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        基于RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒抑制作用的體外抗過敏活性益生菌的篩選及鑒定

        2024-04-08 02:41:12秦雙霞郝慧超鄧放明趙玲艷
        食品科學(xué) 2024年6期
        關(guān)鍵詞:懸液益生菌菌株

        馬 丁,秦雙霞,郝慧超,鄧放明,2,*,趙玲艷,2,*

        (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長沙現(xiàn)代食品創(chuàng)新研究院,湖南 長沙 410128)

        過敏是由免疫系統(tǒng)紊亂和超敏反應(yīng)引起的炎癥性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì),過敏的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,成為全球健康領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)之一[2]。目前,過敏尚無有效的治療方法,患者只能依靠藥物緩解過敏性疾病,或避免接觸環(huán)境和食物中的過敏原。由于藥物存在一定的副作用,同時致使過敏反應(yīng)的過敏原難以確定,導(dǎo)致過敏癥難以治療[3]。過敏反應(yīng)根據(jù)其機(jī)理可分為I、II、III、IV型,絕大部分過敏疾病與I型過敏反應(yīng)相關(guān)[4]。I型過敏反應(yīng)又稱即時性過敏反應(yīng),癥狀在接觸過敏原后幾小時內(nèi)出現(xiàn)[5]。隨著過敏反應(yīng)的發(fā)生體內(nèi)會產(chǎn)生免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)以消除過敏原。IgE與肥大細(xì)胞表面的高親和力IgE受體(highaffinity IgE receptor,F(xiàn)cεRI)結(jié)合,并導(dǎo)致大量的化學(xué)介質(zhì)(如組胺(histamine,HIS)和白三烯)釋放到細(xì)胞外,這一過程稱為“脫顆?!盵6-7]。所釋放的化學(xué)介質(zhì)導(dǎo)致組織產(chǎn)生過敏的癥狀。因此,抑制IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒能有效的預(yù)防和治療過敏性疾病。

        益生菌被定義為對宿主提供健康益處的活的微生物。近年來,益生菌已被報(bào)道具有各種生理作用,對各種疾病如胃腸道疾病、代謝紊亂、血清膽固醇升高、腫瘤和過敏等具有有益作用。Wu等[8]研究了鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosusGG,LGG)對卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏的哮喘小鼠的影響。研究結(jié)果表明,LGG可以降低過敏小鼠的輔助T細(xì)胞2(T helper 2,Th2)的反應(yīng),改善受損的腸上皮屏障功能。Song等[9]證實(shí)了植物乳桿菌L67能夠抑制暴露于雙酚A的RBL-2H3細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá),以及鎘處理后的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。此外,研究發(fā)現(xiàn),益生菌產(chǎn)生有益作用的成分主要來自其細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)和細(xì)胞代謝成分,如脂磷壁酸、短鏈脂肪酸、胞外多醣、遺傳物質(zhì)、多肽、有機(jī)酸等物質(zhì)[10-12]。這些研究表明,益生菌是一種預(yù)防和治療過敏的新方法。因此,本研究通過體外抗逆性、黏附性、抑菌性、體外安全性4 個指標(biāo)對菌株益生特性進(jìn)行評價(jià),然后通過RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)篩選具有抗過敏活性的益生菌,并進(jìn)行鑒定,旨在為菌種資源的綜合利用和益生菌抗過敏活性的研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 19115)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103)、Caco-2細(xì)胞(ATCC HTB-37)美國典型培養(yǎng)物保藏中心;大腸桿菌(CGMCC 9181)中國普通微生物菌種保藏管理中心。

        血平板、生物胺試劑盒、MRS肉湯、明膠培養(yǎng)基、瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、牛膽鹽等 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胃蛋白酶(3 000~3 500 U/g)、?;悄扄}北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶(≥50 000 U/g)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗生素試劑盒 杭州微生物試劑有限公司;24、96 孔板 無錫耐思生命科技股份有限公司;抗-二硝基苯酚(anti-dinitrophenol,anti-DNP)IgE、二硝基苯基化人血清白蛋白(dinitrophenylated human serum albumin,DNP-HSA)西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;HIS、白介素-4(interleukin 4,IL-4)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor α,TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(96 T)上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司;細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、針式濾菌器 默克投資(中國)有限公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物 上海派森諾生物科技股份有限公司;D4030A dNTP、DRR20AM TaKaRa LATaqTM聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        PHS-2F pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;全套精密移液槍 艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司;SQ810C自動高壓蒸汽滅菌器 重慶雅瑪拓科技有限公司;YP-B10002電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司;HCB-1300V潔凈工作臺 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司;CX31光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;ULTS1368超低溫冰箱、Heraeus MultifugeX1R高速冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SPL250生化培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;Spark多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;MNT-150游標(biāo)卡尺 上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司;UV-1801分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 乳酸菌的分離、菌懸液和發(fā)酵上清液的制備

