馬 丁，秦雙霞，郝慧超，鄧放明,2,*，趙玲艷,2,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長沙現(xiàn)代食品創(chuàng)新研究院，湖南 長沙 410128）

過敏是由免疫系統(tǒng)紊亂和超敏反應(yīng)引起的炎癥性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，過敏的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，成為全球健康領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)之一[2]。目前，過敏尚無有效的治療方法，患者只能依靠藥物緩解過敏性疾病，或避免接觸環(huán)境和食物中的過敏原。由于藥物存在一定的副作用，同時致使過敏反應(yīng)的過敏原難以確定，導(dǎo)致過敏癥難以治療[3]。過敏反應(yīng)根據(jù)其機理可分為I、II、III、IV型，絕大部分過敏疾病與I型過敏反應(yīng)相關(guān)[4]。I型過敏反應(yīng)又稱即時性過敏反應(yīng)，癥狀在接觸過敏原后幾小時內(nèi)出現(xiàn)[5]。隨著過敏反應(yīng)的發(fā)生體內(nèi)會產(chǎn)生免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）以消除過敏原。IgE與肥大細(xì)胞表面的高親和力IgE受體（highaffinity IgE receptor，F(xiàn)cεRI）結(jié)合，并導(dǎo)致大量的化學(xué)介質(zhì)（如組胺（histamine，HIS）和白三烯）釋放到細(xì)胞外，這一過程稱為“脫顆?！盵6-7]。所釋放的化學(xué)介質(zhì)導(dǎo)致組織產(chǎn)生過敏的癥狀。因此，抑制IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒能有效的預(yù)防和治療過敏性疾病。

益生菌被定義為對宿主提供健康益處的活的微生物。近年來，益生菌已被報道具有各種生理作用，對各種疾病如胃腸道疾病、代謝紊亂、血清膽固醇升高、腫瘤和過敏等具有有益作用。Wu等[8]研究了鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）對卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏的哮喘小鼠的影響。研究結(jié)果表明，LGG可以降低過敏小鼠的輔助T細(xì)胞2（T helper 2，Th2）的反應(yīng)，改善受損的腸上皮屏障功能。Song等[9]證實了植物乳桿菌L67能夠抑制暴露于雙酚A的RBL-2H3細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，以及鎘處理后的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，益生菌產(chǎn)生有益作用的成分主要來自其細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)和細(xì)胞代謝成分，如脂磷壁酸、短鏈脂肪酸、胞外多醣、遺傳物質(zhì)、多肽、有機酸等物質(zhì)[10-12]。這些研究表明，益生菌是一種預(yù)防和治療過敏的新方法。因此，本研究通過體外抗逆性、黏附性、抑菌性、體外安全性4 個指標(biāo)對菌株益生特性進行評價，然后通過RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒實驗篩選具有抗過敏活性的益生菌，并進行鑒定，旨在為菌種資源的綜合利用和益生菌抗過敏活性的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19115）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、鼠李糖乳桿菌（ATCC 53103）、Caco-2細(xì)胞（ATCC HTB-37）美國典型培養(yǎng)物保藏中心；大腸桿菌（CGMCC 9181）中國普通微生物菌種保藏管理中心。

血平板、生物胺試劑盒、MRS肉湯、明膠培養(yǎng)基、瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、牛膽鹽等 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g）、?；悄扄}北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗生素試劑盒 杭州微生物試劑有限公司；24、96 孔板 無錫耐思生命科技股份有限公司；抗-二硝基苯酚（anti-dinitrophenol，anti-DNP）IgE、二硝基苯基化人血清白蛋白（dinitrophenylated human serum albumin，DNP-HSA）西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；HIS、白介素-4（interleukin 4，IL-4）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor α，TNF-α）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（96 T）上海泛柯實業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、針式濾菌器 默克投資（中國）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海派森諾生物科技股份有限公司；D4030A dNTP、DRR20AM TaKaRa LATaqTM聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-2F pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；全套精密移液槍 艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司；SQ810C自動高壓蒸汽滅菌器 重慶雅瑪拓科技有限公司；YP-B10002電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；HCB-1300V潔凈工作臺 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；CX31光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；ULTS1368超低溫冰箱、Heraeus MultifugeX1R高速冷凍離心機、渦旋振蕩儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SPL250生化培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；Spark多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；MNT-150游標(biāo)卡尺 上海美耐特實業(yè)有限公司；UV-1801分光光度計 北京北分瑞利分析儀器（集團）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離、菌懸液和發(fā)酵上清液的制備

