盧 鑫,張 琳,王鐵良,周曉華

(1. 濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)護(hù)理學(xué)院,濟(jì)源 459000;2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,鄭州 450002)

1817年人們發(fā)現(xiàn)硒元素后,硒一直被作為一種有毒有害的元素進(jìn)行研究,直到1957年SCHWARZK等研究發(fā)現(xiàn)硒具有營(yíng)養(yǎng)作用,進(jìn)而改變了人們對(duì)硒的認(rèn)知。作為人體必須的微量元素之一,硒具有清除自由基、拮抗重金屬、調(diào)控基因表達(dá)、防癌抗癌、增強(qiáng)人體免疫功能等作用[1-3]。研究證明不同形態(tài)的硒對(duì)人體毒性、生物效應(yīng)及防癌作用不同,硒的化學(xué)形態(tài)決定硒的可利用價(jià)值[4-6]。與無機(jī)硒比,有機(jī)硒毒性小,生物利用度高[7-8]。農(nóng)作物噴灑無機(jī)硒和土壤施無機(jī)硒肥是富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)最常見的方式。大豆是硒富集的理想載體,富硒大豆可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用將外源無機(jī)硒吸收,進(jìn)一步在植物體內(nèi)代謝合成硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)等有機(jī)硒[9-11]。

目前,富硒農(nóng)產(chǎn)品中硒元素總量測(cè)定技術(shù)比較成熟[12-17],各種形態(tài)硒的檢測(cè)技術(shù)還沒有統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。近年來隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展,硒形態(tài)的分析方法研究比較活躍[18-27]。高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)、毛細(xì)管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(CE-ICP-MS)、高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-ESI-MS/MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)等成為了研究熱點(diǎn)。其中,HPLC-HG-AFS具有分析成本低、儀器普及率高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn),尚未見應(yīng)用在分析富硒大豆中有機(jī)硒形態(tài)的報(bào)道。因此,本工作提出了HPLC-HG-AFS測(cè)定富硒大豆中硒代氨基酸SeCys、SeMet和MeSeCys含量(以硒計(jì),下同)的方法,該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確,結(jié)果令人滿意。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SA-50型高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀,配100 μL進(jìn)樣環(huán)的自動(dòng)進(jìn)樣器;Milli-Q Syhthesis型超純水系統(tǒng);HH-4型精密恒溫液浴槽;KQ-500E型超聲儀;H-2050R型高速離心機(jī)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 g·L-1,稱取MeSeCys、SeMet、SeCys標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確到0.01 mg),分別加入0.5 mol·L-1鹽酸溶液1 mL、適量水溶解,并用水定容至10 mL,搖勻,配制成1 g·L-1單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,保存在0～4 ℃的冰箱中,備用。使用時(shí)用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 mg·L-1,分別移取適量的MeSeCys、SeMet、SeCys單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水稀釋并定容,配制成1.00 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為5,10,20,40,60,100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,現(xiàn)配現(xiàn)用。

鏈霉蛋白酶:S10014-250 mg,9036-06-0,BR(規(guī)格)7 000 U·mg-1;脂肪酶:S10036-25 g,9001-62-1,BR(規(guī)格)20 000 U·mg-1;MeSeCys、SeMet標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為98%;SeCys標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99%;檸檬酸、磷酸氫二銨、碘化鉀、四丁基溴化銨均為優(yōu)級(jí)純;甲醇、乙腈均為色譜純;硼氫化鉀、鹽酸、氫氧化鉀、硝酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

大豆樣品來自濟(jì)源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技人員種植的富硒大豆、市售富硒/普通大豆。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agela MP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);進(jìn)樣量100 μL;流量1.0 mL·min-1;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速60 r·min-1;柱溫25 ℃;流動(dòng)相 含2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨的40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 7.0),等度洗脫。

1.2.2 光譜條件

負(fù)高壓290 V;原子化器高度9 mm;燈電流90 mA;載氣、屏蔽氣為氬氣,流量分別為300,500 mL·min-1。

1.3 試驗(yàn)方法

將富硒大豆樣品粉碎,過60目(孔徑0.25 mm)篩,作為待測(cè)樣品。按照NY/T 1285—2007《油料種籽含油量的測(cè)定 殘余法》對(duì)適量樣品進(jìn)行脫脂處理;總硒測(cè)定依據(jù)GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》進(jìn)行。