        乳酸菌的分離:發(fā)酵蔬菜樣本以10 倍梯度稀釋,涂布于含0.5 g/100 mL CaCO3的MRS固體平板上,并在37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后,選取具乳酸菌特征、溶鈣圈及革蘭氏染色陽性菌落進(jìn)行純化處理。純化菌株需編號并于4 ℃冰箱中保存以備后續(xù)使用。

        菌懸液的制備:選取菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h并進(jìn)行2 代培養(yǎng)。取出菌液在4 ℃、9 800×g條件下離心3 min,棄上清液保留菌體。用10 mL生理鹽水清洗菌體兩次,重復(fù)離心并棄去上清液。用生理鹽水懸浮菌體,檢測OD600nm,若低于0.8則增加菌體,高于0.8則稀釋,直至達(dá)0.8。最后,密封良好后于4 ℃冰箱貯存。

        發(fā)酵上清液的制備:選取菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基,然后在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行兩代培養(yǎng)以確保菌株充分生長。培養(yǎng)完畢后,將菌液在4 ℃、9 800×g離心3 min,小心倒出上清液轉(zhuǎn)至新離心管。用濾菌器去除殘菌,得清液。再用無菌NaOH溶液將上清液調(diào)至中性pH值,持續(xù)檢測以確保范圍。調(diào)整后,將上清液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的無菌試劑瓶中,并貯存于4 ℃冰箱備用。

        1.3.2 耐酸和耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

        在菌株經(jīng)過兩代活化后,選擇最后一代培養(yǎng)12 h的菌株進(jìn)行接種。對于每個待測菌株,分別以3%接種量接種到兩種不同的MRS液體培養(yǎng)基中:一種為調(diào)整至pH 2的MRS液體培養(yǎng)基;另一種為含有3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基。隨后將接種好的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱,在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。將兩種培養(yǎng)基中均呈渾濁狀態(tài)的菌株選為耐酸和耐膽鹽的候選菌株。記錄呈渾濁狀態(tài)的菌株編號。

        1.3.3 模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)

        模擬胃液制備:通過在磷酸緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)(pH 2.0)中混合胃蛋白酶(0.3 mg/mL),然后通過針式濾菌器過濾對PBS-胃蛋白酶混合物進(jìn)行無菌處理制備。模擬腸液制備:在PBS(pH 6.8)中加入胰蛋白酶(0.1 mg/mL),然后通過針式濾菌器對PBS-胰蛋白酶混合物進(jìn)行無菌處理。將菌懸液以1%接種量分別接種到模擬胃液或模擬腸液中,37 ℃培養(yǎng)3 h后,通過平板計(jì)數(shù)確定存活細(xì)胞的數(shù)量。菌株存活率計(jì)算如式(1)所示:

        式中:A0為0 h活菌數(shù)量的對數(shù)值;A1為3 h活菌數(shù)量的對數(shù)值。

        1.3.4 抗菌活性測定

        抗菌活性采用牛津杯法進(jìn)行測定,以金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 19115)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)、大腸桿菌(CGMCC 9181)為指示菌株。

        1.3.5 菌株表面特性測定

        1.3.5.1 疏水性

        通過測量微生物對乙酸乙酯和氯仿的親和力評估。將1 mL乙酸乙酯和1 mL氯仿分別加入到3 mL菌懸液中,并用渦旋混合儀振蕩混合。然后,水相和有機(jī)相在室溫分離30 min。去除水相,并測定OD600nm,以LGG為對照菌株。其疏水性計(jì)算如式(2)所示:

        式中:A0為初始菌懸液的OD600nm;A1為有機(jī)相的OD600nm。

        1.3.5.2 自聚集能力

        將菌懸液渦旋10 s,隨后室溫孵育5 h,并測定新的OD600nm,以LGG為對照菌株。其自聚集能力計(jì)算如式(3)所示:

        式中:A0為初始菌懸液的OD600nm;A1為處理5 h的OD600nm。

        1.3.5.2 共聚集能力

        將等體積待測菌菌懸液和致病菌菌懸液的濃度均調(diào)整為1×108CFU/mL,同時制備同濃度LGG菌懸液作對照。將待測菌混合單核細(xì)胞增生李斯特菌與大腸桿菌,渦旋混合10 s,孵育5 h觀察共聚集。結(jié)束后,輕取上層懸液放入無菌試管,避免擾動共聚集細(xì)胞。最后測定OD600nm。其共聚集能力計(jì)算如式(4)所示:

        式中:A1為受試菌與致病菌菌懸液混合5 h后的OD600nm;A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨(dú)處理5 h的OD600nm。

        1.3.6 Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

        1.3.6.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

        從液氮中解凍Caco-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)瓶中,并加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。每2 d更換一次培養(yǎng)基,保持無菌操作。細(xì)胞融合度為80%~90%時,用PBS洗滌,0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化脫落。停止消化后,轉(zhuǎn)移到無菌離心管離心收集,棄上清液,用新DMEM重新懸浮細(xì)胞。適當(dāng)比例分配到新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),3 次傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.3.6.2 Caco-2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

        在24 孔板中,將Caco-2細(xì)胞懸液(5×104個/mL)250 μL培養(yǎng)至單層,使用無菌PBS洗滌兩次。將菌懸液添加并孵育2 h以實(shí)現(xiàn)相互作用。去除懸液,用無菌PBS液沖洗3 次,清除未附著菌體。然后以平板計(jì)數(shù)法測量細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)量,評估菌株黏附性。黏附率計(jì)算如式(5)所示:

        1.3.6.3 對Caco-2細(xì)胞ALP活性的測定

        參照Lv Jia等[13]的方法,將長至單層Caco-2細(xì)胞與3 個處理組(鼠傷寒沙門氏菌(S)、受試菌、受試菌+S)和1 個僅用完全培養(yǎng)基處理的對照組在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育后,在4 ℃條件下以1 500 ×g離心10 min后收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液,使用ALP試劑盒測定收集的上清液中細(xì)胞外ALP的活性。

        1.3.7 安全性評價(jià)

        1.3.7.1 溶血性

        參考文獻(xiàn)[14]評估菌株的溶血性。將已經(jīng)純化的菌株涂抹在含有體積分?jǐn)?shù)5%綿羊血的血瓊脂平板上,每個菌株在單獨(dú)的平板上進(jìn)行涂抹。在涂抹過程中,確保菌株分散均勻且不重疊。完成涂抹后,將平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h,之后從培養(yǎng)箱中取出血瓊脂平板,觀察平板上菌落的溶血情況。

        1.3.7.2 明膠酶活性

        將活化好的受試菌用接種針穿刺接種到明膠培養(yǎng)基中,并在37 ℃培養(yǎng)24 h。然后將接種物于4 ℃放置30 min,待降溫后取出觀察,若處于溶解狀態(tài),則表示明膠液化實(shí)驗(yàn)為陽性;若呈凝固且不溶解,則結(jié)果為陰性。

        1.3.7.3 抗生素敏感性

        采用包含20 種抗生素的藥敏試劑盒測定分離菌株對抗生素的敏感性。

        1.3.8 RBL-2H3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

        1.3.8.1 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)

        從液氮中取出RBL-2H3細(xì)胞,37 ℃水浴解凍,避免振蕩和光照。解凍后迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入含20%胎牛血清的37 ℃ DMEM,濃度適中,在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng),每2 d更換培養(yǎng)基。融合度80%~90%時進(jìn)行傳代:無菌PBS沖洗,0.25% Trypsin-EDTA消化,加入含10%胎牛血清的DMEM中和。轉(zhuǎn)至無菌離心管,1 000×g離心5 min,棄上清液,用新DMEM重懸浮細(xì)胞。細(xì)胞液分到新瓶,繼續(xù)培養(yǎng)。進(jìn)行3 次傳代后開始實(shí)驗(yàn)。

