趙子馨,魏鈺蓉,李曉含,李 偉

(聊城大學(xué)東昌學(xué)院 化學(xué)與生物系,山東 聊城 252000)

0 引言

皮膚是人體最大的器官,作為四大菌庫之一,皮膚表面定殖著數(shù)以億計(jì)的微生物,稱為皮膚正常微生物群,可調(diào)節(jié)宿主先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)出的信號(hào),幫助宿主抵御外部病原菌的入侵[1-2]。痤瘡是一種最常見的發(fā)生于毛囊皮脂腺的慢性炎癥性損容性皮膚病,好發(fā)于面部,影響容貌,極易反復(fù)發(fā)生,已成為全球第八大常見病[3]。在痤瘡患者中,青少年發(fā)病率約為80%,20～30歲成年人患病率高達(dá)64%。據(jù)我國青春期人群統(tǒng)計(jì),約有95%的男性和85%的女性患過不同程度的尋常痤瘡,在某一時(shí)間會(huì)出現(xiàn)面部、頸部、背部和胸部的少數(shù)斑點(diǎn),部分患者發(fā)展為重型痤瘡或聚合型痤瘡,給患者留下嚴(yán)重的皮膚疤痕,產(chǎn)生嚴(yán)重的生理及心理影響[4-7]。

基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法具有特異性高、靈敏度強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),在生物學(xué)研究中具有重大意義。在檢測(cè)方法建立初期,提取高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA是后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行的保障[8]。為此尋找了一種不同于棉拭子[9]的采樣方法—鼻貼取樣,可以更好地將痤瘡毛囊內(nèi)部的微生物提取出來。目前常用的DNA提取方法主要包括各類試劑盒法、CTAB法、SDS法及CTAB NaCl法等[10-11]。而各種方法的簡便性、實(shí)用性、經(jīng)濟(jì)性等各不相同,本研究選取了兩種不同的DNA提取方法進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品來源。取樣對(duì)象為某大學(xué)的學(xué)生,年齡18～22歲,面部均患有不同程度的痤瘡,信息統(tǒng)計(jì)和樣本采集已征得本人同意。

試劑。DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)(美國貝克曼儀器有限公司生產(chǎn));Super GelRed TM核酸染料(蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司生產(chǎn));2×Taq Master Mix(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技有限公司生產(chǎn));溶菌酶、CTAB緩沖液、TE緩沖液、SDS、蛋白酶K、6×Loading Buffer(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn));DNA Marker D15000+2000(天根生化科技有限公司生產(chǎn));苯酚、氯仿、異戊醇(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。

儀器與設(shè)備。PCR儀(伯樂T100)(北京康普源科技有限公司生產(chǎn));超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Denovixs DS-11/Ds-11+)(北京倍輝科技有限公司生產(chǎn));QuickGel 6200凝膠成像系統(tǒng)(莫納生物科技有限公司生產(chǎn));優(yōu)普超純水儀(UPR-II-10T)(四川優(yōu)普超純科技有限公司生產(chǎn));臺(tái)式高速離心機(jī)(TG16-WS)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn));核酸電泳儀 (JY300C)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理

洗面奶潔面,用無菌干巾擦干面部水分,無菌水噴濕臉頰,再用無菌鑷子將鼻貼夾起貼在鼻子上,5～10 min待其完全干燥后用無菌鑷子緩慢去除鼻貼,再用微型手術(shù)鏟刀將鼻貼上的毛囊刮下放入2 mL離心管中。共取樣兩次。第一次在夏季取樣,能明顯看到鼻貼上的毛囊樣本,粘取效果好,采集了9個(gè)志愿者的毛囊樣本;第二次在冬季取樣,鼻貼上毛囊樣本的量明顯比夏季的少,粘取效果一般,采集了16個(gè)志愿者的毛囊樣本。樣本的具體處理過程如表1所示。