乳酸菌的分離：發(fā)酵蔬菜樣本以10 倍梯度稀釋，涂布于含0.5 g/100 mL CaCO3的MRS固體平板上，并在37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，選取具乳酸菌特征、溶鈣圈及革蘭氏染色陽性菌落進行純化處理。純化菌株需編號并于4 ℃冰箱中保存以備后續(xù)使用。

菌懸液的制備：選取菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h并進行2 代培養(yǎng)。取出菌液在4 ℃、9 800×g條件下離心3 min，棄上清液保留菌體。用10 mL生理鹽水清洗菌體兩次，重復(fù)離心并棄去上清液。用生理鹽水懸浮菌體，檢測OD600nm，若低于0.8則增加菌體，高于0.8則稀釋，直至達(dá)0.8。最后，密封良好后于4 ℃冰箱貯存。

發(fā)酵上清液的制備：選取菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，然后在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，進行兩代培養(yǎng)以確保菌株充分生長。培養(yǎng)完畢后，將菌液在4 ℃、9 800×g離心3 min，小心倒出上清液轉(zhuǎn)至新離心管。用濾菌器去除殘菌，得清液。再用無菌NaOH溶液將上清液調(diào)至中性pH值，持續(xù)檢測以確保范圍。調(diào)整后，將上清液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的無菌試劑瓶中，并貯存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 耐酸和耐膽鹽實驗

在菌株經(jīng)過兩代活化后，選擇最后一代培養(yǎng)12 h的菌株進行接種。對于每個待測菌株，分別以3%接種量接種到兩種不同的MRS液體培養(yǎng)基中：一種為調(diào)整至pH 2的MRS液體培養(yǎng)基；另一種為含有3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基。隨后將接種好的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱，在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。將兩種培養(yǎng)基中均呈渾濁狀態(tài)的菌株選為耐酸和耐膽鹽的候選菌株。記錄呈渾濁狀態(tài)的菌株編號。

1.3.3 模擬胃腸液實驗

模擬胃液制備：通過在磷酸緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 2.0）中混合胃蛋白酶（0.3 mg/mL），然后通過針式濾菌器過濾對PBS-胃蛋白酶混合物進行無菌處理制備。模擬腸液制備：在PBS（pH 6.8）中加入胰蛋白酶（0.1 mg/mL），然后通過針式濾菌器對PBS-胰蛋白酶混合物進行無菌處理。將菌懸液以1%接種量分別接種到模擬胃液或模擬腸液中，37 ℃培養(yǎng)3 h后，通過平板計數(shù)確定存活細(xì)胞的數(shù)量。菌株存活率計算如式（1）所示：

式中：A0為0 h活菌數(shù)量的對數(shù)值；A1為3 h活菌數(shù)量的對數(shù)值。

1.3.4 抗菌活性測定

抗菌活性采用牛津杯法進行測定，以金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19115）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、大腸桿菌（CGMCC 9181）為指示菌株。

1.3.5 菌株表面特性測定

1.3.5.1 疏水性

通過測量微生物對乙酸乙酯和氯仿的親和力評估。將1 mL乙酸乙酯和1 mL氯仿分別加入到3 mL菌懸液中，并用渦旋混合儀振蕩混合。然后，水相和有機相在室溫分離30 min。去除水相，并測定OD600nm，以LGG為對照菌株。其疏水性計算如式（2）所示：

式中：A0為初始菌懸液的OD600nm；A1為有機相的OD600nm。

1.3.5.2 自聚集能力

將菌懸液渦旋10 s，隨后室溫孵育5 h，并測定新的OD600nm，以LGG為對照菌株。其自聚集能力計算如式（3）所示：

式中：A0為初始菌懸液的OD600nm；A1為處理5 h的OD600nm。

1.3.5.2 共聚集能力

將等體積待測菌菌懸液和致病菌菌懸液的濃度均調(diào)整為1×108CFU/mL，同時制備同濃度LGG菌懸液作對照。將待測菌混合單核細(xì)胞增生李斯特菌與大腸桿菌，渦旋混合10 s，孵育5 h觀察共聚集。結(jié)束后，輕取上層懸液放入無菌試管，避免擾動共聚集細(xì)胞。最后測定OD600nm。其共聚集能力計算如式（4）所示：

