秦一彤,余娧凡,錢旭,姚云君,金磊磊,陳集雙,2*,虞龍*

1(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京,211800)

2(遵義醫(yī)科大學(xué),生物資源健康利用研究中心,貴州 遵義,563000)

石斛堿型生物堿(dendrobine-type total alkaloids,DTTAs)是藥用植物金釵石斛的特征成分[1],具有降血糖、抗腫瘤、抗白內(nèi)障等成效[2],結(jié)構(gòu)上屬于倍半萜類生物堿[3]。近年,石斛堿醫(yī)學(xué)價(jià)值不斷提高,金釵石斛產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,以其制備的中成藥年銷售額已近40億元[4]。由于傳統(tǒng)獲取生物堿的方式具有周期長、技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)或經(jīng)濟(jì)性差的缺點(diǎn),無法滿足市場日益增長的需求[5]。大量能夠產(chǎn)植物相似活性化合物的內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn),在天然化合物獲得和生物制藥中表現(xiàn)出巨大潛力[6]。但是內(nèi)生真菌中產(chǎn)物表達(dá)不穩(wěn)定現(xiàn)象普遍存在[7],為解決這一問題,前體飼喂、誘導(dǎo)子添加等策略被開發(fā)用于提高內(nèi)生菌次生代謝物產(chǎn)量。除此之外,發(fā)酵條件和工藝也是提高產(chǎn)量常考慮的重要因素。

傳統(tǒng)上,“單因素(one-factor-at-a-time,OFAT)”是優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)的常見方法。當(dāng)涉及多變量時(shí),OFAT易忽略參數(shù)間的相互作用,所以部分研究中會采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)、Box-Behnken設(shè)計(jì)(Box-Behnken design,BBD)[8]和中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)[9]等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,結(jié)合響應(yīng)面(response surface methodology,RSM)來說明因變量和自變量之間的聯(lián)系[10]。目前,利用RSM方法進(jìn)行優(yōu)化已大大增加了內(nèi)生菌中重要代謝物的產(chǎn)量[11]。例如,通過利用RSM制定的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉屬H1,紫金草皂苷的產(chǎn)量提高到37.16 mg/L[12]。BEN MEFTEH等[13]在使用RSM優(yōu)化后,Penicilliumbilaiae分離物TDPEF30的蛋白酶產(chǎn)量增加了1 086倍。

TrichodermalongibrachiatumMD33是本課題組首次分離報(bào)道的具有產(chǎn)DTTAs能力的內(nèi)生真菌[14-15]。通過復(fù)合誘變后,獲得產(chǎn)量穩(wěn)定的正突變體T.longibrachiatumUN32,DTTAs產(chǎn)量是出發(fā)菌株MD33的2.62 倍[16]。金屬離子會對部分酶活性產(chǎn)生影響,從而影響代謝產(chǎn)物的合成[17],而在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基過程中,發(fā)現(xiàn)眾多金屬離子能夠提高DTTAs的產(chǎn)量。本研究在前期基礎(chǔ)上,擬以Cu2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Fe2+、Ca2+和Mg2+共8種金屬離子為對象,通過RSM優(yōu)化,以DTTAs產(chǎn)量為篩選標(biāo)準(zhǔn),建立UN32發(fā)酵最適金屬離子體系。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

T.longibrachiatumUN32是本試驗(yàn)所用菌株,是由T.longibrachiatumMD33菌株經(jīng)紫外和氮離子束復(fù)合誘變,獲得穩(wěn)產(chǎn)DTTAs的正突變株,現(xiàn)保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

馬鈴薯,當(dāng)?shù)赜垒x超市;葡萄糖、瓊脂、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、溴甲酚綠、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、MnSO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4和KCl均為分析純,國藥試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS-49X50-BS恒溫培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific;BXM-110VE立式壓力蒸汽滅菌器,博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;BLM-1000超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;GL21M離心機(jī),鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Spectrum lab 752S紫外分光光度計(jì),Grant公司;GZX-9070 MBE電熱鼓風(fēng)管干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;QQ-201離心管振蕩器,上海啟前電子科技有限公司;ZQZY-BG振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基、無機(jī)鹽溶液及生物堿檢測相關(guān)溶液

a)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,121 ℃高壓滅菌20 min后備用。馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基無瓊脂加入。

b)無機(jī)鹽溶液母液:使用蒸餾水配制濃度為0.1 mol/L的CuSO4、ZnSO4、CoCl2、CaCl2、MnSO4、MgSO4、FeSO4、KCl溶液,使用0.22 μm濾頭過濾除菌。

c)生物堿檢測相關(guān)溶液:

鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液:分別配制0.2 mol/L的鄰苯二甲酸氫鉀與氫氧化鈉溶液,使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)鄰苯二甲酸氫鉀溶液pH值至4.55。

0.4 g/L溴甲酚綠酸性染料:取0.04 g溴甲酚綠粉末,用100 mL鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液溶解。

堿性乙醇溶液:以無水乙醇為溶劑配制0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌絲培養(yǎng)及收集

無菌條件下,使用打孔器于活化平板外圍挑取直徑為1 cm的菌餅,接入裝液量為100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在120 r/min,28 ℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)10 d。

發(fā)酵液中的菌體通過抽濾收集,于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重,分析天平稱重獲得菌體干重。

1.4.2 生物堿提取及檢測

對傳統(tǒng)生物堿提取方法[18]進(jìn)行步驟改進(jìn),將烘干后的菌絲研磨成粉末,稱取0.3 g放入試管內(nèi),加入30 mL的2%鹽酸水溶液進(jìn)行提取,超聲破碎10 min,浸提過夜;取10 mL上清液,加入氨水調(diào)節(jié)pH值至10,加入10 mL二氯甲烷振蕩后進(jìn)行萃取,取下層進(jìn)行生物堿含量檢測。采用“鄰苯二甲酸氫鉀-溴甲酚綠”比色法[19]進(jìn)行生物堿測定。

1.4.3 生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

配制100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用二氯甲烷稀釋到質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、10、15 μg/mL,然后各取不同濃度對照品溶液5 mL加入3 mL緩沖液和2 mL溴甲酚綠酸性染料,振蕩后靜置30 min,取下層2.5 mL,加入0.5 mL堿性乙醇溶液,以二氯甲烷作為空白對照,在620 nm波長處測定吸光度作為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,得到線性回歸方程。

1.4.4 OFAT

分別在培養(yǎng)基中加入不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)的無機(jī)鹽溶液,初步探究不同金屬離子對生物堿產(chǎn)量的影響。

1.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)生物堿培養(yǎng)基

1.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定Cu2+、Mg2+、Mn2+、K+、Fe2+、Zn2+、Na+和Ca2+8種離子的高(1)低(-1)水平,使用軟件Design expert 10.0進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)(表1)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,最終結(jié)果取平均值。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果擬合出方程如公式(1)所示:

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平

Y=α0+∑αiXi

(1)

式中:Y,響應(yīng)結(jié)果生物堿量;α0、αi,常系數(shù);Xi,試驗(yàn)探究的因素。

1.5.2 金屬離子最佳添加時(shí)間

金屬離子加入的時(shí)間也是影響代謝物合成的原因之一[20]。由Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果篩選出了對生物堿產(chǎn)量影響最大的3種金屬離子,分別在發(fā)酵第0、3、6、9天加入不同濃度的離子,進(jìn)一步優(yōu)化加入濃度和時(shí)間。

1.5.3 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)與最佳加入時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得到貢獻(xiàn)值最大的3種因素的最優(yōu)濃度范圍,確定每種因素的3個(gè)水平(-1、0、1)如表2所示,使用Design expert 10.0設(shè)計(jì)BBD試驗(yàn),按照設(shè)計(jì)每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù),結(jié)果求取平均值。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)中各因素的變量水平

將BBD試驗(yàn)得到的結(jié)果進(jìn)行擬合,得到的回歸方程如公式(2)所示:

(2)

式中:Y,預(yù)測的響應(yīng)值;Xi和Xj,各獨(dú)立因素;α0,此模型的截距;αi,線性系數(shù);αii,二次系數(shù);αij,交互作用系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

以石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo),620 nm處測得的吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合后,結(jié)果得回歸方程y=0.100 9x+0.095 6(R2=0.998 0),因?yàn)橄嚓P(guān)系數(shù)R2>0.99,說明線性關(guān)系良好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各金屬離子對生物堿產(chǎn)量的影響如圖1所示,當(dāng)Cu2+、Mn2+和Fe2+濃度為0.5 mmol/L時(shí),Zn2+、Na+和Ca2+濃度為1.5 mmol/L時(shí),Mg2+和K+濃度為2.0 mmol/L時(shí),生物堿的產(chǎn)量最高。將此單因素試驗(yàn)的結(jié)果作為Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素的中心水平設(shè)計(jì)試驗(yàn),用于后續(xù)研究。

a-Cu2+;b-Mg2+;c-Mn2+;d-K+;e-Fe2+;f-Zn2+;g-Na+;h-Ca2+

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)的組合進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表3,使用軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,挑選出了3種貢獻(xiàn)度最大的因素:Cu2+、Fe2+和Zn2+進(jìn)行顯著性分析和方差分析,結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)顯著性分析及方差分析

