王學(xué)紅,尹星星,陸杰,張靖鵬,2,楊永晶*

1(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,青海 西寧,810016)

2(青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?青海 西寧,810003)

紫外線輻射是引起皮膚外源性老化的重要因素之一,中波紫外線(ultraviolet B,UVB)的穿透力較淺,對(duì)表皮細(xì)胞的毒性更強(qiáng)、損傷程度更大[1]。過(guò)度暴露于UVB會(huì)引起皮膚粗糙、色素沉著和炎癥反應(yīng),甚至導(dǎo)致皮膚惡性腫瘤的發(fā)生[2]。皮膚長(zhǎng)期遭受UVB輻射會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累。一方面,ROS的過(guò)量積累可上調(diào)皮膚細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表達(dá),下調(diào)抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá),并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cystein-asparate protease-9,Caspase-9)和p53,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,加速皮膚衰老[3-4]。另一方面,ROS的過(guò)量積累促使核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活,導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性細(xì)胞因子的分泌,誘發(fā)皮膚炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起皮膚光損傷[5]?？梢?jiàn),細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)是UVB誘導(dǎo)皮膚光損傷的重要因素。

皮膚長(zhǎng)期暴露于紫外線照射產(chǎn)生過(guò)多ROS,引起細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng),加快皮膚衰老的速度。人們可通過(guò)減少與紫外線的接觸或涂抹防曬劑來(lái)防止皮膚光損傷的發(fā)生[6]。防曬劑分為傳統(tǒng)的物理防曬劑、化學(xué)防曬劑和新型天然植物防曬劑。物理防曬劑一般停留在皮膚表面,沉積形成白色層,會(huì)影響皮脂腺及汗腺分泌而給皮膚造成負(fù)擔(dān),化學(xué)防曬劑易破壞皮膚屏障、引起皮膚過(guò)敏等,且使用時(shí)要充分考慮與皮膚的結(jié)合度[7]。天然植物活性成分對(duì)皮膚作用溫和、安全性高且藥效持久穩(wěn)定,已成為抗光損傷物質(zhì)開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。研究表明,植物油脂具有抗炎、抗氧化等多種活性,加之其綠色環(huán)保、使用安全和易被皮膚吸收等優(yōu)勢(shì),可作為天然防曬劑的理想原料進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。例如,山茶油、牡丹籽油、橄欖油等植物油脂已被作為防曬劑原料應(yīng)用于化妝品中[9-10]。

枸杞(LyciumbarbarumL.)為茄科、枸杞屬植物,卵狀菱形,有“紅寶”之稱,作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物,主要分布在我國(guó)寧夏、青海等西北地區(qū)[11-12]。隨著枸杞汁、枸杞酒等產(chǎn)品產(chǎn)量的增長(zhǎng),大量枸杞廢渣(含有大量枸杞籽)帶來(lái)的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)問(wèn)題日益突出。枸杞籽油是從枸杞籽中提取獲得的一種功能性油脂,含有不飽和脂肪酸、維生素E、類胡蘿卜素和磷脂等天然活性成分,具有抗氧化、延緩衰老、緩解抑郁和增強(qiáng)免疫功能的藥理作用[13-16]。研究和開(kāi)發(fā)枸杞籽油不僅能解決廢渣污染問(wèn)題,而且具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。LI等[13]證明枸杞籽油具有自由基清除能力,因此,它具有一定抗皮膚光損傷的潛力。然而,關(guān)于枸杞籽油對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的抗光損傷作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此,本研究在測(cè)定枸杞籽油中主要活性成分含量的基礎(chǔ)上,以UVB誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)為光損傷模型,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率、ROS含量、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和炎癥因子來(lái)探討枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞的防護(hù)作用,以期為天然抗光損傷物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù),為枸杞籽油的有效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

HaCaT細(xì)胞,武漢普諾賽生命科技有限公司;枸杞籽油,青?？灯丈锟萍加邢薰尽?/p>

1.1.2 試劑

HaCaT專用培養(yǎng)基[含體積分?jǐn)?shù)為15%的胎牛血清(fetal calf serum,FBS)]、胰蛋白酶、磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液,武漢普諾賽生命科技有限公司;增強(qiáng)型細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、ROS熒光法試劑盒、一步法TUNEL流式凋亡檢測(cè)試劑盒、TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑,天根生化科技(北京)有限公司;Tween-80,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HF100細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司;Happy-TL21臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Ti2熒光倒置顯微鏡,伯泰科技有限公司;L125紫外輻射儀,深圳市林上科技有限公司;1510酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))科技有限公司;KH-600E超聲波清洗儀,昆山禾創(chuàng)儀器有限公司;B90883流式細(xì)胞儀,貝克曼庫(kù)爾特生物科技(蘇州)有限公司;SYNERGY LX多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞籽油主要活性成分的測(cè)定

分別按照GB 5009.168—2016、GB 5009.83—2016、DB64/T 1514—2017、《保健食品中功效成分檢測(cè)方法》和GB 5009.82—2016(第一法)提供的方法測(cè)定枸杞籽油中脂肪酸、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、葉黃素、谷甾醇以及維生素E的含量。