        1.3.8.2β-己糖胺酶(β-hexosaminidase,β-HEX)釋放抑制率測定

        參照Ding Yuanyuan等[15]的方法,將96 孔板中的RBL-2H3細(xì)胞(2×105個/mL)與200 μL 0.5 μg/mL Anti-DNPIgE培養(yǎng)過夜。棄去上清液,用PBS洗滌細(xì)胞3 次,用200 μL發(fā)酵上清液處理致敏的RBL-2H3細(xì)胞1 h。棄去上清液,用PBS洗滌細(xì)胞3 次,然后用100 mL 1 μg/mL DNP-HSA作為抗原刺激20 min。然后將30 μL上清液轉(zhuǎn)移到96 孔板中,與70 mL 1.3 mg/mL 4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖,在pH 4.5、0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中37 ℃孵育90 min。加入100 μL 0.4 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖溶液停止反應(yīng)。利用多功能酶標(biāo)儀在405 nm波長處測定吸光度。對β-HEX釋放的抑制率計(jì)算如式(6)所示:

        式中:C為對照組吸光度;T為實(shí)驗(yàn)組吸光度;N為正常組吸光度;對照組(C)為Anti-DNP-IgE(+)、DNP-HSA(+)、測試樣品(-);實(shí)驗(yàn)組(T)為Anti-DNP-IgE(+)、DNP-HSA(+)、測試樣品(+);正常組(N)為Anti-DNP-IgE(-)、DNPHSA(-)、測試樣品(-)。其中,“+”“-”分別表示添加和不添加該物質(zhì)。

        1.3.8.3 細(xì)胞因子HIS、IL-4和TNF-α的測定

        用3 個處理組分別處理致敏的RBL-2H3細(xì)胞1 h。棄去上清液,用PBS洗滌細(xì)胞3 次,然后用100 mL 1 μg/mL DNP-HSA作為抗原刺激20 min。在DNP-HSA刺激細(xì)胞1 h后,分別使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定HIS、IL-4和TNF-α,分析RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)基中HIS、IL-4和TNF-α的釋放情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求3 個處理組分組如下:模型組(N)為Anti-DNP-IgE(+)、DNP-HSA(+)、測試樣品(-);實(shí)驗(yàn)組(T)為Anti-DNP-IgE(+)、DNP-HSA(+)、測試樣品(+);空白組(C)為Anti-DNP-IgE(-)、DNP-HSA(-)、測試樣品(-)。

        1.3.9 16S rDNA菌株鑒定

        參照Cui Yalei等[16]的方法,使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA,并檢測純度、濃度以確保PCR需求。PCR混合液由Taq緩沖液、Taq酶、上下引物、樣品DNA、dNTPs和雙蒸餾水按比例配制。在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、75 ℃延伸1.5 min,30 個循環(huán),最后進(jìn)行最終延伸。然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,送至上海派森諾生物科技有限公司測序。接收測序結(jié)果后,使用Chromas軟件分析基因序列,去除引物序列。最后,利用BLAST算法在NCBI數(shù)據(jù)庫比對16S rDNA序列,并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

        使用Excel 2023軟件整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并計(jì)算統(tǒng)計(jì)參數(shù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA),如有顯著差異(P<0.05),進(jìn)行最小顯著差異多重比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示。利用Origin 2022軟件繪制圖表。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株分離及耐酸和耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        通過MRS培養(yǎng)基分離和革蘭氏染色,從不同地區(qū)采集的發(fā)酵蔬菜中分離出50 株革蘭氏陽性菌株,其中菌株662、722、928和929在pH 2和含3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基的環(huán)境中均表現(xiàn)出良好耐受性,對這4 株菌進(jìn)行下一步研究。

        2.2 菌株對模擬胃腸液的耐受性

        益生菌在胃腸液中存活,并能夠以足夠的數(shù)量到達(dá)腸道,才能對宿主產(chǎn)生健康益處[17]。因此,通過體外模擬胃腸道環(huán)境篩選高存活率的益生菌具有重要意義。由圖1可知,所有菌株在模擬胃腸液中表現(xiàn)出較高存活率,均大于60%,其中菌株929在模擬胃液和腸液中的存活率分別為(84.47±1.27)%和(81.01±1.46)%,總體顯著高于其他菌株(P<0.05)。與對照菌株LGG相比,菌株928也具有較好耐受性,與Xu Yihan等[18]從發(fā)酵食品和Reuben等[19]從乳制品中分離出的乳酸菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這表明所選的菌株具有順利進(jìn)入人腸道的潛力,可以作為益生菌的候選菌株。

