張 俊,黃冬梅,黃宣運(yùn),史永富,王 媛,田良良

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海),上海 200090)

甲霜靈常作為一種在農(nóng)田中使用的殺菌劑,主要用于治療黃瓜、番茄、馬鈴薯等作物的霜霉病、黑胚病以及晚疫病[1-2]等,已被使用40余年[3],甲霜靈的殘留問(wèn)題及其危害性也日益凸顯。國(guó)外研究表明,甲霜靈對(duì)于暴露于其中的人淋巴細(xì)胞具有基因毒性[4]。因此,在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021[5]中規(guī)定了洋蔥、花生仁、糙米和葡萄等農(nóng)產(chǎn)品及其加工制品中甲霜靈的最大殘留限量,為0.05～5.0 mg·kg-1。但是甲霜靈在水產(chǎn)上的相關(guān)研究不多,其在2017年才被批準(zhǔn)為新型漁用藥物,獲得新獸藥證書(shū),在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要是作為孔雀石綠的替代藥物,用于治療養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的水霉病,但未有相關(guān)水產(chǎn)品的殘留限量規(guī)定。因此,亟需建立相應(yīng)的甲霜靈檢測(cè)方法對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全進(jìn)行監(jiān)測(cè),同時(shí)為制定水產(chǎn)品中殘留限量提供方法依據(jù)。

目前甲霜靈殘留量的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜法(GC)[9-10]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[11-13]等,但是這些方法的檢測(cè)基質(zhì)多為果蔬類(lèi)等農(nóng)產(chǎn)品,很少針對(duì)水產(chǎn)品。水產(chǎn)品具有高脂高蛋白的特點(diǎn),與基質(zhì)成分較為簡(jiǎn)單的果蔬類(lèi)差別較大,二者檢測(cè)方法之間不具有通用性。文獻(xiàn)[14]開(kāi)發(fā)了基于單克隆抗體的膠體金試紙條,用于測(cè)定水產(chǎn)品草魚(yú)、凡納濱對(duì)蝦等中的甲霜靈含量,但方法的檢出限較高,為2 mg·kg-1,無(wú)法滿足高靈敏定量檢測(cè)的要求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點(diǎn),作為陽(yáng)性樣品復(fù)檢的指定檢測(cè)方法之一,對(duì)于快速檢測(cè)方法初篩結(jié)果不確定的樣品可做到精準(zhǔn)的定性定量檢測(cè)。本工作提出了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多種水產(chǎn)品中甲霜靈的殘留量,針對(duì)水產(chǎn)品復(fù)雜基質(zhì),可兼顧凈化效果的同時(shí)縮短前處理時(shí)間,實(shí)用性強(qiáng)。另外,采用甲霜靈-d6作為內(nèi)標(biāo)可提高結(jié)果準(zhǔn)確度,該方法能夠?qū)崿F(xiàn)大批量水產(chǎn)品中甲霜靈殘留的痕量檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX UltiMate 3000 RS Pump-UHPLC Focused型超高效液相色譜儀;TSQ Quantum Access型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子(ESI)源;Genius 3型旋渦混合器;16RⅫ型高速冷凍離心機(jī);VisiprepTM DL固相萃取裝置;N-EVAPTM 112型氮吹濃縮儀;Milli-Q型超純水機(jī);Agela Cleanert S C18固相萃取柱(6 mL,500 mg);0.22 μm針式水相尼龍濾膜。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L-1,分別準(zhǔn)確稱(chēng)取甲霜靈、甲霜靈-d6標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于-18 ℃冰箱冷凍避光保存。臨用前分別用乙腈稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的甲霜靈、甲霜靈-d6標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱避光保存。

甲霜靈、甲霜靈-d6標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%;乙腈、正己烷為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm);流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量 0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量 10 μL;柱溫 40 ℃。梯度洗脫程序:0～1.50 min時(shí),B為10%;1.50 ～4.00 min時(shí),B由10%升至90%,保持2.50 min;6.50～6.67 min時(shí),B由90%跳轉(zhuǎn)至100%,保持1.33 min;8.00～8.17 min時(shí),B由100%跳轉(zhuǎn)至10%,保持1.83 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

ESI源,正離子(ESI+)掃描方式;選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)掃描模式;離子噴射電壓 4 500 V;掃描時(shí)間 50 ms;離子傳輸管溫度 320 ℃;鞘氣流量 6.7 L·min-1,輔助氣流量 3.3 L·min-1。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。其中,“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

