黨文慶 何 敏 上官明軍 詹海杰 曹 亮 李 俊 任克良 張元慶

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,太谷 030801)

在肉兔生產(chǎn)中,開發(fā)新型、健康和綠色的添加劑能改善其生長發(fā)育和機體健康,從而起到替代抗生素的作用。植物性添加劑、酸化劑以及酶制劑作為促生長劑的潛在替代品,在促進動物生長和改善動物健康方面發(fā)揮著重要作用。中草藥作為天然性植物添加劑,具有無害、制備簡單、價格低廉以及低副作用等優(yōu)點[1]。馬齒莧是一種重要的藥食同源植物,具有清熱利濕、解毒消腫、消炎、止渴和利尿的作用,臨床上廣泛應用于胃腸道疾病(腸炎、腹瀉及痢疾等)的防治;此外,其嫩莖葉可作蔬菜,味酸,也是很好的飼料。同時,馬齒莧含有多種次生代謝產(chǎn)物,包括多糖、生物堿、黃酮類、萜類和有機酸等[2-3],具有抗炎抑菌[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]及調(diào)節(jié)血糖和血脂[7]等生物學功能。研究表明,飼糧中添加3%馬齒莧干粉可顯著提高肉雞生長性能并改善腸道菌群[8-9];馬齒莧發(fā)酵物可降低雛雞白痢發(fā)病率與死亡率[10];馬齒莧多糖能提高仔豬的生長性能并降低腹瀉率[11]。檸檬酸能通過降低胃腸道pH,參與機體三羧酸循環(huán),抑制有害菌繁殖,提高機體免疫力和抗氧化能力等方式促進畜禽生長發(fā)育[12]。葡萄糖氧化酶具有降低胃腸道pH、促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、抑制腸道有害菌繁殖和降低應激損傷等生物學功能,能夠促進畜禽生長性能的提高,減少腹瀉,提高成活率和抗氧化能力[13]。本課題組前期研究表明,飼糧中添加1%檸檬酸可提高伊拉斷奶肉兔生長性能,降低死亡率和腹瀉率,提高粗蛋白質(zhì)的表觀消化率[14],并提高盲腸微生物群落多樣性[15];飼糧中添加1%檸檬酸+200 mg/kg葡萄糖氧化酶+114 mg/kg過氧化氫酶可提高肉兔生長性能,降低腹瀉率[16]。本研究在前期試驗結果的基礎上,通過探討飼糧中添加馬齒莧以及馬齒莧與檸檬酸、葡萄糖氧化酶復合物對肉兔生長性能、屠宰性能以及免疫和抗氧化功能的影響,旨在為家兔替抗添加劑的研發(fā)和應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

馬齒莧的營養(yǎng)成分為:干物質(zhì)96.90%,粗蛋白質(zhì)17.20%,粗脂肪2.00%,粗灰分18.48%,中性洗滌纖維50.25%,酸性洗滌纖維32.20%,木質(zhì)素6.10%,鈣1.83%,磷0.56%,淀粉6.50%,單糖0.20%,賴氨酸0.69%,蛋氨酸0.26%,亞油酸0.37%,亞麻油酸0.08%,不飽和脂肪酸0.73%,總脂肪酸1.57%。檸檬酸為食品級一水檸檬酸。葡萄糖氧化酶活性≥2 000 IU/g,水分≤12%。試驗兔為35日齡斷奶伊拉肉兔。

1.2 試驗設計和肉兔飼養(yǎng)管理

試驗選取健康的35日齡斷奶伊拉商品肉兔200只(公母各占1/2),按照體重和性別隨機分為4組,每組50個重復,每個重復1只兔。對照組飼喂基礎飼糧,試驗1組飼喂在基礎飼糧中添加3%馬齒莧替換等量麩皮的飼糧,試驗2組和試驗3組分別飼喂在試驗1組飼糧基礎上添加1%檸檬酸和1%檸檬酸+200 mg/kg葡萄糖氧化酶的飼糧。預試期7 d,正試期35 d。飼養(yǎng)試驗在山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所肉兔試驗場開展,兔舍為半開放式,采用機械通風;試驗兔每天早晚各飼喂1次,自由飲水。

1.3 試驗飼糧

對飼糧中的原料進行常規(guī)營養(yǎng)成分測定后,參考《肉兔營養(yǎng)需要量》(NY/T 4049—2021)[17]配制飼糧,飼糧為直徑為5 mm的顆粒飼料。各營養(yǎng)成分含量采用FOSS 2500近紅外光譜掃描儀測定,飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能

正試期第1天和第36天清晨對試驗兔進行空腹稱重記為初始體重(IBW)和終末體重(FBW),試驗期間記錄每只肉兔的采食量,用于計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。此外,每日對兔群的腹瀉和死亡情況進行記錄,計算腹瀉頻率和死亡率,計算公式為:

腹瀉頻率(%)=100×∑(腹瀉兔只數(shù)×腹瀉天數(shù))/(試驗兔只數(shù)×試驗天數(shù));死亡率(%)=100×死亡兔只數(shù)/試驗兔只數(shù)。