式中：A1為受試菌與致病菌菌懸液混合5 h后的OD600nm；A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨處理5 h的OD600nm。

1.3.6 Caco-2細(xì)胞實驗

1.3.6.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中解凍Caco-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)瓶中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。每2 d更換一次培養(yǎng)基，保持無菌操作。細(xì)胞融合度為80%～90%時，用PBS洗滌，0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化脫落。停止消化后，轉(zhuǎn)移到無菌離心管離心收集，棄上清液，用新DMEM重新懸浮細(xì)胞。適當(dāng)比例分配到新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，3 次傳代后進行實驗。

1.3.6.2 Caco-2細(xì)胞黏附實驗

在24 孔板中，將Caco-2細(xì)胞懸液（5×104個/mL）250 μL培養(yǎng)至單層，使用無菌PBS洗滌兩次。將菌懸液添加并孵育2 h以實現(xiàn)相互作用。去除懸液，用無菌PBS液沖洗3 次，清除未附著菌體。然后以平板計數(shù)法測量細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)量，評估菌株黏附性。黏附率計算如式（5）所示：

1.3.6.3 對Caco-2細(xì)胞ALP活性的測定

參照Lv Jia等[13]的方法，將長至單層Caco-2細(xì)胞與3 個處理組（鼠傷寒沙門氏菌（S）、受試菌、受試菌＋S）和1 個僅用完全培養(yǎng)基處理的對照組在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育后，在4 ℃條件下以1 500 ×g離心10 min后收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，使用ALP試劑盒測定收集的上清液中細(xì)胞外ALP的活性。

1.3.7 安全性評價

1.3.7.1 溶血性

參考文獻(xiàn)[14]評估菌株的溶血性。將已經(jīng)純化的菌株涂抹在含有體積分?jǐn)?shù)5%綿羊血的血瓊脂平板上，每個菌株在單獨的平板上進行涂抹。在涂抹過程中，確保菌株分散均勻且不重疊。完成涂抹后，將平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，之后從培養(yǎng)箱中取出血瓊脂平板，觀察平板上菌落的溶血情況。

1.3.7.2 明膠酶活性

將活化好的受試菌用接種針穿刺接種到明膠培養(yǎng)基中，并在37 ℃培養(yǎng)24 h。然后將接種物于4 ℃放置30 min，待降溫后取出觀察，若處于溶解狀態(tài)，則表示明膠液化實驗為陽性；若呈凝固且不溶解，則結(jié)果為陰性。

1.3.7.3 抗生素敏感性

采用包含20 種抗生素的藥敏試劑盒測定分離菌株對抗生素的敏感性。

1.3.8 RBL-2H3細(xì)胞實驗

1.3.8.1 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出RBL-2H3細(xì)胞，37 ℃水浴解凍，避免振蕩和光照。解凍后迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含20%胎牛血清的37 ℃ DMEM，濃度適中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)基。融合度80%～90%時進行傳代：無菌PBS沖洗，0.25% Trypsin-EDTA消化，加入含10%胎牛血清的DMEM中和。轉(zhuǎn)至無菌離心管，1 000×g離心5 min，棄上清液，用新DMEM重懸浮細(xì)胞。細(xì)胞液分到新瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。進行3 次傳代后開始實驗。

1.3.8.2β-己糖胺酶（β-hexosaminidase，β-HEX）釋放抑制率測定

參照Ding Yuanyuan等[15]的方法，將96 孔板中的RBL-2H3細(xì)胞（2×105個/mL）與200 μL 0.5 μg/mL Anti-DNPIgE培養(yǎng)過夜。棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3 次，用200 μL發(fā)酵上清液處理致敏的RBL-2H3細(xì)胞1 h。棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3 次，然后用100 mL 1 μg/mL DNP-HSA作為抗原刺激20 min。然后將30 μL上清液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，與70 mL 1.3 mg/mL 4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，在pH 4.5、0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中37 ℃孵育90 min。加入100 μL 0.4 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖溶液停止反應(yīng)。利用多功能酶標(biāo)儀在405 nm波長處測定吸光度。對β-HEX釋放的抑制率計算如式（6）所示：

