曹 焜,孫宇峰,趙 越,朱 浩,王 盼,孫凱旋,王曉楠

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院,黑龍江 大慶 163319)

0 引言

蛋白激酶是植物中最大的蛋白質(zhì)家族之一,在擬南芥和水稻中研究較為深入[1]。其中,類受體激酶(receptor-like kinases,RLKs)是最大的一類蛋白激酶,目前已發(fā)現(xiàn)了25 700多個成員,在植物信號識別、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用[2]。RLK屬于一種跨膜蛋白,可將胞外的信號傳入胞內(nèi)并參與細(xì)胞的生長發(fā)育過程[3]。因為胞外環(huán)境是復(fù)雜多變的,使得RLK的胞外結(jié)構(gòu)域也十分復(fù)雜[4]。其中,富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)屬于RLK的最大一個亞家族,凝集素受體樣激酶(LEC),是RLK的第二大群體,在逆境脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[5]。

非生物脅迫對植物的生長發(fā)育造成非常不利的影響。黑龍江省約有66.7萬公頃鹽堿地,且呈逐年遞增趨勢,嚴(yán)重影響糧食、牧草產(chǎn)量,進(jìn)而限制了農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。工業(yè)大麻適應(yīng)性廣,具有較強的鹽堿耐受性,隨著供給側(cè)結(jié)構(gòu)改革和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整,工業(yè)大麻種植向鹽堿地轉(zhuǎn)移已成為趨勢。目前,關(guān)于工業(yè)大麻鹽堿耐受性的研究大多集中在種子萌發(fā)、生理生化特性和基因轉(zhuǎn)錄等方面,而信號感知和傳遞方面的研究較少。本研究采用生物信息學(xué)方法,對工業(yè)大麻RLK家族的基因結(jié)構(gòu)、注釋信息等進(jìn)行分析,豐富了RLK基因家族的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因功能研究,為工業(yè)大麻的分子育種提供基因資源及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以鹽堿耐受型品種火麻一號(品種1)和鹽堿敏感型品種金刀15(品種2)為試驗材料(種子均由由黑龍江省科學(xué)院大慶分院提供)。待幼苗生長到3對真葉時,在培養(yǎng)液中加入NaHCO3,對照組不加NaHCO3。分別在脅迫0 h和12 h采集長勢一致的幼苗根部樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,從測序結(jié)果中篩選工業(yè)大麻RLK基因家族候選序列。

1.2 分析方法

轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測:利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫plantTFDB對候選基因進(jìn)行篩選和注釋。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫和MEME(http://meme-suite.org/)分析保守結(jié)構(gòu)與motif。利用TBtools軟件對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

在NaHCO3脅迫下,獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析(圖1A),共預(yù)測165個轉(zhuǎn)錄因子家族的1010個轉(zhuǎn)錄因子,包括RLK-Pelle、NAC、MYB、C2H2、TRAF、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族,其中RLK基因家族成員數(shù)量最多。進(jìn)一步對RLK基因家族的成員進(jìn)行分析(圖1B),從63個基因中預(yù)測到25個RLK亞家族的轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 NaHCO3脅迫下工業(yè)大麻中轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測Fig.1 Prediction of transcription factors in industrial hemp under NaHCO3 stress

2.2 工業(yè)大麻RLK結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)親緣關(guān)系將工業(yè)大麻RLK蛋白分成12組(圖2),成員最多的為IV亞家族,包括17個成員;其次是VI和II亞家族,均包括11個成員;而I、V和XII亞家族成員最少,僅包含1個成員。工業(yè)大麻RLK蛋白鑒定得到的20個motif中(圖2和圖3),長度在15～50,motif7的保守性得分最高,其中motif9、motif12、motif14和motif18具有類似XXLXXLXX的保守結(jié)構(gòu)域。工業(yè)大麻RLK的保守結(jié)構(gòu)域主要有4個(圖3),即PKc超家族、STKc_IRAK、PLN00133超家族和USP。

圖2 工業(yè)大麻RLK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domain of RLK protein in industrial hemp

圖3 20個保守位點的LOGO圖Fig.3 LOGO of 20 conservative sites

為系統(tǒng)研究工業(yè)大麻RLK家族潛在的生物學(xué)功能,分析RLK在不同品種受NaHCO3脅迫條件下的表達(dá)模式(圖4),對63個基因的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫后基因的表達(dá)模式基本相同,但在品種1和品種2中的表達(dá)模式略有差異,說明RLK基因的表達(dá)受NaHCO3脅迫發(fā)生變化,且其表達(dá)模式與不同品種的鹽堿耐受性有關(guān)。

圖4 工業(yè)大麻RLK基因的潛在生物學(xué)功能Fig.4 Potential biological function of RLK gene in industrial hemp

3 討論

RLK在植物逆境脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[1]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時,RLK的胞外結(jié)構(gòu)域能識別環(huán)境信號,進(jìn)而通過跨膜結(jié)構(gòu)傳遞至胞內(nèi),從而調(diào)控植物對逆境脅迫的適應(yīng)性[13]。MAPK是RLK的底物之一[14],本研究中有11條工業(yè)大麻RLK基因注釋在MAPK信號通路中,推測工業(yè)大麻RLK通過激活MAPK后,再激活后續(xù)的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控了工業(yè)大麻在NAHCO3脅迫下的基因表達(dá)[15]。

在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面,RLK通過負(fù)調(diào)控ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而調(diào)控植物的生長發(fā)育和鹽堿耐受性[16-17]。本研究中有9條工業(yè)大麻RLK基因注釋在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中有些基因與油菜素內(nèi)酯信號途徑中的油菜素類固醇信號激酶有關(guān),但其具體調(diào)控機(jī)制是否與擬南芥相似[18]有待進(jìn)一步研究。

鹽堿脅迫對工業(yè)大麻種子萌發(fā)、生長發(fā)育、莖稈和種子產(chǎn)量及品質(zhì)均有負(fù)面影響,因此了解工業(yè)大麻對鹽堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制具有重要意義。目前,關(guān)于工業(yè)大麻鹽堿耐受性機(jī)制的研究已有一些報道,而信號感知和傳遞方面的研究較少。從工業(yè)大麻RLK家族的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、注釋信息等方面進(jìn)行分析,為后續(xù)研究RLK基因家族參與工業(yè)大麻調(diào)控鹽堿脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)制提供參考,為工業(yè)大麻的分子育種提供基因資源,對提高蘇打鹽堿地的綜合利用具有重要理論意義。