稱取0.1 g脫脂樣品于離心管中,加入5 mL pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液,超聲振蕩30 min,加入鏈霉蛋白酶15 mg,在37 ℃恒溫條件下振蕩酶解5 h,以轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1離心8 min,取上清液過0.22 μm尼龍有機(jī)濾膜,濾液按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

常用的色譜柱DionexAS19無法分離SeMet和MeSeCys,對(duì)SeCys的響應(yīng)值太弱;Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱無論等度洗脫還是梯度洗脫需要時(shí)間均較長(zhǎng),分離SeMet重復(fù)性差、靈敏度低;而Agela MP-C18色譜柱對(duì)有機(jī)硒有較好的分離效果[16,24]。因此,選用Agela MP-C18色譜柱用于3種硒代氨基酸的同時(shí)分離檢測(cè)。

試驗(yàn)選取檸檬酸和磷酸氫二銨溶液作為流動(dòng)相,考察了其對(duì)3種硒代氨基酸的分離效果。結(jié)果表明:以檸檬酸溶液為流動(dòng)相時(shí),無論等度洗脫還是梯度洗脫,SeCys和MeSeCys均未完全實(shí)現(xiàn)基線分離,分離色譜圖如圖1(a)所示。以40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液為流動(dòng)相時(shí),可以實(shí)現(xiàn)3種硒代氨基酸的分離,但峰形不太理想。流動(dòng)相中加入0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨、2%甲醇,不僅可以改變硒代氨基酸的峰形,還可以增強(qiáng)檢測(cè)的信號(hào)。試驗(yàn)還進(jìn)一步優(yōu)化了流動(dòng)相的酸度。當(dāng)流動(dòng)相pH為7.0時(shí),3種硒代氨基酸峰形明顯改善,峰形更尖、峰寬更窄,對(duì)稱性良好,在7 min內(nèi)可以完全分離,如圖1(b)所示。因此,試驗(yàn)選擇含2%甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨的40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 7.0)為流動(dòng)相。

圖1 3種硒代氨基酸在不同流動(dòng)相洗脫下的色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 酶種類

試驗(yàn)選取總硒含量較高的富硒大豆樣品(總硒量1.29 mg·kg-1)進(jìn)行前處理優(yōu)化,比較了鏈霉蛋白酶和脂肪酶對(duì)富硒大豆硒形態(tài)提取的影響。分別稱取6份0.1 g脫脂樣品和富硒大豆鮮樣,雙平行,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液5 mL,超聲30 min后,再分別加入脂肪酶15 mg+鏈霉蛋白酶15 mg、鏈霉蛋白酶15 mg、脂肪酶15 mg,于37 ℃酶解,然后用高速離心機(jī)離心處理,脫脂樣品直接過0.22 μm有機(jī)濾膜,鮮樣過C18小柱后過0.22 μm有機(jī)濾膜,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,只加脂肪酶的富硒大豆鮮樣和脫脂樣品都沒有出現(xiàn)目標(biāo)峰,其余組別均為SeMet的色譜峰;兩種酶組合使用時(shí),無論是富硒大豆鮮樣還是脫脂樣品,目標(biāo)峰面積較鏈霉蛋白酶的幾乎沒有改變。因此,試驗(yàn)選用鏈霉蛋白酶酶解,使用脫脂樣品進(jìn)行試驗(yàn),不需過C18小柱,方便簡(jiǎn)單,節(jié)省時(shí)間,降低成本。

2.2.2 酶用量

稱取0.1 g脫脂后的富硒大豆樣品5份,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液5 mL,超聲振蕩30 min后,分別加入鏈酶蛋白酶5,10,15,20,25 mg,于37 ℃酶解,然后用高速離心機(jī)離心后過0.22 μm有機(jī)濾膜,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,以SeMet的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢測(cè)指標(biāo),結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,加入15 mg鏈霉蛋白酶時(shí)提取率已經(jīng)很高,再增加鏈霉蛋白酶量,提取到的SeMet量變化很小?？紤]檢測(cè)成本因素,試驗(yàn)選擇鏈霉蛋白酶的用量為15 mg。

