謝秀蘭 徐 菲

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

有機酸化劑是由1種或者多種有機酸組成的一類酸化劑[1],具有抗菌、增加適口性和改善免疫功能等多種生物學(xué)作用,是天然的綠色無污染飼料添加劑[2]。有機酸化劑在飼料中的應(yīng)用由來已久[3]。我國《飼料添加劑品種目錄》中允許使用的有機酸化劑包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富馬酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸等11種。近年來,隨著人們對環(huán)境保護和食品安全的日益關(guān)注,以及我國飼料全面“禁抗”政策的實施,綠色、安全飼料添加劑的開發(fā)和應(yīng)用越來越受重視[4-5],有機酸化劑作為一種理想的抗生素替代品,在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛[6]。有機酸化劑總的來說可分為單一有機酸化劑和復(fù)合有機酸化劑兩大類,已有研究表明多種有機酸復(fù)合使用具有一定的增益效果[7-8]。

有機酸化劑在使用過程中,其種類、濃度、添加水平都會直接影響應(yīng)用效果[9]。準確測定復(fù)合有機酸化劑中的有機酸種類和含量有利于生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制,有助于高效利用有機酸,同時可以為有機酸化劑的質(zhì)量安全監(jiān)管提供有效技術(shù)支撐。目前,有機酸含量的測定方法主要有氣相色譜法[10]、液相色譜法[11-13]、離子色譜法[14-19]、毛細管電泳法[20-22]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[23-25]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[26-27]等。然而,目前尚沒有全面地同時分析《飼料添加劑品種目錄》中11種有機酸的研究報道。

基于離子排斥色譜原理的離子色譜法,其分離包括Donnan排斥、空間排斥和吸附作用等多種分離機理,具有樣品前處理簡單、分離分析干擾少、線性范圍寬、準確度高、重現(xiàn)性好等特點[28],是分析低分子質(zhì)量有機酸的一種有效方法。因此,本試驗采用電導(dǎo)抑制-離子色譜法,通過優(yōu)化流速、柱溫、淋洗液等色譜條件,開發(fā)可以同步測定有機酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富馬酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸等11種有機酸含量的分析方法,以期有效應(yīng)用于有機酸化劑的生產(chǎn)質(zhì)量控制、科學(xué)使用和質(zhì)量安全監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

離子色譜分析儀(940 Professional IC Vario,瑞士萬通中國有限公司),配備自動進樣器(858 Professional Sample Processor)、有機酸柱(250 mm×7.8 mm,9 μm)、有機酸抑制器和電導(dǎo)檢測器。超純水制備儀(Milli-Q Advantage A10,德國默克密理博公司)。超聲波清洗器(KQ-600型,昆山市超聲儀器有限公司)。分析天平[XS105DU,梅特勒托利多科技(中國)有限 公司]。

1.2 試劑與樣品

甲酸(純度≥98%)、乙酸(純度≥99.9%)、丙酸(純度≥99.5%)、丁酸(純度≥99.5%),購自上海麥克林生化科技有限公司;乳酸(純度90.1%)購自德國Dr.Ehrenstorfe公司;D-酒石酸(純度≥98%)、富馬酸(純度99%)購自上海源葉生物科技有限公司;苯甲酸(純度≥99.0%)、山梨酸(純度≥99.0%)購自北京索萊寶科技有限公司;檸檬酸(純度≥98.0%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;DL-蘋果酸(純度≥99.0%)購自上海默克化工技術(shù)公司;丙酮、乙腈均為色譜純,購自德國Fisher公司;試驗用水為經(jīng)Mili-Q純化的一級水(>18.2 MΩ)。

1.3 色譜條件

色譜條件的優(yōu)化:采用單因素試驗設(shè)計,分別比較不同流速(0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL/min)對泵壓、分離度、峰面積和保留時間的影響,不同柱溫(25、30、35、40和45 ℃)對11種有機酸分離度的影響,淋洗液中不同硫酸濃度(0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L)對11種有機酸的分離效果,淋洗液中不同丙酮添加水平(2%、5%、10%、16%和20%)對11種有機酸的分離效果,丙酮和乙腈2種有機改進劑的添加比例對11種有機酸的分離效果。

優(yōu)化后的色譜條件如下。色譜柱:有機酸柱(Metrosep Organic Acids 250/7.8,250 mm×7.8 mm,9 μm);淋洗液:按照體積比計,0.5 mmol/L硫酸水溶液∶丙酮∶乙腈=84∶6∶10;流速:0.50 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測器:電導(dǎo)抑制檢測器;抑制液:100 mmol/L氯化鋰;進樣量:20 μL;定量方法:外標法定量。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取11種有機酸各1.0 g,分別用超純水或乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL的標準貯備液,標準貯備液置于4 ℃冰箱中保存。分別移取一定體積的上述11種有機酸的標準貯備液,用淋洗液稀釋配制成混合標準溶液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 非包被類酸化劑樣品前處理

稱取適量樣品于100 mL容量瓶中,加入80 mL淋洗液,超聲提取30 min,待冷卻至室溫后,加入淋洗液定容至100 mL。如有不溶物,3 214×g離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜。