表1 樣本處理情況

1.2.2 DNA提取

CTAB提取法:參照刀筱芳等[12]的提取方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。將樣本用290 μL TE緩沖液浸洗。在離心管中加入10 μL 100 mg/mL的溶菌酶、30μL 100 g/L的SDS溶液、6 μL 10 mg/mL的蛋白酶K,渦旋振蕩器振蕩10 s,37 ℃溫育1 h。加入100 μL 5 mol/L的NaCl,混勻,再加入80 μL的CTAB/NaCl溶液(100 g/L CTAB /0.7 mol/L NaCl),充分混勻,65 ℃溫育10 min。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,體積比),蓋緊管蓋,輕柔地反復(fù)顛倒離心管,充分混勻,冰浴10 min。12 000 rpm離心10 min,小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一干凈的2 mL離心管。加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1,體積比),混勻,12 000 rpm離心5 min,小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一干凈的2 mL離心管。加入1/10體積的NaAc溶液,混勻,再加入2倍體積無水乙醇,混勻,12 000 rpm離心5 min,棄去上清液,用70%乙醇洗滌DNA沉淀,離心,棄去上清液。用50 μL TE緩沖液輕柔地溶解DNA沉淀,加入10 mg/mL的RNaseA混勻,4 ℃保存。

試劑盒法:將樣本置于1.5 mL離心管中,加入150 μL緩沖液ATL和15 μL蛋白酶K,渦旋混合,56 ℃孵育30 min。渦旋15 s,加入150 μL BufferAL,渦旋10 s,加入150 μL 乙醇(96%～100%),渦旋混勻。移入2 mL收集管中的DNeasyMini旋轉(zhuǎn)柱中,8000 rpm離心1 min,丟棄流通液和收集管。將DNeasyMini旋轉(zhuǎn)柱放在一個(gè)新的2 mL收集管中,添加300 μL BufferAW1,以8000 rpm的速度離心1 min。丟棄流通和收集管。DNeasyMini旋轉(zhuǎn)柱放在新的2 mL收集管中,添加300 μL BufferAW2,并以14 000 rpm離心3 min。小心移出DNeasyMini旋轉(zhuǎn)柱,避免柱與流通液接觸,將其放在干凈的2 mL微量離心管中,將150 μL BufferAE直接吸到DNeasy膜上。室溫下孵育1 min,以8000 rpm離心1 min以洗脫,得到洗脫液Ⅰ。用新的離心管及100 μL BufferAE重復(fù)一次洗脫步驟得到洗脫液Ⅱ,將其合并到洗脫液Ⅰ,得到DNA提取液。

1.2.3 樣品DNA濃度測(cè)定

超微量測(cè)定儀測(cè)量DNA含量:使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Denovixs DS-11/Ds-11+)測(cè)定樣本原液中DNA的濃度和純度。

PCR擴(kuò)增和凝膠電泳成像:采用的通用引物序列為338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。 PCR反應(yīng)采用20 μL體系,包括2xTaqMasterMix溶液10 μL、上游引物338F 2 μL、下游引物806R 2 μL、DNA提取樣本2 μL、滅菌的ddH2O 4 μL。設(shè)置擴(kuò)增條件95 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s共35個(gè)循環(huán),最后一個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間為10 min。擴(kuò)增結(jié)束后將PCR管取出,用TAE電泳緩沖液配制10 g/L的瓊脂糖膠,待膠完全凝固后,依次上樣,記錄好上樣順序。設(shè)置電壓120 V,時(shí)間25 min或根據(jù)指示劑遷移位置判斷是否中止電泳。電泳結(jié)束后用Super GelRed染色液浸沒,室溫孵育30 min,將其取出進(jìn)行凝膠成像,觀察條帶明暗程度并保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的純度

通過超微量測(cè)定儀測(cè)定兩種提取方法的DNA純度,見表2、表3。A260/A280比值表示蛋白質(zhì)和酚類的去除情況,純度較好的比值為1.8左右,比值較低說明受到蛋白質(zhì)(芳香族)或酚類物質(zhì)的污染。夏季樣本中CTAB法的平均比值為1.56,試劑盒法的平均比值為0.85。冬季樣本中CTAB法的平均比值為0.96,試劑盒法的平均比值為 0.42。A260/A230比值表示糖類、鹽分等的去除情況,純度較好的比值為2.0左右,若比值小于2.0,說明樣品中糖類或有機(jī)溶劑含量較高。夏季樣本中CTAB法平均比值為1.86,試劑盒法的平均比值為0.40。冬季樣本中CTAB法平均比值為1.44,試劑盒法的平均比值為0.36?？傮w來看,在夏季用CTAB法提取樣本得到的DNA純度更高。