圖2 酶用量對(duì)SeMet質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.3 提取劑

稱取0.1 g脫脂樣品5份,分別加入水、10%(體積分?jǐn)?shù),下同)硝酸溶液、15%(體積分?jǐn)?shù),下同)鹽酸溶液、pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液、20%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液5 mL,超聲振蕩30 min后,再分別加入15 mg鏈霉蛋白酶,于37 ℃酶解,用高速離心機(jī)離心后過0.22 μm有機(jī)濾膜,按照儀器工作條件測(cè)定。結(jié)果表明,10%硝酸溶液、15%鹽酸溶液提取率較低,而20%甲醇溶液、水和pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液提取率較高,其中pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液提取率最高。這是因?yàn)槲被嵋杂坞x態(tài)和蛋白形態(tài)存在于農(nóng)作物中,水可以將樣品中游離硒代氨基酸提取出來,但不能提取蛋白形態(tài)的氨基酸。酸盡管可以打破蛋白中連接氨基酸間的肽鍵,釋放氨基酸,但酸解過程需要控制條件,否則蛋白會(huì)被過度分解。Tris-HCl緩沖液可以先得到游離態(tài)和蛋白形態(tài)硒代氨基酸,然后在鏈霉蛋白酶作用下得到硒代氨基酸。因此,試驗(yàn)選用pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液作為提取劑。

2.2.4 提取條件

稱取0.1 g脫脂樣品,以硒代氨基酸總量為指標(biāo)值,對(duì)提取劑濃度(A)、提取劑用量(B)、提取劑酸度(C)、提取時(shí)間(D)等4個(gè)因素按正交表L9(3)4進(jìn)行試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)果表明:SeMet是富硒大豆中硒的主要賦存形態(tài)。由極差R可知,以3種硒代氨基酸總和為指標(biāo)值,提取因素影響由大到小依次為C、A、B、D,A2B2C3D2為正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合?？紤]提取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響硒形態(tài)的穩(wěn)定性和工作效率,試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為30 min。綜合考慮,試驗(yàn)選擇3種硒代氨基酸的提取條件是提取劑濃度為130 mmol·L-1,提取劑用量為5 mL,提取劑的pH為7.5,提取時(shí)間為30 min。

2.3 保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以3種硒代氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:3種硒代氨基酸在5～100 μg·L-1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)不小于0.999 5;3種硒代氨基酸的保留時(shí)間、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 保留時(shí)間、線性參數(shù)和檢出限

在空白樣品中加入5 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用逐級(jí)稀釋法,以3倍基線噪聲測(cè)定硒代氨基酸的檢出限。當(dāng)取樣量為0.1 g,定容體積為5 mL時(shí),檢出限換算結(jié)果見表2。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

選取總硒含量較高的富硒大豆樣品(總硒量1.29 mg·kg-1),脫脂后按照試驗(yàn)方法測(cè)定3種硒代氨基酸的本底值,并分別進(jìn)行低、中、高3種濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定7次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

由表3可知,3種硒代氨基酸的回收率為85.5%～103%,測(cè)定值的RSD不大于3.0%,說明方法準(zhǔn)確度和精密度均較高。

2.5 樣品分析

在優(yōu)化的儀器工作條件下,采用試驗(yàn)方法測(cè)定一些市售富硒大豆和普通大豆中硒代氨基酸的含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果

結(jié)果表明:富硒大豆中硒賦存形態(tài)為SeMet,含量(以硒計(jì))占總硒量比率在85.5%～94.5%內(nèi)。這與液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[24]測(cè)定大豆中硒形態(tài)含量的結(jié)論一致。市售富硒大豆1的色譜圖見圖4。由保留時(shí)間可知富硒大豆中硒賦存形態(tài)為SeMet。

圖4 市售富硒大豆1中SeMet的色譜圖

本工作優(yōu)化了大豆樣品中硒代氨基酸的前處理?xiàng)l件,提出了HPLC-HG-AFS測(cè)定富硒大豆中不同形態(tài)硒代氨基酸含量的方法,結(jié)果表明富硒大豆中硒主要賦存形態(tài)為SeMet。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確,所用設(shè)備價(jià)格適中,便于推廣,對(duì)發(fā)展富硒功能農(nóng)業(yè)、監(jiān)測(cè)食品安全、評(píng)估市售富硒大豆產(chǎn)品品質(zhì)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。