曾金秀,尹紅梅,張權(quán),尹紫冉,寧舒嫻,張露,3,溫慶輝,涂宗財(cái)
1(江西師范大學(xué) 健康學(xué)院,江西 南昌,330022)
2(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌,330022)
3(江西師范大學(xué),國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,江西 南昌,330022)
4(南昌大學(xué),食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌,330047)
參考文獻(xiàn)
霉魚起源于江西,在永豐、吉安縣等地區(qū)流行,形成了吉水霉魚、樂(lè)安霉魚、峽江霉魚等品種[1]。其歷史悠久,口味獨(dú)特,香、辣、咸、鮮,是極具代表的地方特色下酒菜。傳統(tǒng)自然發(fā)酵的霉魚色澤紅亮,香辣咸鮮,口感緊實(shí),回味悠長(zhǎng),具獨(dú)特風(fēng)味[2]。然而,傳統(tǒng)自然發(fā)酵霉魚的生產(chǎn)過(guò)程多依賴人工經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,口感與風(fēng)味不穩(wěn)定,食用安全性存在潛在風(fēng)險(xiǎn),因而亟需對(duì)該工藝過(guò)程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵技術(shù)調(diào)控,改善其產(chǎn)品品質(zhì)與風(fēng)味[3]。
微生物接種發(fā)酵是提高發(fā)酵魚制品品質(zhì)的一種有效手段[4-5]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵制品是微生物發(fā)酵菌種如乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等的主要來(lái)源[6-7]。目前已有對(duì)于酸魚、臭鱖魚等發(fā)酵魚制品的風(fēng)味研究的報(bào)道,但對(duì)其他發(fā)酵魚制品的研究還不夠充分。霉魚作為江西吉安地區(qū)傳統(tǒng)特色的發(fā)酵魚制品[8],對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群組成和風(fēng)味的研究鮮有報(bào)道,對(duì)其乳酸菌資源的研究和應(yīng)用亦尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵霉魚作為分離基質(zhì),從中分離并鑒定了清酒乳桿菌,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究,同時(shí),結(jié)合吉安霉魚制作工藝,采用清酒乳桿菌接種發(fā)酵霉魚,研究菌株對(duì)霉魚發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)、色澤和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,以期為霉魚發(fā)酵基礎(chǔ)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。
1.1.1 試驗(yàn)樣品
霉魚,江西省吉安市永豐縣菜市場(chǎng)。
鳙魚(Aristichthysnobilis),南昌市南昌縣菜市場(chǎng),規(guī)格為2.5~3.0 kg/尾。
1.1.2 培養(yǎng)基
MRS液體培養(yǎng)基(1 L)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(1 L),Solarbio公司。
MRS-溴甲酚紫鑒別培養(yǎng)基(1 L):溴甲酚紫0.1 g、MRS瓊脂培養(yǎng)基(1 L),Solarbio公司。
水瓊脂培養(yǎng)基(1 L):瓊脂粉15 g。
以上培養(yǎng)基均用蒸餾水配制和定容,在備用前需要30 min的115 ℃高壓滅菌處理。
1.1.3 試劑
食用鹽、辣椒面等調(diào)料,南昌市天虹超市;氯化鈉、無(wú)水乙醇,西隴科學(xué)股份有限公司;DNA提取試劑盒,TIANGEN公司。
恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司;PCR儀,Bio-Rad公司;電泳儀,北京六一生物科技有限公司;高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;TA-TXplus質(zhì)構(gòu)分析儀,英國(guó)Stable Micro System公司;CR-10色差儀,日本柯尼卡公司;電子鼻,德國(guó)Airsense公司;DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國(guó)Supelco公司;7890A/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Agilent公司。
1.3.1 清酒乳桿菌的分離鑒定