在設(shè)計(jì)的高低水平范圍中,這幾種因素對響應(yīng)結(jié)果影響值的大小順序?yàn)閆n2+>Fe2+>Cu2+>Mn2+>Na+>Mg2+>K+>Ca2+,除Ca2+對響應(yīng)結(jié)果生物堿量為正效應(yīng)外,其他因素對結(jié)果影響都為負(fù)效應(yīng)。各因素中Zn2+貢獻(xiàn)度最大,占比有47.84%。由上可知影響UN32生物堿產(chǎn)量最重要的3個(gè)因素為Zn2+、Fe2+和Cu2+,對這3個(gè)因素與響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行擬合,得到回歸方程如公式(3)所示:

生物堿量=279.49-38.08×A-44.03×E-42.02×F

(3)

式中:A,Cu2;E,Fe2+;F,Zn2+。

各因素方差分析結(jié)果顯示(表4),本次Plackett-Burman試驗(yàn)整體模型P值為0.000 1,說明該模型是極顯著的,可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析,同時(shí)由貢獻(xiàn)值篩選出的這3種因素的P值分別為0.003 3、0.001 4、0.000 1,均小于0.05,說明這3種因素對于本模型都是顯著的,可以有效促進(jìn)UN32生產(chǎn)生物堿,所以選擇這3種因素進(jìn)行后續(xù)的分析。

2.4 金屬離子添加濃度和時(shí)間優(yōu)化

金屬離子的添加時(shí)間是影響真菌代謝的關(guān)鍵因素。上述Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)中雖發(fā)現(xiàn)Cu2+、Fe2+和Zn2+能提高DTTAs產(chǎn)量,對結(jié)果的影響呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng),這可能和他們的濃度和添加時(shí)間不適相關(guān)。因此,對他們的添加濃度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果(圖2)表明,Cu2+的最佳添加濃度和時(shí)間為0.5 mmol/L(第6天添加),生物堿量達(dá)到(304.77±12.51) μg;Fe2+的最佳添加濃度和時(shí)間為0.4 mmol/L(第6天添加),生物堿量為(275.32±13.15) μg;Zn2+的最佳添加濃度和時(shí)間為0.7 mmol/L(第3天添加),生物堿量為(285.16±13.26) μg。

a-Cu2+(A～G代表培養(yǎng)基中Cu2+的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L);b-Fe2+(A～G代表培養(yǎng)基中Fe2+的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L);c-Zn2+(A～G代表培養(yǎng)基中Zn2+的濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mmol/L)

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果,確定這3種因素的低(-1)和高(1)水平,使用Design expert 10.0設(shè)計(jì)BBD試驗(yàn),共進(jìn)行17組試驗(yàn),測定的結(jié)果如表5所示,能夠看出,每組試驗(yàn)的實(shí)際結(jié)果與預(yù)測的結(jié)果是接近的,說明結(jié)果可信度較高。

表5 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)預(yù)測結(jié)果

對模型進(jìn)行方差分析,由模型擬合得到的回歸方程如公式(4)所示:

生物堿量=-197.39+1 033.40×A+337.53×B+545.74×C-153.47×AB-95.07×AC+295.83×BC-826.00×A2-268.26×B2-881.85×C2

(4)

式中:A,Cu2+;B,Zn2+;C,Fe2+。

模型方程的決定系數(shù)R2為0.983 6,接近于1,說明此模型的擬合度高,并且預(yù)測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果之間的相關(guān)性好;變異系數(shù)為2.40,是指此模型中的數(shù)據(jù)僅有2.40%與實(shí)際的結(jié)果不符合;同時(shí)AdjR2=0.962 5,PredR2=0.851 1,兩者差值小于0.2,信噪比Adeq Precision=17.520>4,這些數(shù)值能夠表示此模型受到外界因素的干擾較小。

由模型的方差分析結(jié)果(表6)可知,此模型的P值<0.000 1,說明是極顯著的,能夠準(zhǔn)確預(yù)測響應(yīng)結(jié)果,其他項(xiàng)數(shù)值如A、AB、BC、A2、B2、C2的方差檢驗(yàn)P值均小于0.05,說明這些參數(shù)都是顯著的。失態(tài)項(xiàng)指的是回歸模型得到的預(yù)測數(shù)值與進(jìn)行的試驗(yàn)實(shí)際結(jié)果不相符合的概率,而由分析結(jié)果可知本實(shí)驗(yàn)擬合的模型失態(tài)項(xiàng)P值為0.354 8>0.05,說明是不顯著的,表示此模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測結(jié)果。