1.3.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞采用含15% FBS的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度至80%進(jìn)行傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[17]。

1.3.3 HaCaT細(xì)胞UVB光損傷模型的構(gòu)建

參考KUNCHANA等[18]的方法并略有改動(dòng)。HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,將原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為無(wú)血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去,用少量PBS覆蓋HaCaT細(xì)胞,進(jìn)行UVB照射,照射劑量分別為0、20、40、60、80、100 mJ/cm2,每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。照射結(jié)束后將PBS更換為無(wú)血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8,于37 ℃,5% CO2孵育1 h,450 nm處測(cè)定HaCaT細(xì)胞存活率,將細(xì)胞存活率為正常細(xì)胞存活率50%的UVB劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)照射劑量[17]。

1.3.4 HaCaT細(xì)胞存活率的測(cè)定

1.3.4.1 枸杞籽油對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為含有質(zhì)量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL枸杞籽油的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基(0.01% Tween-80助溶)和0.01%Tween-80(溶于無(wú)血清MEM培養(yǎng)基)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h,將上清更換為無(wú)血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。采用CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞存活率,方法同1.3.3節(jié)。

1.3.4.2 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。對(duì)照組:HaCaT細(xì)胞既不進(jìn)行UVB照射,也不加入枸杞籽油;模型組:HaCaT細(xì)胞只進(jìn)行UVB照射,不加入枸杞籽油;枸杞籽油組:HaCaT用含有不同質(zhì)量濃度枸杞籽油(75、150、300、600 μg/mL,0.01% Tween-80助溶)的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵育4 h。模型組和枸杞籽油組HaCaT細(xì)胞棄去上清液后加入少量PBS,以40 mJ/cm2的UVB劑量進(jìn)行照射。照射結(jié)束后,將各組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無(wú)血清MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔[17]。CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞存活率,方法同1.3.3節(jié)。

1.3.5 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中ROS水平的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié),用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofuorescin diacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[19]。用緩沖液按1∶750(體積比)稀釋DCFH-DA,棄去無(wú)血清MEM培養(yǎng)基,用緩沖液(試劑三)洗滌3次,加入適當(dāng)體積的DCFH-DA(試劑一),于37 ℃避光孵育40 min,采用熒光酶標(biāo)儀于500 nm/525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.6 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

HaCaT細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié)。棄去無(wú)血清MEM培養(yǎng)基,收集HaCaT細(xì)胞,按照一步法TUNEL流式凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡情況[20]。

1.3.7 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞炎癥因子含量的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié),按ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書分別測(cè)定對(duì)照組、模型組和枸杞籽油組HaCaT細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,于450 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.8 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.6節(jié),不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié)。棄去無(wú)血清MEM培養(yǎng)基,每孔加入適量PBS沖洗2～3次,棄去PBS后加入1 mL裂解液RZ裂解細(xì)胞,抽打若干次至溶液透明。按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA,依據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、p53和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)。RT-PCR反應(yīng)體系為正向和反向引物各0.6 μL,ddH2O 6.3 μL,cDNA 2.5 μL,2×SuperReal Color Premix(SYBR Green)10 μL進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min(預(yù)變性),95 ℃ 10 s(變性),60 ℃ 20 s(退火/延伸),40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增程序中讀取Ct值,按照2-ΔΔCt分析法,計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)[21]。計(jì)算如公式(1)所示:

ΔΔCt=處理組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)

(1)

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞籽油主要活性成分含量

枸杞籽油中含有大量不飽和脂肪酸,其中亞油酸和油酸含量最高,分別達(dá)到67.4%和19.2%;此外,谷甾醇和維生素E分別含有42%和27.4 mg/100 g;還含有少量的β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導(dǎo)的皮膚光損傷提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 枸杞籽油活性成分含量

2.2 不同UVB照射劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,與對(duì)照組(0 mJ/cm2)相比,不同UVB照射后HaCaT細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01),且UVB照射劑量越強(qiáng),細(xì)胞存活率越低。經(jīng)40 mJ/cm2UVB照射后,細(xì)胞存活率為對(duì)照組的50%左右,因此,本實(shí)驗(yàn)采用UVB照射強(qiáng)度為40 mJ/cm2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)照射劑量。

圖1 不同UVB照射劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3 枸杞籽油對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3.1 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

由圖2可知,相比于對(duì)照組,質(zhì)量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL的枸杞籽油(0.01% Tween-80助溶)和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率均無(wú)明顯影響。選擇0.01% Tween-80助溶的75、150、300、600 μg/mL的枸杞籽油進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3.2 不同濃度枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示,與對(duì)照組相比,經(jīng)UVB(40 mJ/cm2)照射后,模型組HaCaT細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01),為正常細(xì)胞的50%左右。與模型組相比,75 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05),150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞存活率極顯著升高(P<0.01),且細(xì)胞存活率隨著枸杞籽油濃度的增加而升高?？梢?jiàn),枸杞籽油可明顯提高UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率。

圖3 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.4 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖4顯示,與對(duì)照組相比,模型組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高(P<0.01)。而相比模型組,經(jīng)75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明枸杞籽油可明顯降低UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