參照文獻(xiàn)[9]方法從霉魚中分離鑒定清酒乳桿菌。
1.3.2 清酒乳桿菌的生物學(xué)特性
1.3.2.1 菌株的最適培養(yǎng)pH和溫度
以培養(yǎng)至24 h的菌液OD600為評(píng)價(jià)指標(biāo),探索菌株在MRS液體培養(yǎng)基的最適初始pH以及最適培養(yǎng)溫度。
1.3.2.2 菌株耐鹽、抑菌能力
參照文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定菌株耐鹽能力。參照文獻(xiàn)[10]的方法檢測(cè)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)以及從傳統(tǒng)發(fā)酵霉魚中分離的嗜麥芽窄食單孢菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)的抑制效果。
1.3.3 清酒乳桿菌對(duì)霉魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響
1.3.3.1 發(fā)酵工藝流程
自然發(fā)酵霉魚制作流程:
a)取新鮮鳙魚,除去魚鱗,剖腹宰殺,去除內(nèi)臟、魚頭和魚尾,用流水清洗干凈;
b)切成寬二寸長(zhǎng)四寸塊狀,晾干,放入盆中,加食用鹽(5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))拌勻;
本文首先總結(jié)了瀝青路面坑槽病害的成因與一般修補(bǔ)技術(shù),然后在某高速公路中使用冷補(bǔ)瀝青修補(bǔ)料進(jìn)行坑槽病害修補(bǔ),并對(duì)其養(yǎng)護(hù)維修效果進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果表明:冷補(bǔ)瀝青修補(bǔ)料能有效修復(fù)路面坑槽病害,修補(bǔ)路面的抗滑性能可滿足行車安全要求,同時(shí)具有較好的抗?jié)B性能,能有效減緩路面水損害現(xiàn)象,對(duì)提高道路的使用壽命具有積極意義。
c)待2 h后再拌辣椒面(按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%加辣椒面),并逐塊放入干凈的罐中,發(fā)酵48 h。
接種發(fā)酵霉魚制作流程:
將1.3.3.1節(jié)b)中魚塊晾干后,改為按1.00 kg魚塊添加1.25 g清酒乳桿菌濕菌體的量,將清酒乳桿菌均勻涂抹在魚塊的表面,在盆中加食用鹽拌勻。
1.3.3.2 色澤、質(zhì)構(gòu)測(cè)定
參照LUO等[11]和周迎芹等[12]的方法測(cè)定魚肉的色澤、質(zhì)構(gòu),每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。
把樣品切成1 cm厚的塊狀,采用手持色差儀測(cè)定魚肉的亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*),以平均值作為各參數(shù)測(cè)定值。樣品白度的計(jì)算如公式(1)所示:
(1)
參照文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定質(zhì)構(gòu)各參數(shù)。
1.3.3.3 電子鼻檢測(cè)
表1 PEN3型電子鼻的標(biāo)準(zhǔn)傳感器信息
1.3.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定與鑒定
參照文獻(xiàn)[13]的方法對(duì)霉魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定與鑒定。
1.3.3.5 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分析
采用劉登勇等[14]提出的相對(duì)氣味活度值法(relative odor activity value,ROAV)對(duì)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵的霉魚中關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行分析。
所有試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Origin 2018繪圖,Mega 6.0構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹,顯著性差異分析采用SPSS 16.0中Duncan檢驗(yàn),P<0.05表示存在顯著性差異。
利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)手段,從自然發(fā)酵霉魚中分離到一株符合清酒乳桿菌形態(tài)學(xué)特征的菌株,并命名為1-3。菌株1-3的菌落特征(圖1-a)為黃色,邊緣整齊,中央凸起,表面光滑;革蘭氏染色呈陽(yáng)性,短桿狀排列,無(wú)鞭毛,無(wú)芽孢,單個(gè)或成對(duì),成鏈狀排列(圖1-b和圖1-c)。對(duì)菌株1-3的16S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序后,利用NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析,篩選出同源性較高的16S rDNA的基因序列作為參比對(duì)象,采用領(lǐng)接法構(gòu)建進(jìn)化樹。由圖2可確定菌株1-3為清酒乳桿菌。