1.4.2 屠宰性能

試驗結束后,每組選取8只與該組平均體重相近的肉兔進行屠宰并記錄宰前活體重。肉兔的屠宰和半凈膛胴體重、全凈膛胴體重和內(nèi)臟器官相對重量的計算參照劉公言等[19]的方法進行,計算公式為:

半凈膛屠宰率(%)=100×半凈膛胴體重(kg)/宰前活體重(kg);全凈膛屠宰率(%)=100×全凈膛胴體重(kg)/宰前活體重(kg);內(nèi)臟器官相對重量(g/kg)=內(nèi)臟器官重量(g)/宰前活體重(kg)。

1.4.3 免疫功能

采集每只屠宰試驗兔血液各5 mL,靜置30 min后,3 000 r/min離心15 min,收集血清于EP管中于-20 ℃保存,用于測定血清免疫指標,包括血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、免疫球蛋白G(IgG)、白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-6(IL-6)含量。血清免疫指標均采用微孔板法,按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒使用說明進行測定,其標準品線性回歸與預期含量決定系數(shù)(R2)≥0.99。

此外,對每只屠宰試驗兔的胸腺、脾臟及圓小囊進行稱重以計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及圓小囊指數(shù),計算公式為:

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量(g)/宰前活體重(kg)。

1.4.4 肝臟抗氧化指標

采集每只屠宰試驗兔肝臟組織各2 g左右放入凍存管后,立即放入液氮冷凍30 min,然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存。準確稱取肝臟組織重量,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液(PBS),剪碎組織,冰水浴制備勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清液進行肝臟超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量的測定。另準確稱取肝臟組織重量,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶4的比例加入4倍體積的生理鹽水或者PBS,冰水浴條件下機械勻漿,然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清液進行肝臟總抗氧化能力(T-AOC)的測定。肝臟抗氧化指標均采用微孔板法,使用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定,T-AOC標準品線性回歸與預期值的R2≥0.99。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析,并采用Duncan氏法進行多重比較,死亡率和腹瀉頻率采用卡方檢驗。除死亡率和腹瀉頻率外,試驗結果數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,0.05

2 結果與分析

2.1 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔生長性能的影響

由表2可知,飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔終末體重、平均日增重、平均日采食量、料重比和死亡率有顯著或極顯著影響(P<0.05或P<0.01),有降低腹瀉頻率的趨勢(P=0.092)。其中,與對照組相比,試驗2組肉兔終末體重極顯著提高(P<0.01),平均日增重和平均日采食量顯著提高(P<0.05),死亡率顯著降低(P<0.05);試驗3組肉兔終末體重顯著提高(P<0.05),料重比極顯著降低(P<0.01),死亡率顯著降低(P<0.05)。試驗3組肉兔料重比極顯著低于試驗1組(P<0.01),顯著低于試驗2組(P<0.05);試驗3組平均日采食量極顯著低于試驗1組和試驗2組(P<0.01)。

表2 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔生長性能的影響

2.2 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔屠宰性能的影響

由表3可知,飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔半凈膛屠宰率和全凈膛屠宰率有極顯著影響(P<0.01)。其中,3個試驗組肉兔半凈膛屠宰率顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01),試驗1組和試驗2組全凈膛屠宰率極顯著高于對照組(P<0.01);各試驗組間各屠宰性能指標差異均不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔屠宰性能的影響

2.3 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔免疫功能的影響

由表4可知,飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔胸腺指數(shù)以及血清促炎因子和免疫球蛋白含量有顯著或極顯著影響(P<0.05或P<0.01)。其中,與對照組相比,試驗1組和試驗2組肉兔血清IL-1β含量顯著降低(P<0.05),試驗2組和試驗3組血清IL-6含量顯著降低(P<0.05),3個試驗組血清IgG含量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)。試驗3組肉兔胸腺指數(shù)顯著高于試驗1組(P<0.05)。各組間肉兔脾臟指數(shù)和圓小囊指數(shù)以及血清TNF-α和IL-4含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔免疫功能的影響

2.4 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔肝臟抗氧化指標的影響

由表5可知,飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔肝臟抗氧化指標均無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧中復合添加馬齒莧、檸檬酸和葡萄糖氧化酶對肉兔肝臟抗氧化指標的影響