式中：C為對照組吸光度；T為實驗組吸光度；N為正常組吸光度；對照組（C）為Anti-DNP-IgE（＋）、DNP-HSA（＋）、測試樣品（-）；實驗組（T）為Anti-DNP-IgE（＋）、DNP-HSA（＋）、測試樣品（＋）；正常組（N）為Anti-DNP-IgE（-）、DNPHSA（-）、測試樣品（-）。其中，“＋”“-”分別表示添加和不添加該物質(zhì)。

1.3.8.3 細(xì)胞因子HIS、IL-4和TNF-α的測定

用3 個處理組分別處理致敏的RBL-2H3細(xì)胞1 h。棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3 次，然后用100 mL 1 μg/mL DNP-HSA作為抗原刺激20 min。在DNP-HSA刺激細(xì)胞1 h后，分別使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定HIS、IL-4和TNF-α，分析RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)基中HIS、IL-4和TNF-α的釋放情況。根據(jù)實驗要求3 個處理組分組如下：模型組（N）為Anti-DNP-IgE（＋）、DNP-HSA（＋）、測試樣品（-）；實驗組（T）為Anti-DNP-IgE（＋）、DNP-HSA（＋）、測試樣品（＋）；空白組（C）為Anti-DNP-IgE（-）、DNP-HSA（-）、測試樣品（-）。

1.3.9 16S rDNA菌株鑒定

參照Cui Yalei等[16]的方法，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA，并檢測純度、濃度以確保PCR需求。PCR混合液由Taq緩沖液、Taq酶、上下引物、樣品DNA、dNTPs和雙蒸餾水按比例配制。在PCR儀中進行擴增，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、75 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)，最后進行最終延伸。然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送至上海派森諾生物科技有限公司測序。接收測序結(jié)果后，使用Chromas軟件分析基因序列，去除引物序列。最后，利用BLAST算法在NCBI數(shù)據(jù)庫比對16S rDNA序列，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2023軟件整理實驗數(shù)據(jù)并計算統(tǒng)計參數(shù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS Statistics 26軟件進行方差分析（ANOVA），如有顯著差異（P＜0.05），進行最小顯著差異多重比較。實驗結(jié)果以表示。利用Origin 2022軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及耐酸和耐膽鹽實驗結(jié)果

通過MRS培養(yǎng)基分離和革蘭氏染色，從不同地區(qū)采集的發(fā)酵蔬菜中分離出50 株革蘭氏陽性菌株，其中菌株662、722、928和929在pH 2和含3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基的環(huán)境中均表現(xiàn)出良好耐受性，對這4 株菌進行下一步研究。

2.2 菌株對模擬胃腸液的耐受性

益生菌在胃腸液中存活，并能夠以足夠的數(shù)量到達(dá)腸道，才能對宿主產(chǎn)生健康益處[17]。因此，通過體外模擬胃腸道環(huán)境篩選高存活率的益生菌具有重要意義。由圖1可知，所有菌株在模擬胃腸液中表現(xiàn)出較高存活率，均大于60%，其中菌株929在模擬胃液和腸液中的存活率分別為（84.47±1.27）%和（81.01±1.46）%，總體顯著高于其他菌株（P＜0.05）。與對照菌株LGG相比，菌株928也具有較好耐受性，與Xu Yihan等[18]從發(fā)酵食品和Reuben等[19]從乳制品中分離出的乳酸菌的實驗結(jié)果一致。這表明所選的菌株具有順利進入人腸道的潛力，可以作為益生菌的候選菌株。