試驗(yàn)所用鯽魚(yú)、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌采自上海,均參照GB/T 30891—2014[15]制備樣品,于-20 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取(5±0.05)g樣品,加入10 ng的內(nèi)標(biāo)甲霜靈-d6,靜置10 min,加入10 mL含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸的乙腈溶液,以轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1渦旋混合5 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速離心10 min,取上清液于20 mL刻度玻璃管中,于45 ℃氮吹濃縮至0.5 mL以下。向玻璃管中加入7.5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液,混勻。以轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1渦旋1 min,轉(zhuǎn)移至50 mL塑料離心管中,待凈化。

1.3.3 樣品凈化與濃縮

加入7.5 mL正己烷,以轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1渦旋混合1 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速離心10 min后用膠頭滴管吸去上層正己烷,下層液體過(guò)Agela Cleanert S C18固相萃取柱(預(yù)先依次用3 mL乙腈活化,3 mL水淋洗)進(jìn)一步凈化。用5 mL的水淋洗并抽干,用4 mL乙腈以1滴·s-1的流量洗脫。洗脫液于45 ℃氮吹至干,用1 mL 20%乙腈溶液復(fù)溶,混勻后過(guò)0.22 μm針式水相尼龍濾膜,濾液收集至進(jìn)樣小瓶中,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

5 μg·L-1甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液及其10.0 μg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液的選擇離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 選擇離子色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱

甲霜靈具有一個(gè)芳香環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出一定的非極性特征。試驗(yàn)選擇了一款針對(duì)芳香型化合物的Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm),以及一款通用型SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm)進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲霜靈在兩款色譜柱中均能夠出峰,峰形良好且半峰寬均在0.25 min左右。為統(tǒng)一比較,后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)均使用SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱進(jìn)行色譜分離。

2.2.2 流動(dòng)相

乙腈和甲醇是比較常見(jiàn)的流動(dòng)相,因此試驗(yàn)將其作為流動(dòng)相有機(jī)相。為了提高化合物離子化效率、改善峰形,通常在流動(dòng)相水相中添加少量的揮發(fā)性酸,因此選擇水以及0.1%甲酸溶液分別作為流動(dòng)相水相。試驗(yàn)分別比較了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)對(duì)甲霜靈的分離效果,根據(jù)不同流動(dòng)相條件下甲霜靈的響應(yīng)值來(lái)確定最佳流動(dòng)相。

結(jié)果表明,甲霜靈在3種不同流動(dòng)相中均能夠被洗脫且分離良好、峰形尖銳,但其在各流動(dòng)相中的響應(yīng)值不盡相同。如圖2所示:當(dāng)使用0.1%甲酸溶液作為水相時(shí),其提供的氫離子使0.1%甲酸溶液-甲醇體系和0.1%甲酸溶液-乙腈體系中的甲霜靈離子化效率提高;當(dāng)使用乙腈作為有機(jī)相時(shí),0.1%甲酸溶液-乙腈體系的色譜峰峰形較好且響應(yīng)值較高。因此,試驗(yàn)選擇0.1%甲酸溶液-乙腈體系作為甲霜靈的流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相的分離效果

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為500 μg·L-1的甲霜靈和甲霜靈-d6的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵分別注入質(zhì)譜儀,確定母離子為m/z280.0和286.1,再通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜掃描,選擇穩(wěn)定且豐度高的碎片離子作為定量離子,離子豐度次之者作為定性離子,對(duì)確定的母離子、子離子進(jìn)行碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化,具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 提取劑

根據(jù)甲霜靈的化學(xué)性質(zhì),甲霜靈能溶于乙腈、水、甲醇等試劑,同時(shí)參考已有的文獻(xiàn)[6,11]中方法,試驗(yàn)初步嘗試以0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液、20%乙腈溶液、乙腈、甲醇、含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水的乙腈溶液(記作1%氨化乙腈)、含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑。使用峰面積的相對(duì)響應(yīng)比值來(lái)比較不同提取劑對(duì)甲霜靈的提取效果(以含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑時(shí)甲霜靈響應(yīng)值為100%計(jì),其他試劑提取時(shí)的響應(yīng)值與其比較)。