圖4 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.5 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

由圖5可知,模型組HaCaT細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01),而與模型組相比,經(jīng)75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明40 mJ/cm2UVB照射能增加HaCaT細(xì)胞凋亡率,而枸杞籽油可有效抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

a-對(duì)照組;b-模型組;c-75 μg/mL;d-150 μg/mL;e-300 μg/mL;f-600 μg/mL;g-枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

2.6 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,經(jīng)枸杞籽油處理的各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA相對(duì)表達(dá)極顯著降低(P<0.01)(圖6)。該結(jié)果表明,枸杞籽油可通過(guò)增加UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達(dá),減少促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達(dá)抑制UVB照射引起的細(xì)胞凋亡。

a-Bcl-2;b-Bax;c-Caspase-3;d-Caspase-9;e-p53

2.7 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞炎癥因子的影響

圖7-a～圖7-c顯示,與對(duì)照組相比,經(jīng)UVB照射后,HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著升高(P<0.01);而與模型組相比,75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著下降(P<0.01)。圖7-d～圖7-f結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,枸杞籽油則極顯著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)(P<0.01)。說(shuō)明枸杞籽油能降低HaCaT細(xì)胞中炎癥因子的含量和mRNA相對(duì)表達(dá)減輕UVB引起的炎癥反應(yīng)。

a-TNF-α含量;b-IL-1β含量;c-IL-6含量;d-TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá);e-IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá);f-IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)

3 結(jié)論與討論

枸杞籽油具有不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素E和植物甾醇等活性成分[22-23],這些活性成分可通過(guò)不同途徑緩解皮膚損傷。研究表明,油酸和亞油酸都具有良好的抗衰老作用,油酸與人體脂肪酸結(jié)構(gòu)相似,可改變皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu),增加脂質(zhì)流動(dòng)性,促進(jìn)有效物質(zhì)的滲透;亞油酸則在阻止脂質(zhì)過(guò)氧化損傷方面起關(guān)鍵作用[24]。葉黃素可通過(guò)降低IL-6、TNF-α和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)這些促炎介質(zhì)發(fā)揮對(duì)紫外線輻射的HaCaT細(xì)胞的防護(hù)作用[25]。植物甾醇也能緩解皮膚炎癥反應(yīng)并保護(hù)其免受紫外線傷害[26]。維生素E可顯著減少紫外線輻射導(dǎo)致的紅斑、水腫和皮膚過(guò)敏,并抑制紫外線輻射引起的皮膚癌的發(fā)生[27]。本研究中,枸杞籽油中的油酸和亞油酸含量最高,分別為19.2%和67.4%,葉黃素、谷甾醇、維生素E含量分別為58.5 μg/100 g、42%、27.4 mg/100 g。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷提供一定物質(zhì)基礎(chǔ)。

UVB輻射后使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS,進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),加速細(xì)胞凋亡[28]。Bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。其中,Bcl-2與Bax功能相互拮抗,Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡,Bax加速細(xì)胞凋亡[29]。此外,過(guò)量的ROS會(huì)激活位于線粒體膜上的Bcl-2家族,使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,Cyto-C)釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并激活Caspase蛋白家族,啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而影響特定凋亡信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[30]。Caspase家族中Caspase-9作為凋亡始動(dòng)子起到關(guān)鍵作用,它在Cyto-C的參與下可激活Caspase-3,活化的Caspase-3可酶解凋亡抑制蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]。p53在細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要通過(guò)對(duì)線粒體膜上Bcl-2家族蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,改變線粒體膜電位,最終激活Caspase-3并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[32]。本研究結(jié)果顯示,枸杞籽油可通過(guò)顯著降低UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡率及相關(guān)因子Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達(dá)來(lái)抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的發(fā)生,進(jìn)而發(fā)揮抗UVB光損傷作用。MUZAFFER等[33]研究發(fā)現(xiàn)胡桃可下調(diào)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達(dá),上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá),該研究結(jié)果與本研究一致。

角質(zhì)細(xì)胞占據(jù)人皮膚表皮細(xì)胞的90%,具有分泌細(xì)胞因子的功能[34]。UVB作用于HaCaT細(xì)胞,導(dǎo)致多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生[35]。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),TNF-α是出現(xiàn)最早的起關(guān)鍵作用的炎癥因子,它能促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放;IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行宿主防御功能的炎癥因子;IL-6具有與IL-1β相似的生物學(xué)效應(yīng)[36]。本研究證實(shí)了枸杞籽油可顯著降低UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)和蛋白含量。蘇牧楠等[37]研究發(fā)現(xiàn)納豆提取物可明顯降低UVB照射后HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量,張艷晴[38]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛超濾組分可抑制UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似。

綜上所述,枸杞籽油可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)緩解UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷。主要通過(guò)提高HaCaT細(xì)胞存活率,抑制ROS過(guò)量生成,降低HaCaT細(xì)胞凋亡率,促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2、降低促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達(dá),減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量和mRNA的表達(dá),而枸杞籽油所含的不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、谷甾醇和維生素E為其抗UVB所致的光損傷提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。這為枸杞籽油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供新的思路,為天然植物油脂抗光損傷提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。