2.3 菌株抗菌活性

潛在的益生菌應(yīng)表現(xiàn)出抗菌活性，并通過抑制病原菌的生長和繁殖促進胃腸道的健康[20-21]。如表1所示，所選菌株對5 株致病菌均有抑制作用，與對照菌株LGG相比，受試菌588、658和928對5 株致病菌的抑菌圈直徑均無顯著差異（P＞0.05）。據(jù)報道，益生菌通過競爭性抑制和細(xì)胞外抑菌產(chǎn)物，包括有機酸、細(xì)菌素和過氧化氫等物質(zhì)，從而抑制致病菌的生長。然而，抗菌活性取決于物種和菌株，不同的物種和不同的菌株表現(xiàn)出不同的抗菌活性[22-23]。

表1 分離菌株抗菌活性Table 1 Antibacterial activities of isolated strains

2.4 菌株表面特性

自聚集與菌株在胃腸道中的附著和定植能力有關(guān)。從圖2 可以看出，由于菌株表面特異性，不同菌株間的自聚集能力差異顯著（P＜0.05），其值在（13.71±0.36）%～（46.11±1.55）%之間，表明這些菌株在人腸道中具有潛在的黏附和定植能力。這一結(jié)果與Akman[24]和Mohammed[25]等的結(jié)果相似。此外，益生菌株與病原體的共同聚集促進了對致病菌的黏附和清除[26]。與對照菌株LGG相比，菌株588和928對大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌均表現(xiàn)出接近或更高的共聚集能力，表明菌株對不同致病菌具有較強的共聚集能力。因此，所選的菌株可能是減少致病菌定植并預(yù)防感染的候選菌。

圖2 分離菌株的聚集能力Fig.2 Aggregation capacity of isolated strains

疏水性被認(rèn)為是反映益生菌對上皮細(xì)胞黏附能力的重要參考指標(biāo)，具有高疏水性的益生菌具有更好的結(jié)合上皮細(xì)胞的能力[27]。由圖3可知，通過氯仿和乙酸乙酯兩種有機試劑處理，不同菌株間的疏水性差異顯著（P＜0.05），但所有菌株在氯仿中的疏水性均高于65%，而受試菌對乙酸乙酯的疏水性在（24.63±1.55）%～（28.66±1.42）%之間，表明受試菌在氯仿中的疏水性較高。此外，與對照菌株LGG相比，受試菌在氯仿和乙酸乙酯中表現(xiàn)出相當(dāng)甚至更高的疏水性。據(jù)報道，親水和疏水的特性是由細(xì)菌表面的多糖和蛋白質(zhì)造成的[28]。所選菌株對堿性溶液（乙酸乙酯）表現(xiàn)出較弱的黏附性，這表明所選菌株表面可能呈現(xiàn)非Lewis酸性和較差的電子受體特性，而對酸性溶液（氯仿）的親和力較強表明所選菌株表面可能呈現(xiàn)Lewis酸性和較強的電子供體的特性[29]。

圖3 分離菌株的疏水性Fig.3 Hydrophobicity of isolated strains

綜上所述，所選菌株在自聚集、共聚集和疏水性方面的表現(xiàn)說明其具有黏附和定植能力，在抵御致病菌攻擊以及適應(yīng)不同化學(xué)環(huán)境方面有潛在優(yōu)勢。這些特性可能使其成為減少致病菌定植并預(yù)防感染的有效候選菌株，為未來益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供了有力支持。

2.5 菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附結(jié)果

益生菌對上皮細(xì)胞的黏附是在腸道定植的重要特性，它使益生菌菌株能夠在腸道中有效地增殖和競爭。此外，益生菌具有較高的黏附能力，可能會延長益生菌在胃腸道中的停留時間，從而增強其對宿主發(fā)揮積極益生作用的效果。Caco-2細(xì)胞是來自于人類腸道黏膜的結(jié)腸癌細(xì)胞，其細(xì)胞模型常被用于確定益生菌的競爭性抑制、遷移、黏附能力[30]。由圖4可知，菌株588、928和929表現(xiàn)出良好的黏附能力，均與對照組益生菌LGG無顯著性差異（P＞0.05），而菌株658表現(xiàn)出較低黏附能力，僅為（43.33±7.20）%。研究表明，益生菌的黏附是菌株的表面成分與腸道細(xì)胞表面之間的相互作用，黏附能力與各種不同的表面成分有關(guān)，包括脂磷壁酸、多糖和蛋白質(zhì)[31-32]。

