馮苗苗, 李錦英, 鄧高丕△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科(廣東廣州 510405); 2普寧市中醫(yī)醫(yī)院婦科(廣東揭陽 515343)

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì),宮頸癌是全球女性的第四大常見癌癥,位于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌之后,其中85%的病例來自于發(fā)展中國(guó)家,并且在發(fā)展中國(guó)家作為第二大常見癌癥[1]。早期和局部晚期宮頸癌患者的5年生存率分別是93%和65%,而對(duì)于轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性宮頸癌,5年生存率僅為17%[2]。目前,對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的治療主要通過全身化療獲得受益,臨床上常用的血管生成抑制劑、免疫檢查點(diǎn)抑制劑雖然在一定程度上提高了總生存率,但這些抑制劑仍需要在順鉑基礎(chǔ)上聯(lián)合治療[2]。由于鉑耐藥的產(chǎn)生,尤其在晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌患者中,1年生存率只有10%～20%[3],因此仍然需要不斷開發(fā)新的藥物來提高宮頸癌治療的有效性。研究發(fā)現(xiàn)天然中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑治療腫瘤的特點(diǎn),近些年來,從天然中藥中尋找抗癌藥物受到了越來越多研究者的關(guān)注[4]。雄黃在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有悠久的歷史,其主要成分為二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雄黃具有明顯的抗腫瘤作用[5]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了雄黃具有抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡的作用[6],但其治療宮頸癌的具體作用機(jī)制尚不清楚。大量研究表明IL-6/STAT3信號(hào)通路在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[7],基于此,2021年1月至2022年12月,本研究擬探討雄黃調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)軸影響宮頸癌細(xì)胞HeLa和Caski增殖與凋亡,為明確雄黃抗宮頸癌作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞HeLa、Caski細(xì)胞購(gòu)自北納生物。

1.1.2 藥品與試劑 雄黃干粉(編號(hào)211001)購(gòu)自三門峽玉皇山制藥有限公司;CCK8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;Annexvin V APC/PI雙染試劑盒購(gòu)自中國(guó)Elabscience公司;p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;STAT3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;RNA提取試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;GAPDH購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;RPMI1640購(gòu)自(北京)賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.1.3 儀器 LX-100手掌型離心肌(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);Applied Biosystems Step One qPCR儀(美國(guó)ABI公司);Direct-Pure UF純水系統(tǒng)(上海樂楓生物科技有限公司);電泳儀(北京市六一儀器廠);GL-3250A磁力攪拌器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);Novocyte D2060R流式細(xì)胞儀(Agilent)[艾森生物(杭州)有限公司];酶標(biāo)儀(華東電子)。Mini-PROTEAN 3 Cell(美國(guó)Bio-Rad公司);Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell(美國(guó)Bio-Rad公司);YXQ-LS-30SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 稱取100 mg雄黃溶于4 mL無菌水中,配制成25 mg/mL的雄黃溶液(母液),分別吸取1、2、3、4 μL母液于每毫升培養(yǎng)液中,根據(jù)既往研究[8],分別制備出25、50、75、100 mg/L雄黃培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa、Caski細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,并置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代,選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa和Caski細(xì)胞,以每孔細(xì)胞接種1×104個(gè)到96孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,次日,將細(xì)胞分別設(shè)置為對(duì)照組和不同濃度的雄黃組(25、50、75、100 μg/mL),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,加入不同濃度雄黃后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入含10 μL的CCK-8試劑孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定各組450 nm波長(zhǎng)處OD值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞用胰酶消化,離心收集細(xì)胞,加入2 mL Binding Buffer,離心收集細(xì)胞,去上清。加入100 μL Stain Buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V APC和5 μL PI溶液,室溫孵育15 min。加入100 μL Stain Buffer,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Q1為壞死細(xì)胞,Q2為晚期凋亡細(xì)胞,Q3為正常細(xì)胞,Q4為早期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率=Q2+Q4。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 加入RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞,取上清液測(cè)蛋白濃度,加入Loading buffer,加熱使蛋白變性,低溫保存?zhèn)溆?。蛋白上樣量?5 μg,采用12%SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結(jié)束后對(duì)蛋白進(jìn)行濕性轉(zhuǎn)膜,TBST清洗PVDF膜,加入5%脫脂奶粉的PBS,室溫封閉1 h。一抗(GAPDH稀釋比例1∶2 000,STAT3稀釋比例1∶1 000,p-STAT3稀釋比例1∶2 000)室溫結(jié)合1 h,分別TBST洗3次,每次10 min,二抗(GAPDH稀釋比例1∶10 000,STAT3稀釋比例1∶4 000,p-STAT3稀釋比例1∶4 000)室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次10 min。顯影,曝光5 min,拍照。計(jì)算各蛋白和GAPDH條帶的灰度值。