a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色結(jié)果;c-掃描電鏡圖
圖2 清酒乳桿菌1-3的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.1 清酒乳桿菌的最適培養(yǎng)pH和溫度
對(duì)菌株1-3培養(yǎng)pH和溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖3所示。在pH為4.0~8.0時(shí),菌液OD600值不斷升高,pH值為8時(shí)OD600值最大,為1.58±0.04。當(dāng)pH進(jìn)一步升高后,可能由于不再適合菌株生長(zhǎng),菌液OD600驟降。在培養(yǎng)溫度為4~25 ℃時(shí),隨著溫度升高菌液OD600升高,在25~42 ℃則隨著溫度升高而下降。因此可知菌株1-3的最適培養(yǎng)條件為pH 8,溫度25 ℃。
a-pH;b-培養(yǎng)溫度
2.2.2 清酒乳桿菌耐鹽、抑菌能力
對(duì)菌株1-3耐鹽能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。在0.00~0.04 g/mL的NaCl添加量下,菌液OD600顯著下降,從2.02±0.01降低至1.90±0.00。當(dāng)NaCl添加量為0.08~0.10 g/mL時(shí),菌液OD600有所下降,但不明顯,且菌液OD600仍可維持在1.80以上,表明菌株1-3具有一定的耐鹽能力,在較高鹽濃度的環(huán)境中仍能生長(zhǎng)和繁殖得較好。
圖4 清酒乳桿菌1-3對(duì)NaCl的耐受結(jié)果
以金黃色葡萄球菌以及本實(shí)驗(yàn)室在霉魚中分離到的沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單孢菌作為指示菌,研究清酒乳桿菌1-3的抑菌能力,結(jié)果如圖5所示。由圖5 可以看出,菌株1-3培養(yǎng)上清液對(duì)所有指示菌均有不同程度的抑制作用。對(duì)霉魚源沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單孢菌抑菌圈直徑分別為(11.55±0.36) mm,(12.27±0.33) mm,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到(11.62±0.42) mm。
a-沙雷氏菌;b-嗜麥芽窄食單孢菌;c-金黃色葡萄球菌
2.3.1 清酒乳桿菌對(duì)魚肉色澤、質(zhì)構(gòu)的影響
自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚無(wú)明顯色差,通過(guò)清酒乳桿菌接種發(fā)酵后,霉魚的白度和亮度均降低(圖6),魚肉質(zhì)構(gòu)無(wú)明顯變化,具體表現(xiàn)為硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性均無(wú)顯著性變化(圖7),表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵對(duì)霉魚的色澤和質(zhì)構(gòu)無(wú)明顯影響,可用來(lái)接種發(fā)酵霉魚。
圖6 清酒乳桿菌1-3對(duì)霉魚色澤的影響
a-硬度;b-彈性;c-內(nèi)聚性;d-咀嚼性
2.3.2 基于電子鼻技術(shù)分析清酒乳桿菌對(duì)魚肉氣味的影響
自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚電子鼻結(jié)果如圖8所示,2組樣品的響應(yīng)值差異主要在W1S(對(duì)甲基類敏感)、W1W(對(duì)硫化物敏感)。接種發(fā)酵的霉魚比自然發(fā)酵霉魚對(duì)硫化物響應(yīng)度高,對(duì)甲基類的響應(yīng)度低。但2組樣品對(duì)甲基類、對(duì)硫化物的響應(yīng)度均較大。
圖8 電子鼻傳感器的響應(yīng)雷達(dá)圖
2.3.3 清酒乳桿菌對(duì)魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響
2.3.3.1 霉魚揮發(fā)性風(fēng)味成分分析