        2.3 菌株抗菌活性

        潛在的益生菌應(yīng)表現(xiàn)出抗菌活性,并通過抑制病原菌的生長和繁殖促進(jìn)胃腸道的健康[20-21]。如表1所示,所選菌株對5 株致病菌均有抑制作用,與對照菌株LGG相比,受試菌588、658和928對5 株致病菌的抑菌圈直徑均無顯著差異(P>0.05)。據(jù)報(bào)道,益生菌通過競爭性抑制和細(xì)胞外抑菌產(chǎn)物,包括有機(jī)酸、細(xì)菌素和過氧化氫等物質(zhì),從而抑制致病菌的生長。然而,抗菌活性取決于物種和菌株,不同的物種和不同的菌株表現(xiàn)出不同的抗菌活性[22-23]。

        表1 分離菌株抗菌活性Table 1 Antibacterial activities of isolated strains

        2.4 菌株表面特性

        自聚集與菌株在胃腸道中的附著和定植能力有關(guān)。從圖2 可以看出,由于菌株表面特異性,不同菌株間的自聚集能力差異顯著(P<0.05),其值在(13.71±0.36)%~(46.11±1.55)%之間,表明這些菌株在人腸道中具有潛在的黏附和定植能力。這一結(jié)果與Akman[24]和Mohammed[25]等的結(jié)果相似。此外,益生菌株與病原體的共同聚集促進(jìn)了對致病菌的黏附和清除[26]。與對照菌株LGG相比,菌株588和928對大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌均表現(xiàn)出接近或更高的共聚集能力,表明菌株對不同致病菌具有較強(qiáng)的共聚集能力。因此,所選的菌株可能是減少致病菌定植并預(yù)防感染的候選菌。

        圖2 分離菌株的聚集能力Fig.2 Aggregation capacity of isolated strains

        疏水性被認(rèn)為是反映益生菌對上皮細(xì)胞黏附能力的重要參考指標(biāo),具有高疏水性的益生菌具有更好的結(jié)合上皮細(xì)胞的能力[27]。由圖3可知,通過氯仿和乙酸乙酯兩種有機(jī)試劑處理,不同菌株間的疏水性差異顯著(P<0.05),但所有菌株在氯仿中的疏水性均高于65%,而受試菌對乙酸乙酯的疏水性在(24.63±1.55)%~(28.66±1.42)%之間,表明受試菌在氯仿中的疏水性較高。此外,與對照菌株LGG相比,受試菌在氯仿和乙酸乙酯中表現(xiàn)出相當(dāng)甚至更高的疏水性。據(jù)報(bào)道,親水和疏水的特性是由細(xì)菌表面的多糖和蛋白質(zhì)造成的[28]。所選菌株對堿性溶液(乙酸乙酯)表現(xiàn)出較弱的黏附性,這表明所選菌株表面可能呈現(xiàn)非Lewis酸性和較差的電子受體特性,而對酸性溶液(氯仿)的親和力較強(qiáng)表明所選菌株表面可能呈現(xiàn)Lewis酸性和較強(qiáng)的電子供體的特性[29]。

        圖3 分離菌株的疏水性Fig.3 Hydrophobicity of isolated strains

        綜上所述,所選菌株在自聚集、共聚集和疏水性方面的表現(xiàn)說明其具有黏附和定植能力,在抵御致病菌攻擊以及適應(yīng)不同化學(xué)環(huán)境方面有潛在優(yōu)勢。這些特性可能使其成為減少致病菌定植并預(yù)防感染的有效候選菌株,為未來益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供了有力支持。

        2.5 菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附結(jié)果

        益生菌對上皮細(xì)胞的黏附是在腸道定植的重要特性,它使益生菌菌株能夠在腸道中有效地增殖和競爭。此外,益生菌具有較高的黏附能力,可能會延長益生菌在胃腸道中的停留時間,從而增強(qiáng)其對宿主發(fā)揮積極益生作用的效果。Caco-2細(xì)胞是來自于人類腸道黏膜的結(jié)腸癌細(xì)胞,其細(xì)胞模型常被用于確定益生菌的競爭性抑制、遷移、黏附能力[30]。由圖4可知,菌株588、928和929表現(xiàn)出良好的黏附能力,均與對照組益生菌LGG無顯著性差異(P>0.05),而菌株658表現(xiàn)出較低黏附能力,僅為(43.33±7.20)%。研究表明,益生菌的黏附是菌株的表面成分與腸道細(xì)胞表面之間的相互作用,黏附能力與各種不同的表面成分有關(guān),包括脂磷壁酸、多糖和蛋白質(zhì)[31-32]。