1.2.6 qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 采用Trizol法分別提取各組中總RNA,依據(jù)RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,在ABI Step One QPCR儀上進(jìn)行反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 15 s,退火60 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)摻,采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雄黃溶液對(duì)HeLa、Caski細(xì)胞增殖的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,不同濃度的雄黃組(25、50、75、100 μg/mL)分別作用于HeLa和Caski細(xì)胞24 h后,隨著濃度的增加,宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率顯著增加,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 雄黃溶液對(duì)HeLa、Caski細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,雄黃組(25、50、75、100 μg/mL)分別作用于HeLa和Caski細(xì)胞24 h后,宮頸癌細(xì)胞凋亡率隨著濃度增加而增加,見圖2、3。

注:H1:對(duì)照組;H2:25 μg/mL;H3:50 μg/mL;H4:75 μg/mL;H5:100 μg/mL

注:C1:對(duì)照組;C2:25 μg/mL;C3:50 μg/mL;C4:75 μg/mL;C5:100 μg/mL

2.3 雄黃抑制STAT3蛋白的激活 Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,不同濃度的雄黃組(25、50、75、100 μg/mL)分別作用于HeLa(圖4A)和Caski(圖4B)細(xì)胞24 h后, STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)均在兩種細(xì)胞中明顯下降(P<0.01),且呈劑量依賴性,見圖4、表2。

注:A:宮頸癌HeLa細(xì)胞;B:宮頸癌Caski細(xì)胞;與對(duì)照組比較,*P<0.01, **P<0.001

表2 宮頸癌HeLa和Caski細(xì)胞各組中STAT3、P-STAT3蛋白的表達(dá)量

2.4 雄黃對(duì)IL6、PARP、E6、Bcl-xL mRNA表達(dá)的影響 qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,不同濃度的雄黃組(25、50、75、100 μg/mL)作用于HeLa和Caski細(xì)胞24 h后,均能夠顯著下調(diào)兩種細(xì)胞中E6和 IL-6 mRNA的表達(dá),同時(shí)凋亡相關(guān)基因PARP和Bcl-xL也隨著降低,且呈劑量依賴性(P<0.01),見圖5、表3。提示雄黃可能通過抑制HPVE6癌蛋白來抑制IL-6/STAT3通路激活,誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

注:A:宮頸癌HeLa細(xì)胞;B:宮頸癌Caski細(xì)胞;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表3 宮頸癌HeLa和Caski細(xì)胞各組中IL-6、PARP、E6、Bcl-xL mRNA的表達(dá)量

3 討論

隨著惡性腫瘤發(fā)病率的逐年升高,中醫(yī)學(xué)者針對(duì)惡性腫瘤提出了“癌毒”病機(jī)的概念,對(duì)于宮頸癌,各大醫(yī)家認(rèn)為其是由濕、瘀、熱三毒夾雜、搏結(jié)所致的“癌毒”的形成。清熱解毒、以毒攻毒是這一病機(jī)的治療原則[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,以毒攻毒治法是通過中藥的細(xì)胞毒作用,抑制細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)及增強(qiáng)免疫功能等機(jī)制抗腫瘤[10],雄黃就是這種以毒攻毒類中藥之一,因此其可能在尋找合適的臨床抗腫瘤中藥中提供一定的參考。

在現(xiàn)代,雄黃在白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌等研究中均存在一定的抗癌作用。雄黃能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,尤其在Caski和HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生G2/M期阻滯[8],近期研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃能夠在體外抑制肺癌干細(xì)胞和小鼠肺癌移植瘤的生長(zhǎng)[11],另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃能夠抑制小鼠乳腺癌移植瘤模型的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。研究發(fā)現(xiàn)雄黃通過作用于Bcl-2/Bax/Cyt-C/AIF信號(hào)通路誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞死亡[13]。在我國(guó),含有雄黃的典型抗癌藥有六神丸和復(fù)方黃黛片,其中復(fù)方黃黛片聯(lián)合全反式維甲酸是治療APL的最佳理想方案[14]。

雄黃最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》的中品:“雄黃生山之陽,故曰雄;是丹之雄,所以名雄黃也”?！睹t(yī)別錄》云:“雄黃生武都山谷、敦煌山之陽,采無時(shí)?！奔葱埸S出自山的陽處而稟受陽氣。《神農(nóng)本草經(jīng)疏》曰:“雄黃稟火金之勝,得正陽之氣以生。蓋以陽明虛則邪惡易侵,陰氣勝則精鬼易憑,得陽氣之正者,能破幽暗,所以殺一切鬼邪,勝五兵也?！薄督饏T方歌括》:雄黃氣重,能排邪而引正;雄黃味苦,能燥濕解毒。由此可知雄黃稟純陽之氣、苦之味、氣重的特性。

