李根容,阮 燕,田小艷,余文琴,蔡 瓊

(1.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院,重慶 401123;2.國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,重慶 401123)

異噻唑啉酮類化合物是一類含有氮原子和硫原子的五元雜環(huán)化合物,主要包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(OIT)等。異噻唑啉酮類化合物是一種重要的滅菌防腐劑,因具有高效、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、可降解等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)園林、造紙、日化等領(lǐng)域[1-3]。研究表明,該類化合物具有細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性,是一類致敏劑,可導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生接觸性過敏或皮炎等癥狀[4-5]。蔬菜中殘留的異噻唑啉酮類化合物被人們直接攝入,危害身體健康[6]。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)玩具、化妝品、食品接觸材料等日用品中異噻唑啉酮類殺菌防腐劑的使用制定了嚴(yán)格的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)[7-8],但我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)蔬菜中的異噻唑啉酮類化合物的使用量和使用范圍進(jìn)行規(guī)定,僅在2015年農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所起草發(fā)布的《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)中規(guī)定BIT、MIT的限量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.1%、0.002 2%,但正式稿至今還未出臺(tái)。因此,開發(fā)測(cè)定異噻唑啉酮類化合物含量的分析方法對(duì)保障蔬菜食品安全具有重要意義。

目前,異噻唑啉酮類化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[10]、紫外分光光度法[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)[13-16]等。HPLC靈敏度低,易出現(xiàn)假陽性,已經(jīng)無法滿足檢驗(yàn)檢測(cè)要求;GC和GC-MS/MS操作繁瑣,分析時(shí)間長(zhǎng)且容易造成目標(biāo)物的損失。相較之下UHPLC-MS/MS檢出限低,選擇性好,分析時(shí)間短,更適用于檢測(cè)復(fù)雜體系中極性較強(qiáng)和沸點(diǎn)較高的異噻唑啉酮類化合物。然而,UHPLC-MS/MS檢測(cè)異噻唑啉酮類化合物主要集中于化妝品、紙張、膠黏劑等領(lǐng)域,蔬菜中異噻唑啉酮類化合物的檢測(cè)尚未見報(bào)道。因此,本工作提出了一種以乙腈為提取溶劑,結(jié)合固相萃取凈化技術(shù),采用UHPLC-MS/MS測(cè)定蔬菜中4種異噻唑啉酮類化合物含量的方法,以期為蔬菜中異噻唑啉酮類化合物的檢測(cè)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ExionLC型超高效液相色譜儀,AB SCIEX API 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子(ESI)源;3K15型醫(yī)用離心機(jī);SP-40LN型氮?dú)獍l(fā)生器;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器;QSPE-24型固相萃取裝置。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取0.1 mL的CMIT、MIT、BIT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,0.005 mL的OIT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中,以10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液定容,得到CMIT、MIT、BIT、OIT質(zhì)量濃度分別為1,1,1,0.05 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

CMIT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.7%;MIT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為100.0%±1.0%;BIT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.8%;OIT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為98.96%,于0～4 ℃避光儲(chǔ)存;甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯均為色譜純;其余試劑為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQIUTY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫 35 ℃;進(jìn)樣量 2 μL;流量0.3 mL·min-1;流動(dòng)相A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～0.5 min時(shí),A由0升至95%;0.5～1.5 min時(shí),A由95%降至80%;1.5～2.5 min時(shí),A由80%降至5%,保持1.0 min;3.5～4.0 min時(shí),A由5%升至95%,保持1.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

ESI源,正離子(ESI+)掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)采集模式;離子噴霧電壓 5 500 V;離子源溫度 600 ℃;干燥氣和霧化氣均為高純氮?dú)?4種異噻唑啉酮類化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

2.3 血清因子與肺功能及EOS、ACT評(píng)分的相關(guān)性分析 血清IgE、IL-4水平與FVC 、FEV1、FEV1/FVC及ACT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與痰EOS呈正相關(guān)(P<0.05)；RPB水平與FVC 、FEV1、FEV1/FVC及ACT評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，與痰EOS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

準(zhǔn)確稱取10.0 g(精確至0.01 g)已勻漿的蔬菜樣品置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取30 min后以轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1離心3 min。取上清液,殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取一次,合并乙腈提取液,加入5 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min后靜置5 min,取上層乙腈相,于40 ℃氮吹濃縮至近干,用2 mL 10%甲醇溶液溶解殘?jiān)?待凈化。

1.3.2 樣品凈化

將HLB固相萃取小柱置于固相萃取裝置上,依次用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子,然后將待凈化的提取液全部轉(zhuǎn)移到已活化平衡的HLB固相萃取小柱中,待液體全部流出,加入5 mL 10%甲醇溶液淋洗,棄去流出液,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于40 ℃氮吹濃縮至近干后,用甲醇定容至1 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

試驗(yàn)分別考察了SHIM-PARK CISS C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)、ZORBOX ECLISE PLUS C8(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Kromasil C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)、ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)4種色譜柱對(duì)4種異噻唑啉酮類化合物的分離效果,結(jié)果見圖1。

1—MIT;2—CMIT;3—BIT;4—OIT

結(jié)果表明,4種色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留能力差別不大,但ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果相對(duì)較好,響應(yīng)較高,目標(biāo)物均能實(shí)現(xiàn)基線分離且峰形尖銳、對(duì)稱。因此,試驗(yàn)選擇ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱進(jìn)行分離。