對(duì)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果見(jiàn)圖9和附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)。霉魚共檢測(cè)出66種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括烴類8種,醇類14種,醛類5種,酮類10種,酯類13種,酸類2種,芳香類6種和其他類8種。自然發(fā)酵霉魚中檢出41種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),接種發(fā)酵霉魚中檢出54種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),比自然發(fā)酵霉魚多13種風(fēng)味物質(zhì),說(shuō)明相比于自然發(fā)酵,利用清酒乳桿菌發(fā)酵可以有效豐富霉魚的風(fēng)味。不同發(fā)酵方式下霉魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和占比存在著差異,自然發(fā)酵霉魚中相對(duì)占比最高的是醇類物質(zhì)為(37.87±3.57)%,而接種發(fā)酵霉魚中醇類物質(zhì)只占(25.43±0.53)%;接種發(fā)酵霉魚中揮發(fā)性物質(zhì)以芳香類為主,相對(duì)占比為(35.23±0.98)%。此外,接種發(fā)酵霉魚中還檢測(cè)出酸類物質(zhì),且比自然發(fā)酵多4種酯類物質(zhì)。
a-風(fēng)味成分類別;b-風(fēng)味成分占比
烴類物質(zhì)感官閾值高,對(duì)霉魚整體風(fēng)味影響小,但烯烴類化合物可形成醛酮類物質(zhì)[15-16]。2種發(fā)酵方式下霉魚中烴類物質(zhì)含量均較高,主要為十七烷,分別為(8.64±3.54)%和(14.53±2.37)%。此外,接種發(fā)酵霉魚中檢測(cè)出的烯烴化合物較多,如衣蘭烯、雅欖藍(lán)烯和(E)-14-十六碳烯等。醇類物質(zhì)閾值一般較高,對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較小,但不飽和醇類閾值較低,對(duì)霉魚整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,如1-辛烯-3-醇,閾值為1 μg/kg,具蘑菇香、油脂味和土腥味[17];芳樟醇感官閾值為6 μg/kg,具柑橘味、花香、木香等特征風(fēng)味,可能來(lái)自于霉魚制作過(guò)程中添加的辣椒面,其在自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中均被檢出。
醛類物質(zhì)主要來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化降解,閾值低,對(duì)霉魚的整體風(fēng)味影響大,通常具甜味、清香、果香、脂香等良好風(fēng)味[18]。自然發(fā)酵霉魚中醛類物質(zhì)僅為(0.02±0.00)%,而接種發(fā)酵霉魚醛類含量相對(duì)較高為(3.24±0.03)%,且種類較多,說(shuō)明接種發(fā)酵可較好改善霉魚風(fēng)味。自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中酮類物質(zhì)種數(shù)較多,均為9種,酮類物質(zhì)主要是脂質(zhì)氧化和氨基酸降解的產(chǎn)物,感官閾值較醛類高,但具有獨(dú)特的清香和果香[19],如β-紫羅蘭酮和2-壬酮[20],在自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中均有檢出,可能對(duì)霉魚的風(fēng)味有一定增強(qiáng)作用。
酯類物質(zhì)由醇和羧酸的酯化反應(yīng)形成,呈淡淡的果香和清香[21]。接種發(fā)酵霉魚中酯類物質(zhì)11種,含量為(6.89±0.70)%,均明顯高于自然發(fā)酵,表明接種發(fā)酵霉魚風(fēng)味較好。酸類物質(zhì)通常具刺鼻的不愉快的氣味,閾值較極高[16],對(duì)霉魚整體風(fēng)味影響小。接種發(fā)酵霉魚中酸類物質(zhì)含量?jī)H為(0.09±0.00)%,而自然發(fā)酵未檢出,這可能是在自然發(fā)酵霉魚中含量過(guò)低而未能檢測(cè)出。接種發(fā)酵和自然發(fā)酵霉魚均檢出含量較高的芳香類物質(zhì),其可能來(lái)自于類脂、烴類等化合物高溫下裂解,或來(lái)源于香辛料[22]。其中愈創(chuàng)木酚(10 μg/kg)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3 μg/kg)的閾值低,對(duì)霉魚熏肉香、煙熏味等氣味貢獻(xiàn)較大。此外,霉魚中還檢測(cè)出少量吡嗪、吡啶、呋喃等雜環(huán)類化合物,是一類重要的風(fēng)味化合物,感官閾值相對(duì)較低,可由脂質(zhì)氧化、美拉德反應(yīng)形成,具很強(qiáng)的烤肉味、堅(jiān)果香、火腿香味等[23]。
2.3.3.2 霉魚關(guān)鍵風(fēng)味成分