《醫(yī)宗必讀》云:“積之成也,正氣不足,而后邪氣踞之?！睂m頸癌發(fā)病病機(jī)歸于正虛邪實(shí)。一則正氣虧虛為本,患者由于先天稟賦不足,臟腑功能薄弱;又因后天房勞多產(chǎn)或飲食失調(diào)導(dǎo)致腎氣虧損、脾胃受損,引起精血耗傷,氣血生化匱乏,無以充養(yǎng)機(jī)體,最終正氣虧虛,外邪侵入難御。二則以濕熱瘀毒為標(biāo),臨床表現(xiàn)為下焦宮頸癥瘕形成, 高危HPV持續(xù)感染是外來濕熱之毒侵襲機(jī)體,客于胞門,“邪之所湊,其氣必虛”,當(dāng)正氣虧虛,濕熱之毒有機(jī)可乘,體虛無力驅(qū)邪,致瘀久成毒,最終形成癌毒。故對(duì)于宮頸癌應(yīng)以扶正、清利濕熱、解毒驅(qū)邪為治療原則。通過古代醫(yī)家對(duì)雄黃的記載,其稟純陽之氣、苦之味、氣重的特點(diǎn)正是起到了扶正、祛除濕熱瘀毒之邪的功效,由此推測(cè)這可能是雄黃治療宮頸癌可行之處。

本研究結(jié)果顯示,雄黃對(duì)宮頸癌HeLa和Caski細(xì)胞增殖具有抑制作用,對(duì)凋亡也有促進(jìn)作用,且具有濃度依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn),雄黃下調(diào)了宮頸癌HeLa、Caski細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá),并抑制其磷酸化水平。IL-6/STAT3信號(hào)通路常常在腫瘤中是高度激活的,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)[15]。炎癥刺激下IL-6被過度分泌,導(dǎo)致JAK/STAT3信號(hào)通路的過度激活,激活的STAT3形成同源二聚體并作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核中,與目標(biāo)基因的特異性DNA反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的基因轉(zhuǎn)錄,另外腫瘤細(xì)胞中STAT3的過度激活又會(huì)誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生。宮頸癌中STAT3呈組成型激活狀態(tài),且與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展相關(guān),在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)shRNA敲低STAT3會(huì)導(dǎo)致小鼠高危型HPV陽性宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)減慢[16];還有研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽性宮頸癌細(xì)胞中STAT3磷酸化水平比HPV陰性宮頸癌更高[3]。這兩項(xiàng)研究提示高危型HPV與STAT3存在一定的關(guān)系,因?yàn)楦呶Ｐ虷PV致癌機(jī)制主要由其編碼的癌蛋白E6/E7驅(qū)動(dòng),而癌蛋白E6對(duì)IL-6/STAT3信號(hào)通路具有激活作用,激活的IL-6/STAT3又促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖,由此形成了正反饋?zhàn)饔肹17]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的雄黃對(duì)E6和IL-6基因均具有抑制作用,且呈濃度依賴性,由此推測(cè)雄黃可能通過抑制HPVE6介導(dǎo)的IL6/STAT3發(fā)揮抗腫瘤作用,從而阻斷了這一正反饋通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Bcl-xL是抗凋亡Bcl-2蛋白家族的重要成員,是STAT3的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。Bcl-xL通過多種途徑抵抗細(xì)胞凋亡。在線粒體中,Bcl-xL通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性來防止細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-xL可以促進(jìn)靜息G0期延長(zhǎng)并延遲G0到S的轉(zhuǎn)變,靜止的細(xì)胞通常對(duì)細(xì)胞死亡更具抗性[18]。另外Bcl-xL通過易位到細(xì)胞核中來調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因,如基質(zhì)金屬蛋白酶-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲,這一過程也協(xié)助了癌細(xì)胞逃避凋亡[19]。據(jù)報(bào)道,Bcl-xL還可以刺激癌細(xì)胞中活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生,同時(shí)還可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS毒性[20]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-xL比Bcl-2具有更強(qiáng)的抗凋亡作用,在乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Bcl-xL抗凋亡作用是Bcl-2的10倍,這可能是因?yàn)锽cl-xL能夠阻止不同細(xì)胞器導(dǎo)致的凋亡[21],也與Bcl-xL同時(shí)抑制Bax和Bar有關(guān);顯然Bcl-xL在癌細(xì)胞生存中是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。Bcl-xL作為IL-6/STAT的靶基因,雄黃處理宮頸癌細(xì)胞過程中也明顯降低了該靶基因的表達(dá),且隨著濃度的升高,降低越顯著。另外,PARP作為DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵分子,維持基因組的穩(wěn)定性,PARP的明顯下降也代表了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,本研究中同樣發(fā)現(xiàn)雄黃作用后PARP出現(xiàn)明顯的下降。

綜上所述,根據(jù)雄黃的中藥特性和宮頸癌病機(jī)特點(diǎn),推測(cè)雄黃對(duì)宮頸癌具有一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的雄黃可能通過抑制HPVE6/IL6/STAT3信號(hào)通路,導(dǎo)致抗凋亡關(guān)鍵因子Bcl-xL和PARP表達(dá)下降從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:馮苗苗負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫;李錦英負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析;鄧高丕負(fù)責(zé)監(jiān)督和指導(dǎo)。