2.1.2 流動(dòng)相

在相同梯度洗脫條件下試驗(yàn)對(duì)比了分別以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)體系時(shí)4種異噻唑啉酮類化合物的分離效果, 結(jié)果表明, 甲醇-水體系的分離效果更好,質(zhì)譜響應(yīng)更高。為了增加正離子的電離程度,改善峰形,可在甲醇-水體系中加入甲酸或甲酸銨,因此試驗(yàn)又對(duì)比了甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液體系和甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨溶液體系對(duì)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果顯示:在流動(dòng)相體系中加入甲酸后目標(biāo)物的響應(yīng)降低,峰形未得到明顯改善;而加入甲酸銨后,可有效降低基線背景,但響應(yīng)同樣有所降低。為了得到更高的方法靈敏度,試驗(yàn)選擇甲醇-水體系為流動(dòng)相。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 提取溶劑

4種異噻唑啉酮類化合物都是極性化合物,易溶于水以及多種有機(jī)溶劑。選取了空白白菜基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),分別考察了以水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)4種異噻唑啉酮類化合物的提取效果,低濃度水平下(添加CMIT、MIT、BIT質(zhì)量濃度為5.0 μg·kg-1,OIT質(zhì)量濃度為0.25 μg·kg-1)4種異噻唑啉酮類化合物的回收率結(jié)果見圖2。

圖2 低濃度水平下提取溶劑對(duì)4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響

結(jié)果表明:在低濃度水平下,采用乙酸乙酯提取時(shí)目標(biāo)物回收效果較差;采用水、甲醇、乙腈、丙酮提取時(shí)目標(biāo)物的回收率均能達(dá)到70.0%以上?？紤]到隨著加標(biāo)濃度水平的增大,以水和甲醇提取時(shí)OIT的回收率降低,且丙酮毒性較大,試驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 固相萃取條件

蔬菜提取液中除含有大量葉綠素、葉黃素等多種色素外,還含有糖類、有機(jī)酸等雜質(zhì),基質(zhì)成分十分復(fù)雜,會(huì)抑制化合物的離子化率,不利于質(zhì)譜檢測(cè)分析,故選擇對(duì)極性化合物有很好保留效果的HLB固相萃取小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。為了盡可能將親水親脂雜質(zhì)均淋洗下來,需要在淋洗液中加入一定比例的有機(jī)溶劑,但有機(jī)相比例過大會(huì)將目標(biāo)物一起淋洗下來,因此試驗(yàn)首先對(duì)淋洗液的有機(jī)相含量進(jìn)行考察,分別以體積分?jǐn)?shù)為1%,5%,10%,15%,20%,30%的甲醇溶液為淋洗液,考察了其對(duì)4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 淋洗液中甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響

結(jié)果表明,10%甲醇溶液具有很好的淋洗效果,且淋洗流出液中未檢測(cè)到目標(biāo)物,故試驗(yàn)選擇10%甲醇溶液作為淋洗液。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了甲醇和乙腈兩種不同極性的洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇和乙腈對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果基本一致,考慮到甲醇沸點(diǎn)低于乙腈,便于后續(xù)氮吹濃縮,試驗(yàn)選擇甲醇作為洗脫溶劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指除被測(cè)物以外樣本的特征,其能夠影響被測(cè)物的檢測(cè)及測(cè)定結(jié)果,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)(ME)=(基質(zhì)溶液中目標(biāo)物的峰面積/純?nèi)芤褐心繕?biāo)物的峰面積)×100%,ME<80%視為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng),80%120%視為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。試驗(yàn)選擇了白菜、豇豆、番茄和韭菜4種蔬菜基質(zhì)樣品,在CMIT、MIT、BIT質(zhì)量濃度為50.0 μg·L-1,OIT質(zhì)量濃度為2.5 μg·L-1的情況下,對(duì)4種異噻唑啉酮類化合物進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià),結(jié)果如圖4所示。

圖4 4種異噻唑啉酮類化合物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由圖4可知,CMIT、MIT、BIT、OIT在4種蔬菜基質(zhì)中均表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng),其中韭菜對(duì)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)整體更強(qiáng),在相同蔬菜基質(zhì)中BIT的基質(zhì)抑制效應(yīng)相對(duì)較大。因此,試驗(yàn)采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來繪制工作曲線,以消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 工作曲線、檢出限和測(cè)定下限

分別使用白菜、豇豆、番茄和韭菜4種蔬菜空白基質(zhì)溶液配制CMIT、MIT、BIT的質(zhì)量濃度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,600.0 μg·L-1,OIT質(zhì)量濃度為0.25,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,在優(yōu)化的儀器工作條件下分析,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制工作曲線。結(jié)果表明,4種異噻唑啉酮類化合物的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,其線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限

分別采用3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(3S/N),10倍信噪比確定方法的測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

在空白蔬菜基質(zhì)溶液中加入低、中、高3種濃度水平的4種異噻唑啉酮類化合物,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3可知,4種異噻唑啉酮類化合物在不同蔬菜基質(zhì)中的回收率為68.8%～81.3%,測(cè)定值的RSD為2.6%～8.9%,滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求。

2.6 樣品分析

采用試驗(yàn)方法對(duì)市售的20種蔬菜進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在一組韭菜樣品中檢出BIT,檢出量為2.3 μg·kg-1,其余樣品中均未檢出目標(biāo)物。

本工作提出了一種快速測(cè)定蔬菜中4種異噻唑啉酮類化合物含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。以乙腈為提取溶劑,經(jīng)過HLB固相萃取小柱凈化,采用基質(zhì)匹配法定量,在優(yōu)化的儀器工作條件下,能準(zhǔn)確測(cè)定蔬菜中殘留的4種異噻唑啉酮類化合物。該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,回收率、精密度均滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求,適用于高通量的樣品檢測(cè)。