圖4 分離菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附能力Fig.4 Adhesion capacity of isolated stains to Caco-2 cells

2.6 菌株對Caco-2細(xì)胞膜完整性的保護作用

ALP是一種存在于Caco-2細(xì)胞內(nèi)的酶類，當(dāng)Caco-2細(xì)胞膜受到損傷或缺乏完整性時，胞內(nèi)的ALP會被釋放到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的ALP含量升高。因此，通過檢測培養(yǎng)基中ALP含量的變化，可以間接地反映Caco-2細(xì)胞的完整性[33]。由圖5可知，受試菌588、658、928和929細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性均低于對照組，且與對照菌LGG細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性無顯著差異（P＞0.05），表明所選受試菌與LGG均對Caco-2細(xì)胞膜完整性有保護作用。而與鼠傷寒沙門氏菌相比，受試菌588、658、928和929均顯著降低了Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALP活性，表明受試菌抑制了鼠傷寒沙門氏菌引起的Caco-2細(xì)胞膜損傷，對Caco-2細(xì)胞具有一定的保護作用。

圖5 分離菌株對Caco-2細(xì)胞膜的保護作用Fig.5 Protective effect of isolated strains on Caco-2 cell membrane

2.7 菌株安全性評價

益生菌對于某些人群（例如免疫系統(tǒng)受損的人，孕婦和兒童等）或者某些情況（例如過敏反應(yīng)或藥物相互作用）可能存在潛在的風(fēng)險，因此在益生菌被推廣和使用之前，需要進行溶血性、明膠酶活性和藥敏性等安全性評價。由表2可知，受試菌并未表現(xiàn)出α和β溶血作用和明膠酶活性，而金黃色葡萄球菌表現(xiàn)β溶血作用和明膠酶活性，這一結(jié)果先前的研究結(jié)果[34]一致。如果菌株具有溶血性，它們可能會破壞人體內(nèi)的紅細(xì)胞，導(dǎo)致溶血性貧血等問題，而產(chǎn)生明膠酶的菌株可能通過水解結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)成分使致病菌侵入宿主腸道黏膜[35]。由表3可知，受試菌對20 種常見抗生素的敏感性存在差異，所有菌株對丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素均不敏感，且對青霉素、羧芐西林、哌拉西林和頭孢唑啉表現(xiàn)出中等敏感性，這與LGG相比表現(xiàn)出一致的敏感性。此外，菌株588、658、928和929對大多數(shù)常用的抗生素敏感，這表明它們具有成為益生菌的潛力。

表2 菌株溶血性測試結(jié)果Table 2 Hemolytic activity and gelatinase activity of isolated strains

2.8 菌株對RBL-2H3細(xì)胞中β-HEX釋放的抑制作用

β-HEX是一種在肥大細(xì)胞中預(yù)先合成的化合物，在正常狀態(tài)下體液中檢測不到。只有身體處于過敏狀態(tài)時肥大細(xì)胞才能脫顆粒，并隨后釋放β-HEX。研究表明，肥大細(xì)胞脫顆粒時釋放的β-HEX與過敏相關(guān)活性物質(zhì)的釋放呈正相關(guān)，包括IL-4、TNF-α和HIS等[36]。因此，通過測定β-HEX的釋放率，并將其作為肥大細(xì)胞脫顆粒的一個衡量標(biāo)準(zhǔn)，以確定所選菌株是否影響anti-DNPIgE/DNP-HSA刺激RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒程度。由圖6可知，所有受試菌均對β-HEX的釋放有一定抑制作用（（18.81±1.86）%～（47.30±0.91）%），其中受試菌588對β-HEX釋放的抑制率最大，為（47.30±0.91）%。這種抑制作用表明菌株代謝產(chǎn)物可能具有抗過敏特異性。為了評估這一結(jié)果的可靠性，選擇這4 株受試菌進行可靠性驗證。

圖6 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HEX的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of isolated strains on β-HEX release from RBL-2H3 cells