        圖4 分離菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附能力Fig.4 Adhesion capacity of isolated stains to Caco-2 cells

        2.6 菌株對Caco-2細(xì)胞膜完整性的保護(hù)作用

        ALP是一種存在于Caco-2細(xì)胞內(nèi)的酶類,當(dāng)Caco-2細(xì)胞膜受到損傷或缺乏完整性時,胞內(nèi)的ALP會被釋放到培養(yǎng)基中,導(dǎo)致培養(yǎng)基中的ALP含量升高。因此,通過檢測培養(yǎng)基中ALP含量的變化,可以間接地反映Caco-2細(xì)胞的完整性[33]。由圖5可知,受試菌588、658、928和929細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性均低于對照組,且與對照菌LGG細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性無顯著差異(P>0.05),表明所選受試菌與LGG均對Caco-2細(xì)胞膜完整性有保護(hù)作用。而與鼠傷寒沙門氏菌相比,受試菌588、658、928和929均顯著降低了Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALP活性,表明受試菌抑制了鼠傷寒沙門氏菌引起的Caco-2細(xì)胞膜損傷,對Caco-2細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

        圖5 分離菌株對Caco-2細(xì)胞膜的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of isolated strains on Caco-2 cell membrane

        2.7 菌株安全性評價(jià)

        益生菌對于某些人群(例如免疫系統(tǒng)受損的人,孕婦和兒童等)或者某些情況(例如過敏反應(yīng)或藥物相互作用)可能存在潛在的風(fēng)險(xiǎn),因此在益生菌被推廣和使用之前,需要進(jìn)行溶血性、明膠酶活性和藥敏性等安全性評價(jià)。由表2可知,受試菌并未表現(xiàn)出α和β溶血作用和明膠酶活性,而金黃色葡萄球菌表現(xiàn)β溶血作用和明膠酶活性,這一結(jié)果先前的研究結(jié)果[34]一致。如果菌株具有溶血性,它們可能會破壞人體內(nèi)的紅細(xì)胞,導(dǎo)致溶血性貧血等問題,而產(chǎn)生明膠酶的菌株可能通過水解結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)成分使致病菌侵入宿主腸道黏膜[35]。由表3可知,受試菌對20 種常見抗生素的敏感性存在差異,所有菌株對丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素均不敏感,且對青霉素、羧芐西林、哌拉西林和頭孢唑啉表現(xiàn)出中等敏感性,這與LGG相比表現(xiàn)出一致的敏感性。此外,菌株588、658、928和929對大多數(shù)常用的抗生素敏感,這表明它們具有成為益生菌的潛力。

        表2 菌株溶血性測試結(jié)果Table 2 Hemolytic activity and gelatinase activity of isolated strains

        2.8 菌株對RBL-2H3細(xì)胞中β-HEX釋放的抑制作用

        β-HEX是一種在肥大細(xì)胞中預(yù)先合成的化合物,在正常狀態(tài)下體液中檢測不到。只有身體處于過敏狀態(tài)時肥大細(xì)胞才能脫顆粒,并隨后釋放β-HEX。研究表明,肥大細(xì)胞脫顆粒時釋放的β-HEX與過敏相關(guān)活性物質(zhì)的釋放呈正相關(guān),包括IL-4、TNF-α和HIS等[36]。因此,通過測定β-HEX的釋放率,并將其作為肥大細(xì)胞脫顆粒的一個衡量標(biāo)準(zhǔn),以確定所選菌株是否影響anti-DNPIgE/DNP-HSA刺激RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒程度。由圖6可知,所有受試菌均對β-HEX的釋放有一定抑制作用((18.81±1.86)%~(47.30±0.91)%),其中受試菌588對β-HEX釋放的抑制率最大,為(47.30±0.91)%。這種抑制作用表明菌株代謝產(chǎn)物可能具有抗過敏特異性。為了評估這一結(jié)果的可靠性,選擇這4 株受試菌進(jìn)行可靠性驗(yàn)證。

        圖6 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HEX的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of isolated strains on β-HEX release from RBL-2H3 cells