由于過(guò)固相萃取柱需要水溶液上樣,因此試驗(yàn)首先嘗試使用水相占比較高的溶液作為提取劑。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):當(dāng)使用0.1%磷酸溶液提取時(shí),魚(yú)、蝦、蟹3種基質(zhì)中均有大量水溶性蛋白雜質(zhì)被提取出來(lái),易堵塞固相萃取柱,進(jìn)而導(dǎo)致試驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行;使用20%乙腈溶液提取時(shí),魚(yú)基質(zhì)提取液澄清,而蝦、蟹類(lèi)基質(zhì)的提取液仍舊渾濁,難以過(guò)柱。因此考慮采用有機(jī)試劑(甲醇、乙腈、1%氨化乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液)提取,以減少水溶性雜質(zhì)的溶出。不同提取劑的提取效果見(jiàn)圖3。

圖3 不同提取劑的提取效果

結(jié)果表明:使用甲醇提取樣品時(shí),發(fā)現(xiàn)上機(jī)檢測(cè)的色譜圖存在雜峰干擾;使用乙腈和1%氨化乙腈提取時(shí)發(fā)現(xiàn)存在基質(zhì)干擾,目標(biāo)物色譜峰的響應(yīng)值低;而以含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑時(shí),由于酸的存在沉淀了其他提取劑未能沉淀的部分蛋白,降低了基質(zhì)的干擾,且氮吹時(shí)間短、目標(biāo)物色譜峰前后無(wú)明顯雜峰、回收率高。綜合考慮,試驗(yàn)選擇含1%乙酸的乙腈溶液作為提取劑。

2.4.2 溶解試劑

試驗(yàn)采用含1%乙酸的乙腈溶液提取后,提取液中仍存在部分脂類(lèi)、色素雜質(zhì)以及少量蛋白。提取液濃縮后需要用合適的溶解試劑,在將目標(biāo)物充分溶解出來(lái)的同時(shí),盡量不溶解雜質(zhì),否則這些雜質(zhì)的存在會(huì)使復(fù)溶后的溶液呈渾濁或黏稠狀態(tài)。試驗(yàn)利用甲霜靈與雜質(zhì)在溶液中溶解度不同的特性,比較了水和20%乙腈溶液作為溶解試劑時(shí)的效果差異。水對(duì)甲霜靈具有一定的溶解度,而脂類(lèi)等雜質(zhì)則基本不溶于水,可根據(jù)此特性復(fù)溶甲霜靈。但是結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于水無(wú)法將包裹在雜質(zhì)中的少量甲霜靈溶解出來(lái),回收率略低,比20%乙腈溶液的低25%左右,且回收率不穩(wěn)定。而20%乙腈溶液保證了多數(shù)甲霜靈的溶解,降低了目標(biāo)物的損失,且結(jié)果穩(wěn)定。此外,該步驟還可將溶液狀態(tài)由純有機(jī)相改為了水相占比較多的狀態(tài),滿足了其后過(guò)柱的需求。因此,試驗(yàn)選擇20%乙腈溶液為溶解試劑。

2.4.3 正己烷體積

與植物源性基質(zhì)不同,水產(chǎn)品基質(zhì)樣品含有豐富的蛋白和脂類(lèi)物質(zhì),這是造成基質(zhì)干擾的主要原因。提取劑在提取目標(biāo)物的同時(shí),必定有一部分脂類(lèi)及蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)被同時(shí)提取出來(lái),導(dǎo)致樣品測(cè)定時(shí)出現(xiàn)較多干擾,影響測(cè)定結(jié)果,因此須對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理。正己烷是水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)中常用的除脂試劑。試驗(yàn)首先采用3 mL正己烷凈化,過(guò)柱氮吹后,魚(yú)和蝦類(lèi)樣品的試管底部均無(wú)油脂殘留。由于蟹(性腺和肝胰腺)和貝類(lèi)(肝胰腺)的可食部位中油脂含量過(guò)高,經(jīng)3 mL正己烷凈化后仍有油脂殘留。因此,試驗(yàn)將正己烷體積增大至7.5 mL,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用7.5 mL正己烷時(shí),蟹和貝類(lèi)樣品在氮吹后試管中油脂量相對(duì)較少。因此,試驗(yàn)選擇正己烷體積為7.5 mL。