2.9 菌株對RBL-2H3細(xì)胞中HIS、IL-4和TNF-α釋放抑制作用

HIS是人體處于過敏狀態(tài)時肥大細(xì)胞釋放的最主要的的化學(xué)介質(zhì)之一，是引起組織水腫、瘙癢、呼吸困難，甚至引起過敏性休克的主要原因[37]。因此，通過分析菌株對RBL-2H3細(xì)胞HIS釋放的影響可以評估菌株的抗過敏活性。如圖7所示，與N組相比，所有的受試菌均顯著降低了HIS釋放水平（P＜0.05），其中菌株929降低的HIS釋放水平最顯著，降低至5.65 ng/mL，表明受試菌具有緩解過敏反應(yīng)的潛力。

圖7 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放HIS的影響Fig.7 Effects of isolated strains on the release of HIS from RBL-2H3 cells

在I型過敏反應(yīng)中，肥大細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4具有關(guān)鍵作用，它是一種重要的細(xì)胞因子，主要促進Th2細(xì)胞的分化與激活，有助于其產(chǎn)生特異性IgE抗體，從而增強對抗原的敏感性[38]。此外，IL-4還能促進肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長與活化，進一步加劇過敏反應(yīng)中的炎癥和免疫應(yīng)答。如圖8所示，C組和N組之間IL-4的分泌水平有顯著差異（P＜0.05），且N組的分泌水平高于C組，表明造模成功。與N組（83.06 pg/mL）相比，所選菌株均顯著降低了RBL-2H3細(xì)胞的IL-4的釋放水平。其中，菌株929的IL-4釋放水平下降最為顯著，降低至33.45 pg/mL。

圖8 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放IL-4的影響Fig.8 Effects of isolated strains on the release of IL-4 from RBL-2H3 cells

TNF-α是一種多功能炎性細(xì)胞因子，對炎癥反應(yīng)具有重要作用。TNF-α可以促進炎癥細(xì)胞的遷移與活化，增加血管通透性，加劇組織水腫，并通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進一步放大并維持超敏反應(yīng)中的炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致過敏癥狀的發(fā)生和持續(xù)[39]。由圖9可知，N組TNF-α釋放量顯著高于C組，表明模型建立成功。與N組相比，所選受試菌均降低了RBL-2H3細(xì)胞釋放TNF-α的水平，尤其是菌株929處理的RBL-2H3細(xì)胞，其TNF-α釋放量降低至221.48 pg/mL。菌株658和928對RBL-2H3的TNF-α釋放抑制無顯著差異，TNF-α釋放量分別為336.30 pg/mL和339.56 pg/mL。這些結(jié)果表明4 株受試菌可能通過抑制RBL-2H3細(xì)胞中HIS和炎癥因子的釋放從而起到緩解過敏癥狀的作用。

圖9 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放TNF-α的影響Fig.9 Effects of isolated strains on the release of TNF-α from RBL-2H3 cells

2.10 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

將所篩選的菌株進行16S rDNA測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，鑒定結(jié)果如圖10所示，可以看出該4 株菌分別屬于植物乳桿菌（929、928）、發(fā)酵乳桿菌（658）和副干酪乳桿菌（588）。

圖10 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of isolated strains

3 結(jié)論

本研究通過益生菌特性體外評價和RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒抑制實驗，從發(fā)酵蔬菜中篩選出具有抗過敏潛活性的益生菌。結(jié)果表明，分離出的50 株菌中4 株表現(xiàn)出耐酸和耐膽鹽的能力。與菌株LGG相比，這4 株菌株均具備良好的抗逆性、抗菌性、表面特性和對Caco-2細(xì)胞的黏附性。大量研究證明LGG具有廣泛的益生功能，特別是在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增強黏膜屏障功能以及與病原體競爭等方面表現(xiàn)出明顯的益生效應(yīng)[40-41]，已實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。本實驗以LGG為對照菌株，有助于更準(zhǔn)確地判斷篩選菌株的潛在益生功能及其機理。4 株新篩選菌株通過安全性評價和16S rDNA鑒定初步判定為安全的菌株。同時，這4 株菌株均對RBL-2H3細(xì)胞β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α等炎癥因子的釋放具有明顯抑制作用，其中菌株929最為突出。這一結(jié)果不僅突顯了所選益生菌在調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞過敏反應(yīng)中的潛在功效，還通過與LGG對比，增強了新菌株作為潛在益生菌源的合理性和可信度。