阿姆斯特丹曲霉;除角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵茶ECG含量顯著升高外(P<0.05),其他真菌發(fā)酵茶ECG含量極顯著降低(P<0.01);除角膜曲霉外,其他8 種真菌發(fā)酵對(duì)CG含量均有顯著影響(P<0.05),其中黑曲霉極顯著增加了CG含量(P<0.01)。除赤酵母外,8 種真菌發(fā)酵茶總兒茶素含量顯著下降(P<0.05),減弱了六堡毛茶的苦澀味和刺激性。

        2.2.4 不同茶樣咖啡堿、總黃酮、游離氨基酸含量的變化

        由表8可知,與CK相比,赤酵母發(fā)酵的六堡茶咖啡堿含量無(wú)顯著變化,而其他8 種真菌發(fā)酵六堡茶的咖啡堿含量均顯著增加(P<0.05),塔賓曲霉、黑曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵的六堡茶咖啡堿含量呈極顯著增加趨勢(shì)(P<0.01);其中塔賓曲霉發(fā)酵茶樣咖啡堿含量最高,為(60.11±0.63)mg/g。與CK相比,9 種真菌發(fā)酵茶黃酮含量變化不同,黑曲霉發(fā)酵茶樣黃酮含量極顯著增加(P<0.01),塔賓曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵樣黃酮含量呈極顯著減少趨勢(shì)(P<0.01),赤曲霉黃酮含量顯著減少(P<0.05)。9 種真菌發(fā)酵茶中游離氨基酸含量除阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶顯著減少外(P<0.05),其他發(fā)酵茶樣均極顯著減少(P<0.01),含量減少最多的是芒果青霉。

        表8 單菌發(fā)酵對(duì)六堡茶主要化學(xué)成分的影響Table 8 Effect of single fungal fermentation on major chemical components in Liupao tea

        3 討論與結(jié)論

        為探究20 株真菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)六堡茶品質(zhì)的影響,本研究利用人工接種固態(tài)發(fā)酵六堡毛茶,通過(guò)感官審評(píng)結(jié)果,挑選出9 株單菌發(fā)酵優(yōu)異茶樣進(jìn)行理化成分分析。感官審評(píng)結(jié)果表明,與無(wú)菌發(fā)酵樣CK相比,接種不同真菌發(fā)酵的茶樣茶湯顏色加深,滋味由苦澀轉(zhuǎn)為醇和或醇厚,香氣由六堡毛茶的豆香、煙香轉(zhuǎn)化為菌花香、木質(zhì)香、陳香、甜花香。其中曲霉屬對(duì)六堡茶品質(zhì)影響最大,主要體現(xiàn)在茶湯上,曲霉屬真菌發(fā)酵六堡茶湯色較其他屬真菌發(fā)酵茶深,滋味更醇厚。綜合各項(xiàng)指標(biāo)顯示,接種發(fā)酵21 d的六堡茶品質(zhì)趨于穩(wěn)定,角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉和赤酵母發(fā)酵21 d即可達(dá)到較優(yōu)品質(zhì),香氣表現(xiàn)為甜香帶菌香,滋味醇厚。

        理化成分分析結(jié)果表明,對(duì)比CK組,9 株真菌發(fā)酵茶樣茶多酚、茶紅素和可溶性糖含量均呈極顯著變化(P<0.01),總兒茶素含量方面除角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵樣外,其他真菌發(fā)酵與CK相比均極顯著減少(P<0.01)。茶褐素是黑茶中含量最高的一種色素類物質(zhì),其具有降血糖、降血脂[26-27]、促進(jìn)膽固醇降解[28]、抑菌[29]、改善腸道菌群、抗氧化[30]、抗癌[31]等一系列特殊功效,本研究中9 株真菌發(fā)酵能使茶樣中的茶褐素含量極顯著增加(P<0.01),其中黑曲霉在前人研究中已證實(shí)在一定條件下能高產(chǎn)茶褐素[32]。咖啡堿含量中赤曲霉發(fā)酵樣顯著增加(P<0.05),赤酵母無(wú)顯著變化,其他7 種真菌發(fā)酵均能極顯著增加咖啡堿含量(P<0.01),有研究表明曲霉屬真菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)茶葉中咖啡堿含量的增加有顯著促進(jìn)作用[33-34]??傊e曲霉、黑曲霉、團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵六堡毛茶能顯著改變茶葉中18 種化學(xué)成分含量,感官審評(píng)結(jié)果顯示塔賓曲霉和黑曲霉滋味品質(zhì)不如團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉,因此,本研究篩選出團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉為最適單菌發(fā)酵菌株。

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