1.5.2 脂肪包被類酸化劑樣品前處理

稱量適量樣品于250 mL錐形燒瓶內(nèi),加入50 mL石油醚,50 ℃超聲10 min,加入50 mL超純水,充分搖動直至樣品完全溶解。轉(zhuǎn)移溶液至分離漏斗中分液萃取,收集下層溶液,3 214×g離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜。

1.5.3 含乳酸的酸化劑樣品前處理

稱量適量樣品于50 mL錐形燒瓶內(nèi),加入5 mL 10 mol/L的氫氧化鈉溶液,90 ℃水浴90 min,加入5 mL 10 mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH,待冷卻至室溫后,加入淋洗液定容至100 mL。如有不溶物,3 214×g離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用萬通MagIC Net 3.2色譜數(shù)據(jù)處理軟件,采用外標法進行有機酸定量分析。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗采用11種有機酸含量分別為1 000 mg/L的混合標準溶液,以淋洗液0.5 mmol/L硫酸水溶液∶丙酮=80∶20(按照體積比計)、流速0.50 mL/min、柱溫30 ℃為初始條件考察了流速、柱溫以及淋洗液中硫酸濃度、有機改進劑種類和添加比例等條件對有機酸的分離情況。

2.1.1 流速的優(yōu)化

比較不同流速(0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL/min)對泵壓、分離度、峰面積和保留時間的影響(圖1)。隨著流速升高,峰面積逐漸降低,泵壓明顯升高(由2.08 MPa升高至6.36 MPa),平均保留時間由70 min縮減至24 min。流速從0.2 mL/min提高到0.3 mL/min時,11種有機酸分離度變化不明顯,但流速繼續(xù)提高時,11種有機酸分離度變化明顯。綜合考慮泵壓、峰面積、保留時間和分離度等因素,最終選擇0.5 mL/min的流速進行后續(xù)試驗。

1.檸檬酸;2.酒石酸;3.蘋果酸;4.富馬酸;5.乳酸;6.甲酸;7.乙酸;8.丙酸;9.丁酸;10.山梨酸;11.苯甲酸。圖2同。

2.1.2 柱溫的優(yōu)化

比較不同柱溫(25、30、35、40和45 ℃)對11種有機酸分離度的影響。結(jié)果顯示,在考察的溫度范圍內(nèi),柱溫對11種有機酸的保留時間均有影響,但是對分離度均無影響。綜合考慮試驗的可操作性,最后選擇常用的30 ℃柱溫進行后續(xù)試驗。

2.1.3 淋洗液中硫酸濃度的優(yōu)化

比較淋洗液中不同硫酸濃度(0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L)對11種有機酸的分離效果。結(jié)果顯示,隨著硫酸濃度增加,基線明顯升高(由27.4 μs/cm增加至225.7 μs/cm),有機酸響應(yīng)值(峰面積)明顯降低。在本試驗考察的范圍內(nèi),不同硫酸濃度對分離度影響不明顯,當硫酸濃度為0.2 mmol/L時,甲酸、乙酸和丙酸的分離效果較好,但是此時檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和富馬酸的分離效果較差,并且富馬酸的峰形較差;當硫酸濃度增至1.0 mmol/L時,檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和富馬酸的分離效果較好,但是甲酸和乙酸基本重合。綜合考慮峰面積和分離度等因素,選取硫酸濃度為0.5 mmol/L的淋洗液進行后續(xù)試驗。

2.1.4 淋洗液中有機改進劑種類及用量的優(yōu)化

比較淋洗液中不同丙酮添加水平(2%、5%、10%、16%和20%)對11種有機酸的分離情況(圖2)。隨著丙酮添加水平增加,基線略有下降,分析時間由95 min縮減至30 min(其中以山梨酸和苯甲酸的保留時間變化最為明顯),甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的分離度逐步降低,但檸檬酸和酒石酸、富馬酸與乳酸的分離度逐漸增加。綜合考慮11種有機酸的分離度,最后選擇丙酮添加水平為16%進行后續(xù)試驗。

圖2 淋洗液丙酮添加水平對11種有機酸分離度的影響

比較丙酮和乙腈2種有機改進劑的添加比例對11種有機酸分離效果的影響。結(jié)果顯示,隨著乙腈替代丙酮比例的增加,檸檬酸和酒石酸分離度略有下降,但甲酸和乙酸的分離度有所增加。選擇添加10%的乙腈和6%的丙酮作為有機改進劑時,各有機酸的分離度均大于1.2,分離效果最好。

上述結(jié)果表明,當淋洗液中硫酸濃度為0.5 mmol/L,丙酮和乙腈添加比例分別為6%和10%,柱溫為30 ℃,流速為0.5 mL/min時,11種有機酸分離效果最優(yōu)。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

配制11種有機酸的系列混合標準溶液,重復(fù)測定3次,建立標準曲線,在各自的線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999 4。以3倍信噪比作為檢出限,10倍信噪比作為定量限,11種有機酸的線性回歸方程、R2、線性范圍、檢出限和定量限見表1。