表6 Box-Behnken Design試驗(yàn)擬合模型的方差分析

2.6 響應(yīng)面二維等高線圖與三維曲面圖分析

使用軟件Design expert 10.0在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí),能夠生成兩兩因素與響應(yīng)結(jié)果間的等高線圖,其所呈現(xiàn)出來的形狀可以一定程度表達(dá)出這2個(gè)因素之間是否存在著交互關(guān)系,若二維圖呈圓形則表示關(guān)系不顯著,橢圓形則表示關(guān)系顯著。本試驗(yàn)結(jié)果擬合的模型繪制出的響應(yīng)圖如圖3所示。

a、b-Cu2+和Zn2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖;c、d-Cu2+和Fe2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖;e、f-Zn2+和Fe2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖

圖3-a展示了生物堿量隨Cu2+和Zn2+濃度變化的二維和三維響應(yīng)面圖,二者交互關(guān)系繪制的圖是橢圓形,證明其相互作用對響應(yīng)結(jié)果生物堿量產(chǎn)生的作用效果顯著。圖3-b表示當(dāng)ZnSO4濃度保持在0.7 mmol/L時(shí),Cu2+和Fe2+濃度與生物堿產(chǎn)量變化的響應(yīng)面圖。Zn2+與Fe2+相互作用的響應(yīng)面圖如圖3-c所示,能夠看出二者交互關(guān)系繪制的圖為橢圓形,表示其相互作用對響應(yīng)結(jié)果生物堿量產(chǎn)生的作用效果也是顯著的。各圖中不同因素對生物堿產(chǎn)量的影響相似,在本模型所選擇的取值范圍內(nèi),生物堿產(chǎn)量先隨著兩種因素濃度的增加而增加,當(dāng)響應(yīng)結(jié)果達(dá)到最大值后,隨著2種因素濃度的增加而減少。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

對此模型結(jié)果擬合出的回歸方程求解,能夠得到當(dāng)預(yù)測響應(yīng)結(jié)果生物堿產(chǎn)量達(dá)到最大時(shí),這幾種因素的濃度取值為:Cu2+0.54 mmol/L,Zn2+0.69 mmol/L,Fe2+0.39 mmol/L。分別使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對UN32進(jìn)行液體發(fā)酵及平板培養(yǎng),對菌絲的生物堿產(chǎn)量進(jìn)行對比。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,CuCl20.54 mmol/L,ZnSO40.69 mmol/L,FeSO40.39 mmol/L。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵UN32,生產(chǎn)的生物堿量為(317.36±6.48) μg,達(dá)到了模型預(yù)測值(309.33 μg)的102.60%,與預(yù)測結(jié)果基本一致,比起基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果[(183.78±7.54) μg],產(chǎn)量提高了72.68%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對真菌發(fā)酵培養(yǎng)基所需營養(yǎng)物質(zhì)無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化探究,首先研究了金屬離子對UN32產(chǎn)石斛堿的作用?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果,進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+和Fe2+3種金屬離子在適當(dāng)濃度下對石斛堿的生成具有最顯著的影響作用。對它們的添加時(shí)間和濃度進(jìn)行進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)各離子的最優(yōu)添加濃度和時(shí)間分別為Cu2+0.5 mmol/L(第6天),Fe2+0.4 mmol/L(第6天),Zn2+0.7 mmol/L(第3天)。隨后基于BBD和RSM的統(tǒng)計(jì)方法,進(jìn)一步優(yōu)化Zn2+、Cu2+和Fe2+在石斛堿生產(chǎn)中的相互作用,最終得到當(dāng)響應(yīng)結(jié)果生物堿量達(dá)到最大值,3種離子的濃度分別為Cu2+0.54 mmol/L,Zn2+0.69 mmol/L,Fe2+0.39 mmol/L,優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)UN32的生物堿產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值之間無顯著差異,說明模型擬合程度較高,可以指導(dǎo)內(nèi)生真菌UN32在液體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生石斛堿。試驗(yàn)結(jié)果顯示,添加金屬離子在液體發(fā)酵培養(yǎng)UN32產(chǎn)生石斛堿,是未來石斛堿進(jìn)行大規(guī)模工廠生產(chǎn)的有效策略。由于本工作只著重研究了金屬離子對石斛堿生產(chǎn)促進(jìn)作用的組合效應(yīng),因此在今后的工作中可以考慮在發(fā)酵培養(yǎng)中的碳源,氮源,前體物質(zhì)等的優(yōu)化。當(dāng)然除了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化外,還可以從UN32的發(fā)酵條件如溫度、接種量、轉(zhuǎn)速等方面使用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,或者通過基因編輯等手段進(jìn)一步提高生物堿產(chǎn)量。