        2.9 菌株對RBL-2H3細(xì)胞中HIS、IL-4和TNF-α釋放抑制作用

        HIS是人體處于過敏狀態(tài)時肥大細(xì)胞釋放的最主要的的化學(xué)介質(zhì)之一,是引起組織水腫、瘙癢、呼吸困難,甚至引起過敏性休克的主要原因[37]。因此,通過分析菌株對RBL-2H3細(xì)胞HIS釋放的影響可以評估菌株的抗過敏活性。如圖7所示,與N組相比,所有的受試菌均顯著降低了HIS釋放水平(P<0.05),其中菌株929降低的HIS釋放水平最顯著,降低至5.65 ng/mL,表明受試菌具有緩解過敏反應(yīng)的潛力。

        圖7 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放HIS的影響Fig.7 Effects of isolated strains on the release of HIS from RBL-2H3 cells

        在I型過敏反應(yīng)中,肥大細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4具有關(guān)鍵作用,它是一種重要的細(xì)胞因子,主要促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化與激活,有助于其產(chǎn)生特異性IgE抗體,從而增強(qiáng)對抗原的敏感性[38]。此外,IL-4還能促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長與活化,進(jìn)一步加劇過敏反應(yīng)中的炎癥和免疫應(yīng)答。如圖8所示,C組和N組之間IL-4的分泌水平有顯著差異(P<0.05),且N組的分泌水平高于C組,表明造模成功。與N組(83.06 pg/mL)相比,所選菌株均顯著降低了RBL-2H3細(xì)胞的IL-4的釋放水平。其中,菌株929的IL-4釋放水平下降最為顯著,降低至33.45 pg/mL。

        圖8 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放IL-4的影響Fig.8 Effects of isolated strains on the release of IL-4 from RBL-2H3 cells

        TNF-α是一種多功能炎性細(xì)胞因子,對炎癥反應(yīng)具有重要作用。TNF-α可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移與活化,增加血管通透性,加劇組織水腫,并通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,進(jìn)一步放大并維持超敏反應(yīng)中的炎癥和免疫反應(yīng),導(dǎo)致過敏癥狀的發(fā)生和持續(xù)[39]。由圖9可知,N組TNF-α釋放量顯著高于C組,表明模型建立成功。與N組相比,所選受試菌均降低了RBL-2H3細(xì)胞釋放TNF-α的水平,尤其是菌株929處理的RBL-2H3細(xì)胞,其TNF-α釋放量降低至221.48 pg/mL。菌株658和928對RBL-2H3的TNF-α釋放抑制無顯著差異,TNF-α釋放量分別為336.30 pg/mL和339.56 pg/mL。這些結(jié)果表明4 株受試菌可能通過抑制RBL-2H3細(xì)胞中HIS和炎癥因子的釋放從而起到緩解過敏癥狀的作用。

        圖9 分離菌株對RBL-2H3細(xì)胞釋放TNF-α的影響Fig.9 Effects of isolated strains on the release of TNF-α from RBL-2H3 cells

        2.10 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

        將所篩選的菌株進(jìn)行16S rDNA測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,鑒定結(jié)果如圖10所示,可以看出該4 株菌分別屬于植物乳桿菌(929、928)、發(fā)酵乳桿菌(658)和副干酪乳桿菌(588)。

        圖10 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of isolated strains

        3 結(jié)論

        本研究通過益生菌特性體外評價(jià)和RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒抑制實(shí)驗(yàn),從發(fā)酵蔬菜中篩選出具有抗過敏潛活性的益生菌。結(jié)果表明,分離出的50 株菌中4 株表現(xiàn)出耐酸和耐膽鹽的能力。與菌株LGG相比,這4 株菌株均具備良好的抗逆性、抗菌性、表面特性和對Caco-2細(xì)胞的黏附性。大量研究證明LGG具有廣泛的益生功能,特別是在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)黏膜屏障功能以及與病原體競爭等方面表現(xiàn)出明顯的益生效應(yīng)[40-41],已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以LGG為對照菌株,有助于更準(zhǔn)確地判斷篩選菌株的潛在益生功能及其機(jī)理。4 株新篩選菌株通過安全性評價(jià)和16S rDNA鑒定初步判定為安全的菌株。同時,這4 株菌株均對RBL-2H3細(xì)胞β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α等炎癥因子的釋放具有明顯抑制作用,其中菌株929最為突出。這一結(jié)果不僅突顯了所選益生菌在調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞過敏反應(yīng)中的潛在功效,還通過與LGG對比,增強(qiáng)了新菌株作為潛在益生菌源的合理性和可信度。

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