表2 兩種方法提取的DNA純度(夏季批)

表3 兩種方法提取的DNA純度(冬季批)

2.2 DNA得率

通過超微量測(cè)定儀測(cè)定兩種提取方法的DNA得率見表4、表5。相同季節(jié)進(jìn)行比較都是CTAB法提取的DNA得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試劑盒法,且在夏季用CTAB法所提取出來的DNA得率最高。導(dǎo)致試劑盒方法得率低的原因可能有兩點(diǎn):①CTAB法相較于試劑盒的實(shí)際得率原本就高。②在DNA提取過程中,采用蛋白酶K、洗滌劑和有機(jī)萃取的提取步驟,導(dǎo)致DNA得率降低,兩種方法都通過加入蛋白酶K來去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)和雜質(zhì),且試劑盒方法加入的蛋白酶K含量是CTAB方法的兩倍,故有可能對(duì)DNA得率產(chǎn)生較大的影響。從DNA得率來看,在夏季用 CTAB方法提取的DNA質(zhì)量較好,得率較高。

表4 兩種方法提取的DNA得率(夏季批)

表5 兩種方法提取的DNA得率(冬季批)

2.3 PCR和凝膠電泳成像

PCR擴(kuò)增對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高,因此PCR擴(kuò)增成功率成為判定DNA質(zhì)量的重要依據(jù)之一。以樣本DNA作為模板,用上述一對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示,均可得到明顯的電泳條帶,無空白條帶。但不同提取方法間條帶明暗程度差異較大,5～8和13～16泳道為試劑盒法提取,DNA純度較好,擴(kuò)增條帶較亮。1～4和9～12泳道為CTAB法提取,DNA純度較差,擴(kuò)增條帶較暗。

注:M:DL15000+2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。

利用成像分析軟件GelAnalyzer進(jìn)一步分析,見圖2。其中5～8與13～16泳道DNA得率(Cal. Volume)明顯高于1～4和9～12泳道,說明從PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳成像來看,試劑盒法對(duì)毛囊微生物的提取效果更好。

注:白色:CTAB法;黑色:試劑盒法

2.4 結(jié)果及分析

由于在取樣過程中不可避免會(huì)粘取面部表皮細(xì)胞,故提取的DNA樣本中并不完全是皮膚毛囊微生物的DNA,也會(huì)摻雜部分人體皮膚細(xì)胞中的DNA。實(shí)驗(yàn)中所加引物是針對(duì)細(xì)菌DNA擴(kuò)增的引物,由此可推斷出CTAB法中DNA得率較高的原因可能是受樣本中人體表皮細(xì)胞DNA的影響。

關(guān)于痤瘡毛囊微生物DNA提取的2種方法,根據(jù)上述對(duì)A260/A280和 A260/A230兩個(gè)比值與DNA濃度的測(cè)定結(jié)果,由PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)各DNA提取方法進(jìn)行綜合分析,對(duì)提取過程的簡易程度等因素進(jìn)行總結(jié),各方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表6。

表6 兩種DNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

3 結(jié)論

通過DNA純度、DNA得率、PCR擴(kuò)增成功率比較了兩種用于痤瘡毛囊微生物DNA的提取方法。結(jié)果表明,CTAB法成本低,DNA純度及濃度較好,但耗時(shí)較長;試劑盒法成本較高,但相對(duì)耗時(shí)短,操作簡單,且PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳成像更清晰。針對(duì)痤瘡毛囊微生物的研究特點(diǎn),利用試劑盒法提取更有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。從提取季節(jié)來看,夏季更有利于痤瘡毛囊微生物的提取,原因可能是夏季氣溫高,面部毛孔舒張,用鼻貼取樣的方法更易把毛囊微生物粘取出來。