3 討 論

目前,馬齒莧在家禽生產(chǎn)應用中的研究較多,其能提高肉雞的生長性能[8],當飼糧中添加2%或3%時可顯著提高肉雞平均日增重進而降低料重比[9]。馬齒莧還可提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能[20],當飼糧中添加2%時能顯著降低蛋雞末重,顯著提高蛋重,飼料效率也有所提高[21]。在改善畜禽機體健康方面,飼糧中添加3%馬齒莧干粉可替代抗生素土霉素,顯著提高斷奶仔豬平均日增重和降低腹瀉率[22-23];發(fā)酵馬齒莧還可降低肉雞白痢發(fā)病率與死亡率[10]。本研究中,飼糧中單獨添加3%馬齒莧干粉(試驗1組)使肉兔的生長性能和健康狀況有所改善但未達到顯著水平,而復合添加3%馬齒莧+1%檸檬酸(試驗2組)或3%馬齒莧+1%檸檬酸+200 mg/kg葡萄糖氧化酶(試驗3組)可顯著提高肉兔生長性能,降低死亡率和腹瀉頻率。這說明當馬齒莧與檸檬酸或與檸檬酸和葡萄糖氧化酶復合添加時,改善肉兔生長性能和健康狀況的效果要顯著大于單獨添加馬齒莧時的效果。研究表明,馬齒莧提取物能改變?nèi)怆u盲腸細菌群落而不改變其pH[24]。因此,試驗2組和試驗3組肉兔飼糧中添加檸檬酸和葡萄糖氧化酶均能通過降低肉兔腸道內(nèi)pH、抑制有害菌的增殖以及促進有益菌的繁殖[13,25],從而顯著改善肉兔生長性能和健康狀況,其具體機制還有待進一步驗證。此外,試驗3組肉兔通過極顯著降低其平均日采食量而使其料重比顯著低于試驗2組,這與葡萄糖氧化酶能顯著提高畜禽飼料轉化效率[26]相符。肉兔的屠宰性能與生長性能密切相關,試驗2組和試驗3組肉兔終末體重顯著高于對照組,使得屠宰后肉兔的半凈膛屠宰率和全凈膛屠宰率高于對照組;不過,3個試驗組間肉兔屠宰性能無顯著差異,這與飼糧中添加1%檸檬酸[14]和1%檸檬酸+200 mg/kg葡萄糖氧化酶+114 mg/kg過氧化氫酶[16]不影響肉兔屠宰性能的結論相一致。

馬齒莧含有α-生育酚、維生素C、β-胡蘿卜素和黃酮等抗氧化物質(zhì),其葉子中含有的維生素C、β-胡蘿卜素含量最高,其次是花和莖[27],且自然干燥的馬齒莧抗氧化活性成分含量可能較低[28]。這些抗氧化物質(zhì)能中和機體內(nèi)自由基、抑制氧化應激和保護羥自由基[29],防止活性氧(ROS)過多造成機體損傷并誘發(fā)各種疾病[30]。本研究中,馬齒莧及其復合添加物雖未顯著影響肉兔肝臟的抗氧化指標,但使肉兔肝臟中SOD活性高于對照組,3%馬齒莧+1%檸檬酸+200 mg/kg葡萄糖氧化酶還使肝臟T-AOC高于對照組。這與飼糧中添加1%檸檬酸不影響肉兔血清SOD活性和T-AOC[14],以及與飼糧中添加1%馬齒莧干粉未能影響43日齡肉仔雞肝臟SOD和GSH-Px活性[31]的結果相一致。此外,馬齒莧藥理活性和營養(yǎng)功能的發(fā)揮受其產(chǎn)地、采收時間及活性物質(zhì)提取方式的影響,如:苗期抗氧化活性最高,隨著生長期增加而降低,成熟期最低,且多酚和總黃酮含量與抗氧化活性相關性最高[32]。本研究中,馬齒莧及其復合添加物未顯著影響肉兔肝臟抗氧化指標的原因可能與試驗使用的馬齒莧樣品中抗氧化物質(zhì)含量低以及復合添加物的劑量等有關,這還需要進一步驗證。

馬齒莧能提高動物機體免疫力,在飼糧中添加量為3%時能顯著提高烏雞血清中IgG含量[33],降低肝細胞癌小鼠肝臟和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量[34]。相似地,與對照組相比,本研究在飼糧中添加馬齒莧可使肉兔血清IL-1β含量顯著降低,血清IgG含量顯著升高。白細胞介素家族的免疫細胞因子在免疫調(diào)節(jié),介導T細胞與B細胞活化、增殖與分化及炎癥過程中發(fā)揮著重要作用。IgG是體液免疫中的主要球蛋白,其分泌過程需要T細胞的輔助,且白細胞介素-1(IL-1)可促進IgG的分泌[35-36],這與試驗組肉兔血清中IgG和IL-1β含量的變化規(guī)律相符。同時,與對照組相比,試驗2組和試驗3組肉兔血清IL-6含量顯著降低,這說明飼糧中添加檸檬酸和葡萄糖氧化酶均能降低肉兔血清IL-6含量,這與Krauze等[37]和Liu等[38]的研究結果一致。此外,與試驗1組相比,試驗3組肉兔胸腺指數(shù)顯著提高。免疫器官指數(shù)高低與免疫力高低密切相關,而胸腺作為肉兔的中樞免疫器官,其發(fā)育情況可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。因此,筆者推測試驗3組飼糧中添加檸檬酸和葡萄糖氧化酶后可能通過促進胸腺發(fā)育顯著降低肉兔機體的炎癥反應,以及通過提高血清免疫球蛋白的分泌量來提高肉兔機體的免疫力。

4 結 論

飼糧中復合添加3%馬齒莧、1%檸檬酸和200 mg/kg葡萄糖氧化酶能夠在不影響肉兔抗氧化功能的情況下,通過提高機體的免疫力,降低死亡率,減少腹瀉頻率,從而提高其生長性能、屠宰性能和改善健康狀況。