表1 11種有機酸線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.3 11種有機酸的回收率和精密度

向有機酸化劑樣本稀釋液中分別添加3個不同濃度的11種有機酸的標準溶液,每個添加水平重復(fù)測定6次。由表2可知,各有機酸回收率在92.9%～112.2%,相對標準偏差在0.2%～2.4%,方法準確度和精密度良好。

表2 11種有機酸的回收率和精密度

表3 5個實際樣本中有機酸含量測定

2.4 實際樣品分析

為了進一步驗證方法的適用性,采用本試驗建立的分析方法對5個典型的實際有機酸樣品進行了檢測。結(jié)果表明,本試驗建立的分析方法可以用于測定多種類、高含量差的有機酸化劑樣品,方法的可適用性強。

3 討 論

3.1 流速的選擇

離子色譜分離時,流速影響泵壓、分離度、峰面積、峰寬和保留時間[19]。流速升高,泵壓增加,流速過大會造成色譜柱壓力接近其耐壓上限而影響使用壽命[28];流速降低,分離度、峰面積、峰寬和保留時間增加,甚至可能造成峰形變形和拖尾[29]。綜合考慮泵壓、分析效率和分離情況等因素,本試驗最后選擇流速為0.5 mL/min。

3.2 柱溫的選擇

柱溫升高會減小流動相黏度,增加組分傳質(zhì)速度和效率,避免慢傳質(zhì)過程中的譜帶展寬效應(yīng),改善色譜峰形[30]。本試驗條件下,柱溫對11種有機酸保留時間均有不同程度的影響,但是可能是受淋洗液中有機溶劑影響,柱溫對各有機酸峰形和分離度影響均不明顯。綜合考慮試驗的可操作性,最終選擇常選用的30 ℃為柱溫。

3.3 淋洗液的選擇

隨著淋洗液中硫酸濃度的增加,有機酸離解被抑制,受Donnan排斥的影響逐漸減弱,其他作用影響相對增強,會影響有機酸的分離情況[28]。本試驗條件下,隨著硫酸濃度增加,Donnan排斥影響逐漸減弱,受到空間排斥作用影響的檸檬酸、富馬酸、酒石酸和蘋果酸等多元酸分離度有所提升,但以Donnan排斥為主要分離作用的甲酸、乙酸和丙酸分離度則逐漸降低。有機溶劑的重要作用在于調(diào)節(jié)離子交換過程中的選擇性,改變分離柱對分析物的保留特性[31]。淋洗液中有機溶劑的加入可以降低淋洗液的極性,縮短分析時間,改變出峰順序、峰形和分離度[32]。乙腈相對于丙酮,具有洗脫能力強、靈敏度高和柱壓小等優(yōu)勢[31-33]。綜合考慮各有機酸的分離度,本試驗最終選擇的淋洗液為0.5 mmol/L硫酸水溶液∶丙酮∶乙腈=84∶6∶10。

3.4 有機酸的出峰順序

有機酸柱采用表面鍵合磺酸基團的交聯(lián)聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物為填料,其裸露的磺酸氫質(zhì)子是產(chǎn)生分離選擇性的主要官能團,基于該官能團產(chǎn)生的溶質(zhì)和固定相之間的Donnan排斥作用為主要保留機理[34],主要決定了有機酸的出峰順序,表現(xiàn)為酸度系數(shù)(pKa)值低的有機酸出峰在前(表4)。除Donnan排斥作用以外,受空間排斥作用、氫鍵作用和π-π電子作用的影響,對應(yīng)出現(xiàn)了檸檬酸出峰早于酒石酸、乳酸出峰早于甲酸、富馬酸出峰晚于蘋果酸和山梨酸、苯甲酸的保留時間最長等現(xiàn)象。本試驗條件下,色譜優(yōu)化過程中有機酸的出峰先后順序均未發(fā)生變化。

表4 11種有機酸的保留時間

4 結(jié) 論

① 采用有機酸柱離子色譜結(jié)合電導(dǎo)抑制檢測器對有機酸化劑中的11種有機酸組分進行了有效分離。通過單因素優(yōu)化試驗得到的最佳分離條件如下:0.5 mmol/L硫酸水溶液∶丙酮∶乙腈=84∶6∶10為淋洗液等度洗脫,柱溫為30 ℃,流速為0.5 mL/min。在該條件下,11種有機酸組分在40 min內(nèi)可以得到良好分離。

② 方法學(xué)考察結(jié)果顯示,11種有機酸組分在上述色譜條件下,其含量與對應(yīng)峰面積在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,R2大于0.999 4,檢出限為0.01～0.11 mg/L,加標回收率為92.9%～112.2%,相對標準偏差為0.2%～2.4%。

③ 本試驗建立的方法首次實現(xiàn)了《飼料添加劑品種目錄》中11種有機酸的同步分析,具有前處理簡單、線性范圍寬、適用范圍廣等優(yōu)點,可為規(guī)范有機酸化劑生產(chǎn)使用、加強產(chǎn)品的質(zhì)控與監(jiān)管提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。