風(fēng)味貢獻(xiàn)取決于揮發(fā)性化合物占比及其閾值[24]。對(duì)霉魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行ROAV分析,該方法認(rèn)為ROAV越大對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。由附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)可知,自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚關(guān)鍵風(fēng)味成分相似,但也存在一定差異,自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中分別得到3種和2種關(guān)鍵風(fēng)味成分。
在自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中的均有檢出茴香腦、桉樹醇,苯乙酮等,賦予了霉魚辛香、木香味,其可能主要來(lái)自于制作過(guò)程中添加的辣椒面[25]。2種霉魚中醇類物質(zhì)ROAV最大的均為1-辛烯-3-醇,在接種發(fā)酵和自然發(fā)酵霉魚中分別為4.86和4.95,其對(duì)霉魚蘑菇香、油脂味和土腥味等氣味具有較大貢獻(xiàn)。貢獻(xiàn)甜香、木香的芳樟醇為臭鱖魚重要的風(fēng)味物質(zhì)[12],在霉魚中也有檢測(cè)出,其對(duì)霉魚獨(dú)特風(fēng)味的形成起到重要的修飾作用。β-環(huán)檸檬醛僅在接種發(fā)酵霉魚中檢出,ROAV>0.1,對(duì)霉魚風(fēng)味有修飾作用,貢獻(xiàn)清香、花香。在自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中β-紫羅蘭酮ROAV均為100,對(duì)霉魚的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大,貢獻(xiàn)了花香、果香、木香。2-十一酮僅在接種發(fā)酵霉魚中檢出,對(duì)霉魚風(fēng)味有重要的修飾作用,具蠟香、奶油香、油脂味。在接種發(fā)酵霉魚中還發(fā)現(xiàn)異戊醇(酸臭味)和一些常見(jiàn)的腥味物質(zhì)[26]如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然發(fā)酵霉魚中的ROAV值小,說(shuō)明清酒乳桿菌的接入,可以降低腥味和酸臭味,增加香氣,提升霉魚的風(fēng)味。酯類物質(zhì)通常閾值較高,其ROAV較小,對(duì)霉魚的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大,但在接種發(fā)酵霉魚中的酯類物質(zhì)較自然發(fā)酵霉魚要豐富,共同賦予霉魚酯香、蠟香、甜香等。
綜上可知,清酒乳桿菌的接入,可以在一定程度上降低腥味和酸臭味,改善發(fā)酵制品的風(fēng)味,使得霉魚中各種類風(fēng)味物質(zhì)含量較為均衡,共同造就霉魚酯香、甜香等多層次風(fēng)味特征。
從傳統(tǒng)自然發(fā)酵霉魚中分離出一株清酒乳桿菌,命名為1-3,其在MRS液體培養(yǎng)基中最佳培養(yǎng)條件為pH 8,溫度25 ℃。該菌對(duì)沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌和嗜麥芽窄食單孢菌具有抑制作用,可耐受10%的NaCl濃度;菌株1-3接種發(fā)酵霉魚與自然發(fā)酵霉魚相比,色差、質(zhì)構(gòu)均無(wú)顯著性差異。電子鼻結(jié)果表明,接種發(fā)酵的霉魚比自然發(fā)酵霉魚對(duì)硫化物響應(yīng)度高,對(duì)甲基類的響應(yīng)度低,但2組樣品對(duì)甲基類、對(duì)硫化物的響應(yīng)度均較大。自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中分別檢出41種和54種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),自然發(fā)酵霉魚中相對(duì)含量最高的是醇類物質(zhì)為(37.87±3.57)%,而接種發(fā)酵霉魚中醇類物質(zhì)只占(25.43±0.53)%;接種發(fā)酵霉魚中揮發(fā)性物質(zhì)以芳香類為主,相對(duì)含量為(35.23±0.98)%。自然發(fā)酵和接種發(fā)酵霉魚中分別得到3種和2種關(guān)鍵風(fēng)味成分,其中接種發(fā)酵霉魚中異戊醇(酸臭味)和一些常見(jiàn)的腥味物質(zhì)如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然發(fā)酵霉魚中的ROAV值小。綜上,利用清酒乳桿菌株純種發(fā)酵霉魚工業(yè)化生產(chǎn)可行,比自然發(fā)酵霉魚揮發(fā)性成分種類多,在一定程度上降低腥味和酸臭味,并產(chǎn)更多樣化的酯類化合物,賦予霉魚更濃郁的酯香、甜香。后續(xù)可進(jìn)一步通過(guò)分子感官科學(xué)手段,研究接種發(fā)酵霉魚發(fā)酵過(guò)程中主體風(fēng)味物質(zhì)形成途徑,為霉魚特殊風(fēng)味的形成機(jī)理提供參考依據(jù),進(jìn)一步指導(dǎo)霉魚的風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)化。