2.4.4 固相萃取柱

僅用正己烷凈化,在上機(jī)后仍有明顯的雜質(zhì)干擾目標(biāo)物檢測(cè),因此采用固相萃取法進(jìn)一步凈化除雜,對(duì)固相萃取柱的類(lèi)型進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)在正己烷去脂后的空白基質(zhì)液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)已活化的固相萃取柱來(lái)考察效果,對(duì)比了不同固相萃取柱Oasis HLB、Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P以及Agela Cleanert S C18的凈化效果以及對(duì)甲霜靈峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同固相萃取柱的凈化效果

Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P是一類(lèi)新型的固相萃取柱,無(wú)需進(jìn)行柱活化和柱平衡步驟,操作簡(jiǎn)便。但經(jīng)二者凈化后,上機(jī)檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)峰較多且甲霜靈響應(yīng)值低,分別為5.24×105和5.58×105,說(shuō)明這兩種固相萃取柱對(duì)樣品組分有吸附作用,除雜能力較弱。Oasis HLB和Agela Cleanert S C18固相萃取柱使用前需要經(jīng)過(guò)活化和平衡,二者凈化原理類(lèi)似且均采用水溶液上樣,水淋洗,乙腈洗脫。上機(jī)檢測(cè)結(jié)果顯示:經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化后的甲霜靈響應(yīng)值較低,且過(guò)柱時(shí)間也較長(zhǎng);而Agela Cleanert S C18固相萃取柱富集凈化效果更好、速率較快、溶液澄清,甲霜靈色譜峰響應(yīng)值高。因此,試驗(yàn)選擇Agela Cleanert S C18固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

在加入內(nèi)標(biāo)后,通過(guò)乙腈純?nèi)軇┖突|(zhì)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比,對(duì)化合物的基質(zhì)效應(yīng)狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)。其計(jì)算公式[16]如下:基質(zhì)效應(yīng)=(1-空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)×100%,一般基質(zhì)效應(yīng)在-15%～15%內(nèi)說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)不顯著[17]。結(jié)果顯示,鯽魚(yú)、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌等4種水產(chǎn)品基質(zhì)效應(yīng)分別為-1.55%,-5.18%,-7.15%,-10.24%,均在-15%～15%內(nèi),說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)影響不顯著,通過(guò)乙腈制作標(biāo)準(zhǔn)曲線即可。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

取適量的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈逐級(jí)稀釋,配制成甲霜靈質(zhì)量濃度為1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,內(nèi)標(biāo)甲霜靈-d6的質(zhì)量濃度為10 μg·L-1。按照儀器工作條件測(cè)定,以甲霜靈的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),甲霜靈與甲霜靈-d6的峰面積之比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1.0～100.0 μg·L-1,線性回歸方程為y=2.258×10-2x+1.352×10-2,相關(guān)系數(shù)為0.997 7。

空白樣品經(jīng)處理后,測(cè)試其信噪比(S/N),分別確定檢出限和測(cè)定下限。以3倍信噪比得到目標(biāo)物的檢出限(3S/N),結(jié)果為0.5 μg·kg-1;以10倍信噪比得到目標(biāo)物的測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果為1 μg·kg-1。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

分別以鯽魚(yú)、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌空白樣品5.0 g為研究對(duì)象,進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3可知,甲霜靈的回收率為93.8%～105%,RSD均小于13%,其回收率和精密度均可滿足對(duì)水產(chǎn)品中甲霜靈的檢測(cè)要求。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)從本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)留存的不同批次樣品中隨機(jī)抽取鯽魚(yú)、羅氏沼蝦、中華絨螯蟹、河蚌等24個(gè)樣品及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的6個(gè)鯽魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢出目標(biāo)物。

本工作通過(guò)對(duì)水產(chǎn)品中甲霜靈的樣品前處理方法和儀器工作條件進(jìn)行研究,優(yōu)化了不同提取劑、凈化方式、固相萃取條件以及色譜條件,提出了同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多種水產(chǎn)品中甲霜靈殘留量的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng),可同時(shí)在魚(yú)、蝦、蟹、貝4類(lèi)高脂肪、高蛋白的復(fù)雜基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)對(duì)甲霜靈殘留的定量檢測(cè)。同位素內(nèi)標(biāo)的加入也有效校正了前處理過(guò)程損失所帶來(lái)的偏差,提高了方法的準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性,可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速測(cè)定。